שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום השחפת כגון מהו התפקיד של תגובות חיסוניות אדפטיביות ואת הפתוגנזה של מחלה רב-תכליתית זו. היתרון העיקרי של שיטת בסיס זו של חומצת גרעין הוא שניתן למדוד הן עומסים חיידקיים והן רמות ביטוי גנים מאותו אדם. כדי להתחיל בהליך זה, תרבות M.marinum על לוח 7H10 כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.
מעבירים 10 מיליליטר של מדיום 7H9 המכיל העשרת ADC, פוליסורבט 80 ו גליצרול לבקבוקון של תרבות התא. לאחר מכן, השתמש בלולאת חיסון מיקרוליטר אחת סטרילית כדי להעביר באופן בלתי יעיל לולאה אחת של מסת חיידקי M.marinum לתוך הבקבוק. השאירו את המכסה רופף או השתמשו בכובע מסנן כדי לאפשר החלפת גז ותרבות מספקת ב-29 מעלות צלזיוס בחושך מבלי לרעוד במשך שלושה עד ארבעה ימים עד שה-OD600 יגיע לכ-0.7.
לדלל ולהמשיך culturing החיידקים כמתואר בטקסט. כדי להתחיל להכין את הפתרון החיידקי לזיהום, להעביר מיליליטר אחד של התרבות לתוך צינור טרי. צנטריפוגה ב-10,000 גרם לשלוש דקות.
הסר את supernatant ו resuspend גלולה במיליליטר אחד של PBS סטרילי. באמצעות PBS סטרילי עם 0.3 מיליגרם למיליליטר של פנול אדום כמעקב, לדלל את ההשעיה כדי להגיע לריכוז החיידק הרצוי. לאחר מכן, השתמש מזרק מיליליטר אחד כדי למשוך לאט את ההשעיה דרך מחט 27 מד שלוש פעמים.
בצע שלב זה ממש לפני השימוש עבור כל aliquot. ראשית, פיפטה טיפה חמישה מיקרוליטר של פתרון חיידקי מדולל על פיסת סרט פרפין. לאחר מכן, משוך את טיפת לתוך מחט אינסולין 30 מד.
השתמש בדג בן חמישה עד שמונה חודשים לניסוי זה כאשר אחד מהם הוא דג בר והשני הוא דג מוטנט סמרטוטים. מקם את הצד הגחוני של הדגים האלה בחתך של חתיכת פלסטיק מוקצף לח. להזריק את מחט האינסולין בין סנפירי האגן בזווית של 45 מעלות.
שמור את המחט נפתחת כלפי מעלה כדי להבטיח כי הפתח כולו הוא בתוך חלל הבטן. לאחר מכן, לאט להזריק את הפתרון החיידקי. לאחר מכן, להסיר בזהירות את המחט מיד להעביר את הדגים למיכל התאוששות מלא מי מיכל טרי.
קח דגימות מן aliquot חיידקי בשימוש כל 15 דקות על צלחות 7H10. דגירה דגימות אלה ב 29 מעלות צלזיוס במשך חמישה ימים כדי לאמת את מינון הזיהום. בדוק את רווחתם של הדגים באופן קבוע, הקפד המתת דם כל דגים עם תסמיני זיהום על ידי דגירה אותם במים עם יותר מ 0.02% של 3-aminobenzoic חומצה אתיל אסתר.
לאחר המתת חום הדג, הכנס סיכה אחורית לקרני הענף. הכנס סיכה שנייה דרך הזנב כדי לתקל את הדגים על הרציף. באמצעות אזמל, לפתוח את כל חלל הבטן.
לאחר מכן, השתמש בכף קטנה ובפינצטה חדה כדי לאסוף את האיברים הפנימיים המתחילים בלב ועובדים לאורך עמוד השדרה לכיוון הזנב כדי לנתק את כל האיברים הפנימיים בבלוק אחד. השתמש פינצטה כדי לנתק את רשת המעיים מן cloaca ולהעביר את האיברים לתוך צינור הומוגניזציה 1.5 מיליליטר המכיל חצי תריסר 2.8 מילימטר חבילות קרמיקה. מיד מניחים את הצינור על קרח יבש כדי להקפיא את הדגימה.
לאחסן את המדגם ב 80 מעלות צלזיוס שלילי עד מוכן הומוגניזציה. לאחר חילוץ הדנ"א וה-RNA, למדוד את העומסים mycobacterial על ידי PCR כמותי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, דגי זברה בוגרים נגועים M.marinum על ידי זריקה תוך-חוץ-לידתית.
מינון זיהום גבוה נראה להוביל למחלה מתקדמת שבה העומס mycobacterial ממשיך להגדיל עד העומס הממוצע מגיע על חמישה מיליון חיידקים בסופו של דבר להרוג את הדגים. מינון נמוך לעומת זאת מוביל להתפתחות ספקטרום מחלות דומה לזה שנראה בשחפת אנושית עם זיהומים מתקדמים, סמויים, מחדש ועיקור. במקרה זה, העומס ממשיך לעלות במשך ארבעה שבועות שלאחריה המחלה מגיעה למצב יציב ברוב הדגים.
נתונים אלה מגלים כי המספר הראשוני של mycobacteria המשמש להדביק את הדג הוא דטרמיננטה קריטית לתוצאות הזיהום. דגי זברה מוטנטים נראים לא מסוגלים להגביל במידה מספקת את הצמיחה של mycobacteria המוביל עומסים חיידקיים גבוהים יותר ותחלואה מוגברת. זה ממחיש בבירור את החשיבות של חסינות אדפטיבית בשליטה על זיהום mycobacterial.
רמות interleukin-4 גבוהות באופן משמעותי בקבוצת סוג הבר חושף כי התגובה הסתגלות נדרשת עבור הקדמה יעילה של interleukin-4, אבל לוותר על כניסתה של גמא אינטרפרון לאחר זיהום mycobacterial. פרוטוקול זה מאפשר איסוף של דנ"א ו-RNA מאותה דגימה המאפשר לשלב את הנטל המיקובקטריאלי של המדגם עם נתוני ביטוי גנים של המארח והחיידקים. טכניקה זו יכולה להיות משולבת עם הממשל של תרופות או מועמדים לחיסון כדי להעריך את השפעתם על עומסים mycobacterial ותגובות חיסוניות.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקוב אחר ההנחיות המקומיות לבטיחות אישית וסילוק פסולת בעת עבודה עם פתוגן ברמה biosafety 2. טכניקה זו מאפשרת ללמוד שחפת פעילה וגם סמויה עם מיקובקטריה רדומה בזברהפיש שהיא לא יונקת אתית במודל vivo.
