שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על מחזור התא ודינמיקה אוכלוסיית תאי גזע קו נבט ב C.elegans. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא אינה דורשת מהונדסים, היא תואמת לכתמים immunofluorescent, ו ניתן לשנות אותה כדי לחקור תאים בתנאים רבים ושונים. התרגשתי מאוד כשראיתי לראשונה את השיטה הזו בשימוש במעבדת שדה.
למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך מחזור התא C.elegans, זה יכול להיות מיושם גם על שאלות רחבות יותר על הזדקנות, תזונה, או גנוטיפים משתנים. בדרך כלל מעבדות חדשות לשיטה זו עשויות להיאבק עם idiodisprepation הראשונית או כתם המטוקסילין C.elegans. התחל באמצעות טכניקה סטרילית להוסיף 200 microliters של 10 מילימולרים EdU ב 100 מיליליטר של מאגר M9 ואת התוספים המתאימים ארבעה מיליליטר של תרבות MG 1693 E.coli טרי.
ביצוע idiodiscious דורש איזון עדין בין EdU ותוספת תימדין. כמו כמות התימידין חייב להיות מספיק עבור קולי E לגדול היטב, בעוד כמות EdU חייב להיות מספיק עבור המגן החזק מפני החלקה. לאחר לא יותר מ 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 200 סל"ד, להשתמש בטכניקה סטרילית כדי לפצל את התרבות בין שניים לארבעה סטרילי 50 צינורות חרוט מיליליטר עבור צנטריפוגה.
תן שימוש חוזר בפלטין ארבעה מיליליטר של חיץ M9 טרי ולהשתמש באותה פיפטה כדי להחיל על 8 טיפות של פתרון E Coli MG1693 שכותרתו E Coli למרכז טמפרטורת החדר בודדים 60 מיליליטר M9 צלחות פטרי שומר. כדי להאכיל את החיידקים המסווים EdU לנמטודות, השתמש PBS טרי לשטוף את C.Elegans מצלחת בינונית צמיחה nematode לתוך צינור 1.5 מיליליטר ולאפשר לבעלי החיים להתיישב לזמן קצר על ידי כוח הכבידה. לשטוף את בעלי החיים פעם עד פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS ולהשתמש פיפטה פסטור זכוכית להעביר את nematodes למרכז מדשאת EdU בטיפה זעירה של PBS.
המתן כמה דקות עד שהנוזל ייקלט ויפגר את התרבות לפחות 30 דקות ב-20 מעלות צלזיוס על פי פרוטוקול הניסוי. בסוף הדגירה, השתמש בשני מיליליטר של PBS כדי לשטוף את התולעים מצלחת התרבות של EdU לתוך צלחת ניתוח זכוכית. לאחר ניתוח וקבוע של גונדות נמטודה כפי שתואר לעיל, לשטוף צינור זכוכית בורוסיליקט מיליליטר קטן אחד פיפטה פסטור זכוכית ארוכה עם PBS בתוספת 0.1% tween 20 ולהשתמש פיפטה להעביר את המצעים קבועים לצינור בכמות קטנה של Tween PBS.
לאסוף את gonads על ידי צנטריפוגה ולהשתמש ארוך, שלף את פיפטה מרעה זכוכית כדי להסיר על טבעי ככל האפשר מבלי להפריע גלולת גונד. לגילוי EdU, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של קוקטייל EdU לחץ על הנקניקיות וכסו את הצינור בסרט מעבדה במשך 30 עד 60 דקות דגירה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את השוטפים פעם אחת עם 100 microLiters של חיץ שטיפה תגובה, וארבע פעמים עם מיליליטר אחד של Tween PBS.
לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה נגד עמעום בתוספת DAPI למדגם. בזמן שהמדיום מתיישב מעל הקנאדות, מניחים משטח גדול של 2.5% על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית סטנדרטית. ואז לשטח עם שקופית שנייה.
לאחר מכן, השתמש פיפטה פסטור זכוכית ארוכה ולשמור את כל הנוזלים ואת gonads בקצה הצר של פיפטה כדי למזער את אובדן מדגם בעת העברת gonads ל כרית. באמצעות עפעף מודבק קיסם, להפיץ את הישנים על כרית אגרוז ולהסיר את כל חלקיקי אבק. ואז לאט לאט להוריד כיסוי זכוכית מלבני להחליק על הבלוטות, דואג להימנע בועות אוויר, והסרת כל פתרון עודף עם רקמת מעבדה.
ספירת תאים בשלושה ממדים דורשת תרגול מסוים. שימוש בתוסף מונה התאים של פיג'י ובקובץ Script כמו מסמן את התאים כדי להסיר כפילויות מסייע להפוך את הספירות לבלתי ניתנות לשחזור. לאחר מתן אפשרות לתלוש הכיסוי להתיישב בן לילה, השתמש בתוסף מונה התאים ובפיג'י כדי לספור באופן ידני כל גרעין, תוך תיוג כל גרעין בודד על פי נוכחות או היעדר תווי תא Phosphohistone שלושה EdU או pregenetor.
אות EdU שותף לוקליזציה עם אות DAPI. בגרעין מסוים, אות ה-EdU מכסה את כל הכרומוזומים, ואילו בגרעין אחר, אות ה-EdU מתמקם ל-1-2 פאנקטה בהירה, ככל הנראה על כרומוזום ה-X, המשכפל בשלב מאוחר של שלב ה-S. אות EdU מתווית מוצלחת של 30 דקות לוקליזציה לכמחצית הגרעינים באזור הקדם-גניטור.
בעוד הטכניקה פועלת באופן עקבי בבעלי חיים צעירים מסוג בר, חלק ניכר של הרמפרודיטים בני 5 ימים לא מצליח לתייג בדופק EdU של 30 דקות. משך G2 ניתן להעריכה על ידי ניתוח אחוז הגרעינים בשלב M כי הם חיוביים EdU לאורך קורס הזמן, המאפשר חישוב של משך החציון והמקסימום של G2. משך G2 ו- G1 ניתן מוערך מאחוז כל גרעיני אזור pregenetor כי הם חיוביים EdU, המאפשר חישוב של משך הזמן המרבי של השלבים המשולבים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש באותה אצווה של מנות EdU כדי למזער את השונות הבין-ניסיונית.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו כתמים בנוגדנים נוספים או לענות על שאלות נוספות על מחזור התא, גורל התא או מסלולי איתות. אל תשכח כי עבודה עם אנלוגים גרעין parafermeldahyde יכול להיות מסוכן, כי אמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות ניט רול, תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
