Name: evaluating the role of mitochondrial function in cancer-related fatigue
Uploaded: 2018-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue at JoVE.com

מחקר זה נתמך באופן מלא על ידי חלוקה של מגזר המחקר של במכון הלאומי סיעוד למחקר של NIH, בת'סדה, מרילנד.

המחקר הנוכחי (NCT00852111) אושרה על-ידי המוסדיים סקירה לוח (IRB) של במכון הלאומי של בריאות (NIH), בת'סדה, מרילנד. המשתתפים שהשתתפו במחקר זה היו גברים euthymic, 18 שנה ומעלה, אשר אובחנו עם סרטן הערמונית-גרורתי עם או בלי prostatectomy מוקדמת, היו אמורים לקבל טיפול קרינתי חיצוני קרן (EBRT). המשתתפים הפוטנציאליים שוחררנו אם היה להם מחלה פרוגרסיבית אשר עלול לגרום עייפות משמעותית, היה מחלה פסיכיאטרית מתוך חמש השנים האחרונות, היו שלא תוקנו בלוטת התריס או אנמיה, או היה גידול ממאיר השני. יחידים אשר השתמשו בכדורי שינה, סטרואידים או סוכנים אנטי דלקתיות לא סטרואידיות היו גם לא נכלל. דגימות דם בקרה בריאים התקבלו לרפואה NIH המחלקה של עירוי דם מתורמים בריאים תחת פרוטוקול שאושרו על-ידי IRB (NCT00001846). כל המשתתפים הם גייסו מגנוסון קלינית במרכז המחקר ב- NIH. ההסכמות מידיעה בכתב חתום התקבלו לפני ההשתתפות במחקר.
1. מיטוכונדריאלי פונקציה מדידה הכנה (יום 1 של הניסוי)
<ol><li>מימה חיישן מחסנית (ראה טבלה של חומרים; משך משוער: 5 דקות).<ol>
<li>הסר את חיישן מחסנית של החבילה. להוסיף 200 μL Calibrant פתרון לבאר כל צלחת השירות ולאחר מכן למלא כל חפיר עם פתרון Calibrant μL 400.</li>
		<li>לחזור חיישן צלחת הצלחת השירות, עכשיו שיש פתרון Calibrant בו. מימה את המחסנית חממה 37 ° C-CO2 בן לילה. הערה: חיישן מחסנית צריך להיות להתייבש מינימום של 4 שעות, לכל היותר 72 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת הדוגמא קלינית (יום 2 של הניסוי)
<ol><li>למדוד עייפות בעזרת 13-פריט פונקציונאלי הערכה של כרונית מחלות הטיפול - עייפות (FACIT-F)2,23,24 -בסיסית (לפני EBRT חניכה), נקודת האמצע והשלמה של EBRT ולאחר שנה אחת פוסט-EBRT.<ol>
<li>להשתמש 0 - מידה 4 עבור כל פריט תגובה, כאשר 0 מייצג "". בכלל לא- ו 4 מציין כי המשיב מתייחס המשפט המתאים "תודה רבה" הציונים הכלליים צריך לנוע בין 16-53, עם ציונים נמוכים המשקף בעוצמה גבוהה עייפות.</li>
		<li>להגדיר עייפות כמו ציון FACIT-F נמוך יותר 43, עם ציון FACIT-F של ≥43 המציין היעדר או עייפות לא-משמעותיים קלינית2. הערה: ציון FACIT-F של 43 הטוב ביותר מחלק ציונים עייפות של חולי סרטן, את האוכלוסייה הכללית2.</li>
		<li>כוללים את הפריטים הבאים 13 בסולם עייפות FACIT: 1) אני מרגיש עייף; 2). אני מרגישה חלשה בכל מקום; 3) אני מרגישה תשושה ("נשטף החוצה"); 4) אני מרגיש עייף; 5) אני מתקשה מתחיל דברים כי אני עייפה; 6) אני מתקשה לסיים דברים כי אני עייפה; 7) יש לי אנרגיה; 8). אני מסוגל לעשות פעילויות הרגיל שלי; 9) אני צריכה לישון במהלך היום; 10). אני עייפה מדי לאכול; 11) אני צריך עזרה עושה פעילויות הרגיל שלי; 12) אני אני מתוסכל בגלל היותו עייף מדי כדי לעשות את הדברים שאני רוצה לעשות; ו 13) אני צריך להגביל את פעילות חברתית כי אני עייפה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבודד PBMC של דגימות דם טרי שנאספו (משך משוער: 1 h).<ol>
<li>לאסוף 8 מ של דם לתוך צינור הכנה תאי תאי (ראה טבלה של חומרים). הערה: דגימות דם צריך להיות מעובד בתוך שעתיים של אוסף. עלולה לסכן את איכות PBMCs אם דגימות דם מעובדים יותר מ 2 h לאחר איסוף הדגימה.</li>
		<li>צנטריפוגה ב g x 1,750 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (18-25 ° C). להעביר את השכבה מעונן צינור חרוטי 15 מ"ל. להוסיף עד 15 מ"ל ל- PBS, היפוך 5 פעמים.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 300 x g במשך 15 דקות ב 4 º C. בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע ללא גלולה מטרידה. מחדש להשעות את צניפה על-ידי הוספת עד 10 מ"ל PBS, היפוך 5 פעמים.</li>
		<li>צנטריפוגה-300 גרם x 10 דקות ב 4 º C. למחוק את הנוזל supernatant והשהה מחדש תאים 1 מ"ל PBS. להעביר את PBMCs צינור microfuge 1.5 mL.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 610 x g במשך 10 דקות. להסיר את תגובת שיקוע ובזהירות resuspend צנפה ב RPMI מלאה-1640 (RPMI-1640 בתוספת 10% FBS, 10 מ מ פניצילין/סטרפטומיצין).</li>
	</ol>
</li>
	<li>מעיל תא לוחות עבור תאים שאינם מחסידי (משך משוער: 30 דקות).<ol>
<li>להכין פתרון דבק תאים ורקמות (ראה טבלה של חומרים) על ידי דילול הפתרון מניות ב- 0.1 M סודיום ביקרבונט pH 8.0. הפתרון עובד צריך להיות μg/cm 3.52 של פני השטח. הערה: פתרון זה מכיל חלבונים polyphenolic מופק גברת ימיים, Mytilus אדאליס. חלבונים אלה הם רכיבי מפתח של הדבק מופרש על ידי גברת לעגן את עצמה משטחים. אנו מוצאים כי התא-טאק עובד הכי טוב עם PBMCs.</li>
		<li>להוסיף 100 μL של הפתרון מדולל דבק מכל קידוח, תקופת דגירה של פחות 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף שלוש פעמים עם די מים ואוויר יבש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. מיטוכונדריאלי פונקציה מדידה
<ol><li>הכנת Assay מדיה (משך משוער: 10 דקות). הערה: המדיה Assay צריך להיות טרי מוכן ביום של הניסוי.<ol>
<li>הוסף-גלוטמין פירובט, גלוקוז לבסיס המדיה (באותו המרכיבים כמו בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco), אך ללא כל סודיום ביקרבונט, גלוקוז, גלוטמין או נתרן פירובט) כדי להפוך assay מדיה. לחמם מדיה 37 מעלות, ואז להתאים את ה-pH ל 7.4. הערה: ריכוזי-גלוטמין פירובט, גלוקוז בדרך כלל זהה ריכוזים בתקשורת הצמיחה רגילה, אך ניתן להתאים בהתאם וזמינותו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>היכונו PBMCs במבחן Mito הלחץ (משך משוער: 2 h).<ol>
<li>צלחת מספיק PBMCs משלב 2 כל טוב להגיע confluency 80-90%. מניסיוננו, 1.5 x 105 תאים/טוב הניבו את התוצאות הכי עקבי. הערה: בארות A ו- H רקע בארות, צריך להכיל רק assay מדיה עם אין תאים. בבארות B ל גרם, אנו ממליצים על ציפוי לפחות 3-6 בארות לאדם החולה מדגם כהתאמה ליניאריים.</li>
		<li>מסובבת צלחות למטה ב g x 200 למשך 2 דקות לאפשר תאים לדבוק בתחתית הבארות. לשטוף את התאים פעם אחת עם התקשורת וזמינותו. שלב זה מסיר סרום, סודיום ביקרבונט מהתקשורת צמיחה. הערה: מניסיוננו, הצעד כביסה בדרך כלל מסירה 20-30% של תאים.</li>
		<li>להוסיף 180 μL Assay מדיה לתוך כל טוב, כולל רקע בארות א' וה' Incubate חממה 37 ° C-CO2 למשך 45-60 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הבדיקה מתח Mito<ol>
<li>לשקם סמים בערכה מתח Mito עם מדיה assay כדלקמן:<ol>
<li>Oligomycin: להוסיף 252 μL assay מדיה לתוך המבחנה כדי ליצור פתרון מניות ב- 50 μM.</li>
			<li>FCCP: להוסיף 288 μL assay מדיה לתוך הבקבוקון כדי ליצור פתרון מניות ב- 50 μM.</li>
			<li>Antimycin A / Rotenone: להוסיף 216 μL של המדיה assay לתוך המבחנה כדי ליצור פתרון מניות ב 25 μM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>מערבולת מחדש סמים כדקה בערך. לדלל לתוך העבודה פתרונות. הערה: ריכוזים של פתרונות עבודה צריך להיות טיטרציה וקבעה מראש לפני הניסוי בהתאם לסוג התא. עבור PBMCs, אנו מוצאים את μM 1 של Oligomycin 1 μM FCCP, 0.5 μM antimycin A / Rotenone פועלות באופן הטוב ביותר.</li>
		<li>Pipette הסמים ליציאת כל במחסנית חיישן ברצף:<ol>
<li>ת: יציאה μL 20 פיפטה של 10 μM Oligomycin, עבור ריכוז סופי כל היטב של 1 μM.</li>
			<li>יציאה b: μL 22 פיפטה של 10 μM FCCP, עבור ריכוז סופי כל היטב של 1 μM.</li>
			<li>C: יציאה μL 25 פיפטה של μM 5 antimycin A / rotenone עבור ריכוז סופי כל היטב של 0.5 μM.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר "בדיקת המאמץ Mito" על כלי שטף חוץ-תאית. בצע כלי שורת, הכנס את מיכל הדיו חיישן. הכלי יבצע באופן אוטומטי חיישן כיול. הוסף תאים בצלחת לאחר כיול חיישן, לבין הכלי יסיים את שאר וזמינותו. דינמיקה חמצן נמדד ב- 530 ננומטר (עירור) / 650nm (פליטת), פרוטון הריכוז נמדדת ב- 470 nm (עירור) / 530 ננומטר (פליטה).</li>
</ol>4. נרמול נתונים פונקציה מיטוכונדריאלי
<ol><li>להכין פתרון תא התפשטות Assay (משך משוער: 5 דקות).<ol>
<li>להוסיף 48 μL חומצת גרעין הכתם (500 x) משתיק קול רקע 240 μL מ"ל 11.7 PBS (2x). חומצת גרעין הכתם הוא צבע DNA מחייב תא-permeant, משתיק קול רקע צבע המסיכה אשר חוסם תאים מתים או תאים עם קרום התא פרוץ שלמות של להיות מוכתם. שילוב לצבוע דנ א מחייב עם משתיק קול על רקע מבטיחה כי תאים חיים רק מוכתמים.</li>
		<li>להוסיף נפח שווה 2 x הפתרון עובד (180 μL) ישירות לתוך המדיום היטב כל לאחר השלמת במבחן הלחץ Mito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה התאים בנוכחות תא התפשטות assay פתרון חממה 37 מעלות צלזיוס במשך 45-60 דק Quantify מספר תאים חיים (פלורסנט) על קורא צלחת-508 nm (עירור) / 527 nm (פליטת), באופן שיטתי נתונים OCR (משך משוער: 10 דקות) . הערה: בנוסף תאים חיים, מספר המשתמשים לבחור גם לנרמל את הנתונים שלהם עם המספר הכולל של תאים, כמות חומצת גרעין, ריכוז חלבון, וכו '.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Related+Fatigue,+Version+2.2015.">Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).</li><li>Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+phenotyping+approaches+lead+to+dissimilar+biologic+profiles+in+men+with+chronic+fatigue+following+radiation+therapy.">Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).</li><li>Feng, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Predictors+of+Fatigue+in+Men+With+Non-Metastatic+Prostate+Cancer+Receiving+External+Beam+Radiation+Therapy.">Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy.</a> Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).</li><li>Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploratory+Investigation+of+Early+Biomarkers+for+Chronic+Fatigue+in+Prostate+Cancer+Patients+Following+Radiation+Therapy.">Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy.</a> Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).</li><li>Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+fatigue+syndrome+and+mitochondrial+dysfunction.">Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2 (1), 1-16 (2009).</li><li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mito-Morphosis:+Mitochondrial+Fusion,+Fission,+and+Cristae+Remodeling+as+Key+Mediators+of+Cellular+Function.">Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function.</a> Annual Review of Physiology. 78 (1), 505-531 (2016).</li><li>Vecchiet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+characterization+of+somatic+parietal+tissues+in+humans+with+chronic+fatigue+syndrome.">Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome.</a> Neuroscience Letters. 208 (2), 117-120 (1996).</li><li>Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+in+pH+handling+by+peripheral+muscle+and+potential+regulation+by+the+autonomic+nervous+system+in+chronic+fatigue+syndrome.">Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome.</a> Journal of Internal Medicine. 267 (4), 394-401 (2010).</li><li>Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TRAIL+in+fatigue+induced+by+repeated+stress+from+radiotherapy.">The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy.</a> Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).</li><li>Karamercan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+peripheral+blood+mononuclear+cells+be+used+as+a+proxy+for+mitochondrial+dysfunction+in+vital+organs+during+hemorrhagic+shock+and+resuscitation.">Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation.</a> Shock. 40 (6), (2013).</li><li>Ijsselmuiden, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+white+blood+cells+and+platelets+amplify+oxidative+stress+in+heart+failure.">Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure.</a> Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).</li><li>Kong, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+mitochondrial+alterations+after+cardiac+surgery+involving+cardiopulmonary+bypass:+Clinical+correlations.">Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations.</a> Shock. 21 (4), 315-319 (2004).</li><li>Straub, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+and+immune+system+prompt+energy+shortage+in+chronic+inflammation+and+ageing.">The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).</li><li>Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetics+of+immune+cells+to+assess+rheumatic+disease+activity+and+efficacy+of+glucocorticoid+treatment.">Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 62 (2), 133-139 (2003).</li><li>Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mitochondrial+and+glycolytic+metabolism+in+human+platelets+and+leukocytes:+Implications+for+their+use+as+bioenergetic+biomarkers.">A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers.</a> Redox Biology. 2, 206-210 (2014).</li><li>Garrabou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Sepsis+on+Mitochondria.">The Effects of Sepsis on Mitochondria.</a> The Journal of Infectious Diseases. 205 (3), 392-400 (2012).</li><li>Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+inflammation+and+tissue+injury.">Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (7), 1126-1167 (2014).</li><li>Adrie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+and+Apoptosis+Peripheral+Blood+Monocytes+in+Severe+Human+Sepsis.">Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (3), 389-395 (2001).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).</li><li>Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+characterization+of+polarized+M1+and+M2+bone+marrow-derived+macrophages+using+real-time+extracellular+flux+analysis.">Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).</li><li>Boutagy, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).</li><li>Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fatigue+and+other+anemia-related+symptoms+with+the+Functional+Assessment+of+Cancer+Therapy+(FACT)+measurement+system.">Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).</li><li>Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+important+differences+were+estimated+for+six+Patient-Reported+Outcomes+Measurement+Information+System-Cancer+scales+in+advanced-stage+cancer+patients.">Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients.</a> Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).</li><li>Kang, J. -. G., Wang, P. -. y., Hwang, P. M., Galluzzi, L., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 542, 209-221 (2014).</li><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).</li><li>Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+determination+of+cell+number+using+the+CyQUANT&#174;+cell+proliferation+assay.">Sensitive determination of cell number using the CyQUANT&#174; cell proliferation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).</li><li>Hartman, M. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+vascular+function+in+type+2+diabetes+mellitus.">Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus.</a> Vascular Medicine. 19 (1), 67-74 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

עייפות אצל חולי סרטן היא מחלה מתישה אינה מוגדרת היטב או מאופיין1. אבחון של עייפות כולו מתבסס על דיווח סובייקטיבי, אין תקן הנוכחי אבחון או טיפול עבור תנאי זה, בעיקר בשל חוסר ההבנה שלו pathobiology2. מנגנוני המוצעת שבבסיס עייפות אצל חולי סרטן, ליקוי בתפקוד מיטוכונדריאלי הו...

עייפות היא מצב נפוץ ומצערת זה יש השפעה שלילית על איכות החיים של חולי סרטן1. מועד זה, סרטן נשאר גרוע מוגדר ועייפות מסתמך רק על דיווח סובייקטיבי על-ידי חולים2. לכן, יש צורך דחוף לזהות ניסוי מעבדה אבחון להתאמה בקלות לאפיין באופן אובייקטיבי עייפות3,בקביעת קליני4.
מנגנונים כבסיס מרובות, כולל תפקוד המיטוכונדריה, הוצעו כדי לגרום לעייפות5. המיטוכונדריה הם organelles תחנת כוח, מתן 95% צרכי האנרגיה התאית באמצעות זרחון חמצוני, ולשחק תפקיד חשוב סידן איתות אפופטוזיס, המערכת החיסונית איתות, ויסות תאיים אחרים איתות האירועים6 . בהתאם לכך, ביואנרגיה מיטוכונדריאלי לקוי, פגמים בייצור אנרגיה עשויים לתרום עייפות. תמיכה השערה זו, מחקרים קודמים מקיימות מוטציות ב- DNA מיטוכונדריאלי בחולים עם תסמונת התשישות הכרונית7. אמנם עדיין לא ברור אם מקור pathophysiological עייפות טמון בתוך מערכת העצבים המרכזית או רקמות היקפיים, כגון שרירי השלד8,9, יש כיום אין שיטה ישירה להעריך במדויק תפקוד לקוי של מיטוכונדריאלי הקשורים עייפות בתאים חיים, respiring.
באמצעות תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) ללמוד פונקציה מיטוכונדריאלי מציע מספר יתרונות. ראשית, PBMCs זמינים בהגדרת קליניים באמצעות דם ורידי רגיל, ניתן לבודד במהירות באמצעות טכניקות מעבדה בסיסית. שנית, איסוף דם הוא פחות פולשניים איסוף לרקמות אחרות כגון ביופסיה של השריר. לפיכך, דגימות דם ניתן לאסוף מן המטופל אותו שוב ושוב לאורך זמן, אשר מקלה על הערכת האורך של השפעות הטיפול. מעניין, פונקציית מיטוכונדריאלי PBMCs הופיע טוב בקורלציה עם כליות מצב מיטוכונדריאלי במודל חיה10. יתר על כן, תא החיסון המיטוכונדריה שימשו כמדד לזיהוי שינויים מערכתית תחת מחלות שונות בתנאים11,12. המיטוכונדריה במחזור תאים חיסוניים הם רגישים לשינויי פונקציות החיסונית במיוחד ואת המערכת החיסונית איתות מולקולות כגון ציטוקינים13,14,15. לדוגמה, זה נצפתה PBMCs של חולים עם מחלות דלקתיות פרקים חריפה התערוכה צריכת חמצן בסיסית גבוהה14. לעומת זאת, צריכת חמצן צומצם ב PBMCs מבודדים מחולים עם התנאים דלקתית מערכתית כולל אלח דם16. תחת תנאים דלקתיים, רדיקלים חופשיים המיוצר על ידי המיטוכונדריה לקוי עשוי נוספת לתרום סטרס חמצוני גבוהות ו דלקת ממושכת17. התפקיד המרכזי של המיטוכונדריה בהפקת אנרגיה, כמו גם כמו סטרס חמצוני מציע השירות פוטנציאל של שימוש ב- function מיטוכונדריאלי כמדד ללמוד עייפות חולי סרטן 13.
מחקרים קודמים בחינת תפקוד מיטוכונדריאלי מנוצל טכניקות הביוכימי, מדידת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי או בידוד של אוכלוסיות תאים מסוים עשוי להיות לא ברצון וישימה בקביעת קליני5, 14,18. בשנים האחרונות, ההתפתחות של מבחני חוץ-תאית השטף איפשר לחוקרים בקלות ולבחון באופן מדויק שינויי קצב צריכת החמצן (OCR) בתגובה זריקות אוטומטיות של מעכבי נשימה19,20 , 21 , 22. עם זאת, רוב המחקרים הללו תוכננו עבור סוגי תאים ספציפיים ולא בפורמט גדול תפוקה גבוהה ניתן החלים בסביבה קלינית. כתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול ממוטבת לבחינת תפקוד מיטוכונדריאלי לשימוש קליני.

<table><tbody><tr><td>CPT Mononuclear Cells Preparation Tube&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>For isolating PBMCs following phlebotomy</td></tr><tr><td>RPMI-1640&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-040</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface</td></tr><tr><td>Seahorse XF Calibrant Solution</td><td>Agilent</td><td>103059-000</td><td>For hydrating cartridges</td></tr><tr><td>XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges)</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td>Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges</td></tr><tr><td>XF base media</td><td>Agilent</td><td>103335-100</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>45% cell culture D-(+)-Glucose solution</td><td>Corning</td><td>25-037-CI</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>25-000-CI</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>L-glutamine solution</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Mito Stress Test Kit</td><td>Agilent</td><td>103010-100</td><td>Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone</td></tr><tr><td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay</td><td>ThermoFisher</td><td>C35011</td><td>For quantification of live cells and data normalization</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Analyzer</td><td>Agilent</td><td>S7802AEA</td><td>For measuring mitochondrial function in live cells</td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate)</td><td>BioTek</td><td>BTCYT5PV</td><td>For quantification of live cells and data normalization</td></tr></tbody></table>

evaluating the role of mitochondrial function in cancer-related fatigue

עייפות היא משותפת, מתישה מצב זה משפיע על חולי סרטן. עד כה, עייפות נשאר גרוע מאופיין עם אבחון לא מבחן אובייקטיבי מודדים את חומרת המצב הזה. כאן נתאר שיטת אופטימיזציה להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי של PBMCs שנאסף חולי סרטן עייף. באמצעות מערכת קומפקטית השטף חוץ-תאית הזרקה רציפים של מעכבי נשימה, נבחנו המצב התפקודי מיטוכונדריאלי PBMC על ידי מדידת נשימה מיטוכונדריאלי הבזליים לקיבולת בדרכי הנשימה, אנרגיה פנוטיפ, המתאר מסלול אנרגיה מועדף להגיב על הלחץ. PBMCs טריים זמינים בהגדרת קליניים באמצעות דם ורידי רגיל. וזמינותו כולו שמתואר פרוטוקול זה יכולה להסתיים תוך פחות מ 4 שעות ללא המעורבות של טכניקות הביוכימי מורכבים. בנוסף, אנו מתארים שיטה לנרמול הדרוש להשגת לשחזור נתונים. השיטות הליך ונורמליזציה פשוטה הציג מאפשרים איסוף הדגימה חוזרות ונשנות מן החולה באותו הדור לשחזור נתונים ניתן להשוואה בין נקודות זמן כדי להעריך את תופעות הטיפול האפשריות.

במבחן הלחץ Mito מסתמך על מדידת קצב צריכת החמצן (OCR) לאחר ההזרקה רציפים של מעכבי נשימה שונים כדי למפות פרופיל מיטוכונדריאלי שלם. מדידות OCR לאחר הזרקת סמים כל יכול לשמש כדי לחשב את הפרמטרים הבאים הקשורים לבריאות מיטוכונדריאלי: OCR הבזליים נמדד לראשונה לפני כל זריקה סמי...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue at JoVE.com

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

המטרה שלנו הייתה לפתח פרוטוקול מעשית להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי המשויך עייפות אצל חולי סרטן. פרוטוקול זה חדשני ממוטב רגיל רק שימוש קליני מעורבים עם דם ורידי ונהלים מעבדה בסיסית.

הערכת תפקידה של פונקציית מיטוכונדריאלי עייפות הקשורים לסרטן

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

evaluating-role-mitochondrial-function-cancer-related

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.1K Views.  National Institutes of Health. המטרה שלנו הייתה לפתח פרוטוקול מעשית להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי המשויך עייפות אצל חולי סרטן. פרוטוקול זה חדשני ממוטב רגיל רק שימוש קליני מעורבים עם דם ורידי ונהלים מעבדה בסיסית.

Video: Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic pathways is tested in many types of tumors. Thus, characterization of cancer cell metabolic setup is inevitable in order to target the correct pathway to improve the overall outcome of patients. Unfortunately, in a majority of cancers, the malignant cells are quite difficult to obtain in higher numbers and the tissue biopsy is required. Leukemia is an exception, where a sufficient number of leukemic cells can be isolated from the bone marrow. Here, we provide a detailed protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and subsequent analysis of their metabolic state using extracellular flux analyzer. Leukemic cells are isolated by the density gradient, which does not affect their viability. The next cultivation step helps them to regenerate, thus the metabolic state measured is the state of cells in optimal conditions. This protocol allows achieving consistent, well-standardized results, which could be used for the personalized therapy.

Here we present a protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and analysis of their metabolic state. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells could help to better characterize the demand of primary cells and could lead up to more personalized medicine.

הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of current interventions to adequately treat fatigue in all patients leaves a need for new treatment options. Despite the therapeutic need and importance of preclinical research in helping identify promising novel treatments, few preclinical assays of fatigue are available. Moreover, the most common preclinical assay used to assess fatigue-like behavior, voluntary wheel running, is not suitable for use with some strains of mice, may not be sensitive to drugs that reduce fatigue, and has relatively low throughput. The current protocol describes a novel, non-voluntary preclinical assay of fatigue-like behavior, the treadmill fatigue test, and provides evidence of its efficacy in detecting fatigue-like behavior in mice treated with a chemotherapy drug known to cause fatigue in humans and fatigue-like behavior in animals. This assay may be a beneficial alternative to wheel running, as fatigue-like behavior and potential interventions can be assessed in a greater number of mice over a shorter time frame, thus permitting faster discovery of new therapeutic options.

Fatigue is a common, undertreated and frequently poorly-understood symptom in many diseases and disorders. New preclinical assays of fatigue may help to improve current understanding and future treatment of fatigue. To that end, the current protocol provides a novel means of measuring fatigue-like behavior in the mouse.

מבחן עייפות הליכון: A Assay פשוט, תפוקה גבוהה של התנהגות העייפות דמוית עבור העכבר

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of ...

Behavior

Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule synthesis. Genetic and functional adaptations of mitochondria to the tumor environment drive proliferative and metastatic potential. The advent of DNA and RNA sequencing removed critical barriers to the evaluation of genetic mediators of tumorigenesis. However, to date, methodological approaches to evaluate tumor mitochondrial function remain elusive and require technical proficiency limiting the feasibility, ultimately diminishing diagnostic and prognostic value in both experimental and clinical settings. Here, we&#160;outline a simple and rapid method to quantify rates of oxidative phosphorylation (OXPHOS) and electron transfer (ET) capacity in freshly excised solid tumor homogenates using high-resolution respirometry. The protocol can be reproducibly applied across species and tumor types as well as adapted to evaluate a diversity of mitochondrial ET pathways. Using this protocol, we demonstrate that mice bearing a luminal B mammary cancer exhibit defective nicotinamide adenine dinucleotide-linked respiration and reliance on succinate to generate adenosine triphosphate via OXPHOS.

We developed a practical protocol and analytical approach to evaluate mitochondrial oxidative phosphorylation and electron transfer capacity in fresh tumor homogenates. This protocol can be easily adapted to survey various mitochondrial functions that contribute to cancer initiation, progression, and treatment response.

קביעה אנליטית של תפקוד מיטוכונדריאלי של הומוגנטים של גידול מוצק מובחר

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי מתאי סרטן הגדלים בתרחיף

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more efforts are still needed to fully understand the link involving alterations in mitochondria and tumorigenesis, as well as to identify tumor-associated mitochondrial phenotypes. For instance, to evaluate the contribution of mitochondria in tumorigenesis and metastasis processes, it is essential to understand the influence of mitochondria from tumor cells in different nuclear environments. For this purpose, one possible approach consists of transferring mitochondria into a different nuclear background to obtain the so-called cybrid cells. In the traditional cybridization techniques, a cell line lacking mtDNA (&#961;0, nuclear donor cell) is repopulated with mitochondria derived from either enucleated cells or platelets. However, the enucleation process requires good cell adhesion to the culture plate, a feature that is partially or completely lost in many cases in invasive cells. In addition, another difficulty found in the traditional methods is achieving complete removal of the endogenous mtDNA from the mitochondrial-recipient cell line to obtain pure nuclear and mitochondrial DNA backgrounds, avoiding the presence of two different mtDNA species in the generated cybrid. In this work, we present a mitochondrial exchange protocol applied to suspension-growing cancer cells based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria. This methodology allows us to overcome the limitations of the traditional approaches, and thus can be used as a tool to expand the comprehension of the mitochondrial role in cancer progression and metastasis.

מחבר זרקור: יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים  

This protocol describes a technique for cybrid generation from suspension-growing cancer cells as a tool to study the role of mitochondria in the tumorigenic process.

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple causes, including autoimmune diseases, diabetes, infections, inherited disorders, and tumors. Assessing mitochondrial function in mouse peripheral nerves can be challenging due to the small sample size, a limited number of mitochondria present in the tissue, and the presence of a myelin sheath. The technique described in this work minimizes these challenges by using a unique permeabilization protocol adapted from one used for muscle fibers, to assess sciatic nerve mitochondrial function instead of isolating the mitochondria from the tissue. By measuring fluorimetric reactive species production with Amplex Red/Peroxidase and comparing different mitochondrial substrates and inhibitors in saponin-permeabilized nerves, it was possible to detect mitochondrial respiratory states, reactive oxygen species (ROS), and the activity of mitochondrial complexes simultaneously. Therefore, the method presented here offers advantages compared to the assessment of mitochondrial function by other techniques.

High-resolution respirometry coupled to fluorescence sensors determines mitochondrial oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) generation. The present protocol describes a technique to assess mitochondrial respiratory rates and ROS production in the permeabilized sciatic nerve.

הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Biochemistry

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

זרחן-31 ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית: כלי למדידת<em&gt; In vivo</em&gt; קיבולת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי של שריר שלד אדם

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Medicine

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and oxidative burst, and create neutrophil extracellular traps (NETs) for microbial clearance. New insights into the metabolic activities of neutrophils challenge the early concept that they primarily rely on glycolysis. Precise measurement of metabolic activities can unfold different metabolic requirements of neutrophils, including the tricarboxylic acid (TCA) cycle (also known as the Krebs cycle), oxidative phosphorylation (OXPHOS), pentose phosphate pathway (PPP), and fatty acid oxidation (FAO) under physiological conditions and in disease states. This paper describes a step-by-step protocol and prerequirements to measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration on mouse bone marrow-derived neutrophils, human blood-derived neutrophils, and the neutrophil-like HL60 cell line, using metabolic flux analysis on a metabolic extracellular flux analyzer. This method can be used for quantifying the mitochondrial functions of neutrophils under normal and disease conditions.

We describe stepwise protocols measuring the mitochondrial respiration of mouse and human neutrophils and HL60 cells using the metabolic extracellular flux analyzer.

מדידה בזמן אמת של הפרופיל הביו-אנרגטי המיטוכונדריאלי של נויטרופילים

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Immunology and Infection

Use of Minimally Invasive Methods to Assess Fuel Utilization and Circadian Rhythms in Older Adults

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic disease. Although the etiology of age-related physical disability is complex and multifactorial, the decline in mitochondrial function appears to coincide with the progression of functional decline in many older adults. The reason why there is a decrease in mitochondrial function with aging remains elusive, but emerging science indicates that both fuel metabolism and circadian rhythms can influence mitochondrial function.
Recent studies have established that circadian rhythms become disturbed with aging, and that disrupted circadian rhythms have pathological consequences that impact mitochondrial function and overlap with many age-associated chronic diseases. Current quantitative methods for direct assessment of mitochondrial function are invasive and typically require a muscle biopsy, which can pose difficulties with participant recruitment and study adherence, given the perceived levels of potential pain and risk. Thus, an innovative and relatively noninvasive protocol to assess changes in mitochondrial function at the cellular level and circadian patterns in older adults was adapted. Specifically, a real-time metabolic flux analyzer is used to assess the mitochondrial bioenergetic function of white blood cells under differential substrate availability.
The expression of circadian clock genes in white blood cells to cross-correlate with the mitochondrial bioenergetics and circadian rhythm outcomes are also analyzed. It is believed that these innovative methodological approaches will aid future clinical trials by providing minimally invasive methods for studying mitochondrial substrate preference and circadian rhythms in older adults.

A novel and minimally invasive protocol is presented to evaluate the synergistic impact of fuel utilization and circadian rhythms on aging individuals, utilizing peripheral blood mononuclear cells.

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic ...

הערכת תפקידה של פונקציית מיטוכונדריאלי עייפות הקשורים לסרטן

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני

מבחן עייפות הליכון: A Assay פשוט, תפוקה גבוהה של התנהגות העייפות דמוית עבור העכבר

קביעה אנליטית של תפקוד מיטוכונדריאלי של הומוגנטים של גידול מוצק מובחר

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים

הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה

זרחן-31 ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית: כלי למדידת

מדידה בזמן אמת של הפרופיל הביו-אנרגטי המיטוכונדריאלי של נויטרופילים

Use of Minimally Invasive Methods to Assess Fuel Utilization and Circadian Rhythms in Older Adults