שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום איתות התאים כגון החשיבות של תחומי חלבון שונים באינטראקציה של אנזים קולטן והפעלה אנזימטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בדיקה במקביל של אינטראקציות אנזים קולטן ואת ההשלכות התפקודיות של אינטראקציה זו על פעילות האנזים. עבור כל צלחת, השתמש ב- 10 מיליליטר של DMEM בתוספת 10%FBS ו- 1%פניצילין וסטרפטומיצין.
יום לפני ההטמקה, זרע כליה עוברית אנושית 293-T תאים לתוך 12 10 ס"מ צלחות באמצעות hemocytometer לספור את התאים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% C02. לאחר התאים הם 80 עד 90%confluent, להשתמש סוכן transfection מבוסס השומנים כדי לשנות חמש מהצלחות.
בצע את ההטרדה בהתאם להוראות היצרן לתאי הדבקה בצלחות של 10 ס"מ. לאחר מכן תטמיעו סט שני זהה של חמש צלחות יחד עם צלחת נוספת אחת המשמשת כבקרה לא תדרוך למדידת כמות החלבון המובעת לפני האימונופרציפציה. אין לארוב את הלוחות המרובים באינקובטור של תרבות רקמות ב-37 מעלות צלזיוס ב-5%CO2 למשך 48 שעות.
השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבחון את התאים לביטוי GFP ולהבטיח שההעתקה התרחשה בהצלחה. יש לערבב 15 מיקרוליטרים של נתרן אורטובנדט 100 מילימולרית עם 50 מיקרוליטרים של 30% מי חמצן להכנת תערובת פרוונדאט טרייה. כדי לפזר את הגרסאות המתויגות של PD-1, הסר את המדיה מהתאים המפוסלת PD-1-GFP.
הוסף 10 מיליליטר של DMEM רגיל 10 microliters של pervanadate לכל צלחת. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים PBS קר כקרח באמצעות חמישה מיליליטר של PBS לכל לשטוף.
בעת ביצוע immunoprecipitation, כל השלבים צריכים להתבצע על קרח או בארבע מעלות צלזיוס. להשלים את חיץ תמיסת עם מעכבי פרוטאז על ידי המסת טבליה אחת של המעכבים ב 10 מיליליטר של חיץ. כמו כן להוסיף מילימולר אחד של נתרן אורתוובנה למאגר שישמש על PD-1-GFP-transffected צלחות.
הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר תזה קר כקרח לתאים, הקפד להוסיף את מאגר התזה המכיל את אורתובנדט נתרן רק את הצלחות המכילות תאים מנוצי PD-1-GFP. השתמש מגרד תא כדי להסיר באופן מיידי ולאסוף את התאים מן הלוחות. מעבירים את הליטים לצינורות קרים באורך 1.5 מיליליטר ומסובבים אותם בכבידה של פי 0.005 וב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
כדי לאסוף את העל-טבעי שלאחר הגרעינים מהליזטים, סובב אותם כלפי מטה בכבידה של פי 10,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מעבירים את העל-טבעיים לצינורות חדשים וזורקים את גלולת הכדור. אחסן את העל-טבעיים עבור הסט השני של שש צלחות על קרח לניתוח WCL מאוחר יותר.
כדי להתחיל להכין חבילות נגד GFP, לנער בעדינות את הבקבוק המכיל את חרוזים לפני הפתיחה כדי למנוע התיישבות. הסר 40 microliters של גם נגד GFP חרוזים מן תרחיף לכל תנאי. צנטריפוגה בכבידה של פי 500 וארבע מעלות צלזיוס לשלוש דקות.
הסר את supernatant לשטוף את חרוזים, הקפד למזער את המגע בין פיפטה וחרוזים כדי למנוע אובדן. תן שימוש חוזר ב-80 מיקרוליטרים של מאגר תיזה לדגימה. מוסיפים את חרוזים שטופים ישירות לתא lysate מן PD-1-GFP-ביטוי תאים של הסט הראשון של ארבע צלחות.
סובבו במהירות של פי 0.005 למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להפוך את החלבונים המתויגים ב-GFP לחיסון. לשטוף את חרוזים שלוש פעמים באמצעות מיליליטר אחד של חיץ תזה קרה שאינו מכיל orthovanadate עבור כל לשטוף. ואז צנטריפוגה ב 2, 500 פעמים כבידה במשך 10 שניות.
מחלקים את ה-lysate של SHP2 הפעיל מהסט הראשון של הלוחות לשלוש מנות שוות ומוסיפים חלק לכל אחד משלושת הצינורות המכילים את חרוזי PD-1-GFP השטופים. הוסף 1/3 מנפח ה-lysate מהתאים שאינם נטראנספקטיים לצינור השני של גם פרעוזי PD-1-GFP מסוג פראי. השלך את 2/3 הנותרים.
הדגירה את חרוזים במשך ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין ב 0.005 פעמים כוח הכבידה. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים פעמיים באמצעות מיליליטר אחד של חיץ תזה קרה עבור כל לשטוף. הוסף 80 microliters של מאגר תזה לכל מדגם, להבטיח כי נפח הכולל בכל צינור הוא 100 microliters.
בעזרת קצה פיפטה חתוך, פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב. ואז להעביר 50 microliters מכל צינור לשני, טרי, 1.5 צינורות מיליליטר. לשטוף את חרוזים פעם אחת עם חיץ לשטוף פוספטזה.
ואז להסיר את העל טבעי לחלוטין. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של חיץ בדיקה אל חרוזים ודגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות תחת תסיסה עדינה. כאשר החיץ הופך צהוב, לסיים את התגובה על ידי הוספת 50 microliters של פתרון טוחן אחד של נתרן הידרוקסיד.
צנטריפוגה ב 2, 500 פעמים כבידה במשך 10 שניות. לאחר מכן, מעבירים את העל-טבעי לשתי בארות של חצי אזור בצלחת של 96 בארות. קרא את הספיגים ב 405 ננומטר ולהביע את התוצאות כמו צפיפות אופטית יחסית על גרסת סוג הבר שליטה של PD-1-GFP.
ראשית לסובב את חרוזים ב 2, 000 פעמים כבידה וארבע מעלות צלזיוס במשך 30 שניות ולהסיר את העל טבעי. מוסיפים 20 מיקרוליטרים של חיץ לאמלי פעמיים ומרתיחים ב-95 מעלות במשך חמש דקות. באמצעות ערכת BCA, למדוד את ריכוז החלבון של פקדי הקלט.
העבר 30 מיקרוליטרים של המדגם המדולל ביותר לצינור חדש. השתמש במאגר תזה כדי לדלל את שאר פקדי הקלט לאותו ריכוז כמו המדגם המדולל ביותר. לאחר מכן העבר 30 מיקרוליטרים של כל אחד מפקדי הקלט המדוללים לצינור חדש.
מוסיפים כמויות שוות של מאגר לאמלי פעמיים לlysates ומרתיחים אותם 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, לסובב את חרוזים ב 2, 000 פעמים כבידה וארבע מעלות צלזיוס במשך 30 שניות לפני ביצוע ניתוח כתם מערבי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, משולבת שיתוף immunoprecipitation והערכה פעילות אנזימטית מפותחת להערכה מקבילה של אינטראקציות אנזים קולטן והפעלה.
שלא במפתיע, SHP2 לא הצליחה להיקשר ל-PD-1 כאשר ITSM עבר מוטציה. למרבה הפלא, הגרסה המוטנטית של איגוד SHP2 מעוכב ITIM רק במידה מוגבלת. עם זאת, בדיקת הפעילות SHP2-phosphatase מגלה כי ITIM ו- ITSM חיוניים באותה מידה לפעילות האנזימטית.
פעולה זו חושפת מודל הפעלה דו-שלבי שבו SHP2 מקופל לקונפורמציה אוטומטית בתנאי מנוחה. עם הפעלת PD-1, SHP2 מגויס ל- ITSM הזרחני. עם זאת, ITIM חייב גם להיות זרחן לפרוש SHP2 לתוך הקונפורמציה הפעילה שלה.
לאחר התפתחותה, טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום איתות התאים לחקור את הפונקציה של תחומי חלבון באינטראקציות קולטן-אנזים.
