הכנת הגרגירים של גושוקאנג (GSK) בגרגרים בVivo ובניסויים חוץ-גופית

פרוטוקול זה מתקנים את הכנת פתרון עבודה של גרגירי למחקרים in vivo, כמו גם הכנת סרום המכיל גרגירה לניסויים במבחנה. אחד היתרונות של טכניקה זו הוא כי השיטה יכולה לחזור בקלות בשל העלות הנמוכה של החומרים ואת בעלי החיים שאתה יוצר עבור הניסויים. התחל על ידי הוספת שמונה, 16, ו 24 גרם של Gushukang, או GSK, גרגירי צינורות בודדים 50 מיליליטר.

מוסיפים 48 מיליליטר מים לכל צינור, ומנערים את הצינורות כדי להמיס לחלוטין את הגרגריים. לאחר מכן, מניחים 1.6 טבליות של סידן פחמתי בתוספת ויטמין D3 לתוך צינור אחר 50 מיליליטר, ולהמיס את הטבליות ב 48 מיליליטר של מלוחים עם רועד. עבור ניהול תוך-אורגזמי של הפתרונות, תחילה בעדינות אך באופן ידני לרסן בן חודש, נקבה, C57 שחור 6 עכבר במשך שתיים עד שלוש דקות.

כאשר העכבר נרגע, לטעון מחט 40 מילימטר, מספר 12 gavage עם 0.24 מיליליטר של פתרון עבודה אחד של גרגירי GSK, ולמקום את מחט gavage לתוך העכבר דרך צד אחד של הפה שלה עד עמידות המחט מורגש, המציין את המחט הגיעה לקיבה. להזריק את כל נפח פתרון העבודה לתוך החיה. לאחר מכן, לסגת מחט gavage, ולהחזיר את העכבר לכלוב שלה בעוד העכברים האחרים מנוהלים GSK לפני הזרקת 0.24 מיליליטר של סידן פחמתי וויטמין D3 פתרון לתוך כל עכבר באותו אופן.

עבור GSK המכיל אוסף סרום דם, לאחר אספקת הריכוזים המתאימים של GSK לחולדה על ידי gavage כפי שהודגם רק, לאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן שעה לאחר הממשל האחרון GSK גרגיר. הפוך עור בטן חתך צנית, ולחשוף את הבטן לתחתית בית החזה. השתמש בנייר טישו כדי להסיר את רקמת החיבור של דרך הבטן כדי לחשוף את הכלי בבירור, ולהשתמש מזרק 10 מיליליטר מצויד מחט 22-מד כדי למשוך דם מן האבי העורקים.

מעבירים את הדם לצינור סטרילי של 15 מיליליטר, ומ מניחים את הצינור זקוף בטמפרטורת החדר במשך 30 עד 60 דקות. כאשר הדם קרוש, צנטריפוגה הצינור כדי להפריד את הסרום, ולהעביר את כל הנסיוב עד שישה חולדות לתוך צינור חדש 50 מיליליטר. לנער את הצינור כדי לערבב את sera לפני השבתת רכיבי הסרום באמבט מים 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

לאחר מכן, לסנן את הסרום דרך 0.22 מיקרומטר-נקבובי בגודל פוליאתרסולפון מסנן מזרק לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שנה. עבור in vitro osteoclastogenesis, לדלל את שלושת המינונים של סרום המכיל GSK ביחס של אחד עד ארבעה עם המדיום המינימלי של הנשר בתוספת L-גלוטמין, ריבונוקלוזידים, ו deoxyribonucleosides. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של כל דילול לכל באר של תרבות מקרופאג' מח עצם בצלחת של 96 בארות.

לאחר מכן, ליזום דור osteoclast על ידי מגרה כל גם עם גורם מגרה מושבת מקרופאג מפעיל קולטן עבור גורם גרעיני-קאפה B ligand. עבור in vitro osteoblastogenesis, להוסיף שני מיליליטר של סרום מדולל GSK המכיל לכל באר של 24 היטב צלחת עצם תרבות תאי גזע mesenchymal. תוצאות סריקת טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת מצביעות על כך שעכברים אובריקטומיים מדגימים אובדן עצם משמעותי בהשוואה לעכברי בקרה מלוחים.

התערבות עם 90 ימים של טיפול גרנול GSK מגדילה מאוד את צפיפות מח העצם, במיוחד במינון בינוני GSK-מטופלים בעלי חיים. טיפול גרנול GSK גם מוביל מספר עצם trabecular מוגברת, נפח העצם על נפח כולל, ועובי עצם trabecular, אבל הפרדת עצם-trabecular ירד. פוספטאז חומצה עמיד טרטראט, או TRAP, כתמים מגלה עלייה במספר osteoclasts בעכברים ovariectomized בהשוואה לבעלי חיים שליטה, בעוד טיפולים גרנול GSK להקטין את ההידול OSTEOCLAST חיובי TRAP בהשוואה לבעלי חיים ovariectomized.

סרום המכיל גרגרי GSK גם מקטין את מספר osteoclasts חיובי TRAP לעומת סרום שנאסף מבעלי חיים שליטה. החדירה המוצלחת של המחט לתוך בית המשפט בבטן היא קריטית כדי להבטיח כי דם נפח גבוה מספיק נקצר מכל חולדה. ביצוע מוצלח של שיטה זו צריך להקצת הצטברות של 15 עד 20 מילימטרים של דם, מספיק חומר כדי לשמש לניסויים במבחנה.