זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המולקולרית והתאית, כגון זיהוי אירועי רקומברציה הומולוגיים בתאי גזע עובריים של העכבר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מדויקת, אמינה, בשימוש נרחב. לכן, שיטה זו יכולה לספק תובנה לזיהוי אירועי קומבינציה הומולוגיים בתא גזע עוברי עכבר.

זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות, כגון תא מהונדס גנטית או בעלי חיים. בדרך כלל, אדם חדש בשיטה זו יתקשה כי זה לוקח הרבה זמן וכרוך בצעדים מרובים. עבור כל gDNA, לערבב 30 microliters של 10 x חיץ עבור DRA אחד, שלושה microliters של DRA אחד ו 10 מיקרוגרם של gDNAs לכל מדגם.

מוסיפים מים עד שהנפח הסופי הוא 30 מיקרוליטר, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה כדי לעכל את gDNAs. הכינו ג'ל אלקטרופורזה של 1% עם אתידיום ברומיד. לטעון את הדגימות שנרכשו בעבר יחד עם סולם KB אחד על הג'ל, ולהפעיל אותו ב 30 עד 40 וולט לילה.

למחרת, השרו את הג'ל במגש המכיל תווי חומצה הידרוכלורית ניוטון 0.2. השתמש שייקר לנער את המגש בעדינות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את הג'ל למגש המכיל תותב דנ"א.

לנער אותו בעדינות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מעבירים את הג'ל למגש המכיל פתרון נטרול דנ"א. ולנער אותו בעדינות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

באמצעות מערכת העברה מהירה כלפי מטה, להעביר את DNAs מן הג'ל לממברנה. לאחר מכן, להרכיב את blotter טרבל מחסנית סופג כפי שמתואר בהוראות שסופקו על ידי היצרן. לאחר מכן, להוציא את הממברנה ולשטוף אותו עם שני X מלוחים נתרן ציטראט במשך דקה אחת.

לספוג את הנוזל עם רקמות, ולאחר מכן להשתמש crosslinker UV לחצות לקשר את ה-DNA עם הממברנה. כדי להתחיל לתייג את בדיקות הדנ"א ברדיואקטיביות, הוסיפו את DNAAs בדיקה denatured החום לצינור המכיל את מוכן ללכת DNA תיוג חרוזים. פיפטה למעלה ולמטה לערבב.

ותוסיף חמישה מיקרוליטרים של דלוקסיציטודין טריפוספט שכותרתו רדיואקטיבית. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לטהר את הבדיקות שכותרתו באמצעות G 50 מיקרו עמודות על פי ההוראות שסופקו על ידי היצרן.

השתמש מונה תיון כדי למדוד את הרדיואקטיביות. כדי להתחיל הכלאה של הממברנות עם הבדיקות שכותרתו, מניחים את הממברנה לתוך צינור ההכלאה. הוסף את פתרון ההכלאה המעורב לפני ההכלאה.

מניחים את הצינור לתוך תנור הכלאה ולתת היברידית מראש להמשיך ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, להסיר את הצינור מהתנור ויוצקים את פתרון ההכלאה מראש לתוך צינור 50 מיליליטר. מוסיפים את הגשוש denatured, ומערבבים בעדינות.

כדי להסיר את הבדיקות שאינן היברידיות, מניחים את הממברנה במגש המכיל ציטראט נתרן מלוח X אחד עם 0.1% SDS ומנערים בעדינות ב 55 עד 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, לעטוף את הממברנה עם ניילון נצמד ולתקן אותו בקלטת החשיפה. בחדר חשוך, חשוף את הממברנה לשני גיליונות של סרט רנטגן.

לפתח את הסרט כדי לדמיין את התוצאות. לקבוע אם שיבוט ES המתאים הוא אחד הרצוי עם היעד של recombination או לא, על פי הגדלים של רצועות DNA שזוהו על ידי הבדיקות. במחקר זה, כתמים דרומיים PCR מנוצל כדי לזהות אירועי HR המתרחשים בתאי ES העכבר עבור הדור של NM שני מודלים עכבר חלופי גנטי באמצעות תאי ES מבוססי HR מתווך טכנולוגיית מיקוד.

מכיוון ש- DNAs הגנומיים נחתכים לרסיסים רבים באורכים שונים, הם מציגים מצב כמו מריחה על ג'ל הדנ"א. זה מרמז על עיכול מלא של DNAs הגנומי. כצעד אחרון של כתמים דרומיים, האותות של רדיואקטיביות שכותרתה בדיקה הכלאה עם שבר DNA היעד מוצגים על הסרט.

הופעתן של להקות צפויות משקפת את התרחשותם של אירועי משאבי אנוש בשכפול ES. על פי predesign במחקר, שיבוטים ES עם אלל מוטציה יש שתי להקות בגודל נפרד. בעוד שיבוטים מסוג פראי ES יש רק רצועה אחת, מה שמרמז על שיבוטים ES הרצוי הם הטרוזיגים.

בעקבות תגובת PCR, ניתן לנתח את מוצרי PCR על ג'ל ה- DNA. אם רצועת NPCR ספציפית בגודל הנכון נצפית, הדבר מרמז על התרחשותם של אירועי HR אשר ניתן לאשר עוד יותר על ידי רצף רצועת PCR זו. המשמעות של טכניקה זו התרחבה לטיפול בזיהוי מוטציה נקודתית מכיוון שהקרן זהה.

בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להיות סבלני וזהיר. בעקבות הליך זה, שיטה אחרת כמו microinjection של תא ES לתוך blastocysts יכול להתבצע על מנת לענות על שאלה נוספת כמו שם היווצרות של בעלי חיים כימריים. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקר בתחום הביולוגיה המולקולרית והתאית לחקור את תפקודו של גן מסוים או את התוצאה של גן שעבר מוטציה בעכברים או מעבר לו.

אל תשכח כי עבודה עם תווית רדיואקטיביות P32 DCTB יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון מיגון עם לוח הגנה צריך תמיד לקחת בעת ביצוע הליך זה.