שיטה זו מאפשרת סינון vivo מהיר בעכברים, של ההשפעה של טרנסג'ין, והוא מותאם במיוחד כדי לבצע רווח או אובדן של מחקרים פונקציואליים, כמו גם תשובה ומיפוי מניע DNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהשימוש בחיזוי של בעלי חיים מהודרים הוא מעל 70% מהיילוד ו ניתן להחילו על כל זני העכבר כולל בעלי חיים מהו מהו מהודרים. לאחר המתת חום לעכברים, לאסוף את oviducts.
כדי להתחיל את הניתוח, להשתמש במספריים כדי להפוך חתך אופקי גדול לתוך חלל הבטן. לאחר מכן, לאתר את oviduct בין הרחם לבין השחלה. לאחר מכן, השתמש במקלות מעוגלים כדי להסיר את mesometrium ואת הממברנה עם כלי הדם הבולטים.
לאחר מכן, להפריד את oviduct מן השחלה לנתח את oviduct מן השחלה. לאחר מכן, משיכה על oviduct לחתוך מן הרחם. מעבירים את כל האוביקטים שנאספו למדיום M2 בטמפרטורת החדר.
בעת טיפול oviducts, הקפד להימנע מנגיעה אמפולה נפוחה עמוסה ביצים מופרות. לאחר מכן, מוסיפים טיפה של 100 מיקרוליטר של פתרון עבודה היאלונידס לצלחת 10 ס"מ. ואז להעביר את שני oviducts לתוכו, כדי להסיר את תאי קומולוס מן הביצים.
תחת סטריאומיקרוסקופ, השתמשו בזוג מזרקי אינסולין כדי לאבטח את האוביוידוקט תוך קריעת האמפולה ופיזור הביציות המופריות. לאחר מכן, השתמש פיפטה זכוכית מוכן עם צינורות שופר כדי לשאף את כל הביצים. באמצעות כלי זה, להעביר אותם בין שש טיפות של M2 בינוני לשטוף את התאים cumulus שמסביב.
לאחר מכן, להעביר את הביצים שטף לתוך 10 מילימטר גם, בצלחת ארבע היטב, מלא מחומם מראש עם M16. לאחר מכן, מעבירים את המנה לחה 37 מעלות צלזיוס אינקובטור. כהכנה, צנטריפוגה ההשעיה וקטור lentiviral מוכן ב 160 גרם במשך שתי דקות, כדי גלולה את הפסולת לעתים קרובות נוכח במלאי lentiviral.
בקבינט בטיחות מדרגה 2, העבר את העל-טבעיים לצינור חדש של 0.5 מיליליטר. לאחר מכן, לטעון microliter אחד של על טבעי, לתוך פיפטה הזרקה. לאחר מכן, לצרף את פיפטה הזרקה מיקרומניפילייזר בצד ימין.
ולצרף את פיפטה החזקה למיקרומניפולטור בצד שמאל. עכשיו, לוותר על שמונה microliters של מדיום M2 במרכז מגלשת הדיכאון. ומכסים בשמן פרדין קל כדי למנוע אידוי.
לאחר מכן, מניחים 20 ביצים לתוך המיקומים הרדודים בירידה מבלי ליצור בועות. לאחר מכן, ודא כי קצה פיפטה ההזרקה פתוח. אם לא, הקש על פיפטה ההזרקה עם פיפטה מחזיקה כדי לפתוח אותו.
לאחר מכן, להגדיר את microinjector עבור 20 זריקות השני. עכשיו, באמצעות פיפטה מחזיק ולחץ ידני שאפו ביצה מופרית המכילה שני pronuclei ושני גופים קוטביים. לאחר מכן, באמצעות פיפטה הזרקה להזריק את החלל perivitelline של הביצה.
אל תיגע קרום הפלזמה. התאימו את הלחץ כך שמרחב פריוויטלין יתמלא בתפתרון. הלחץ לא יעלה על 600 פסקלים hecto.
מיד לאחר הזרקת 20 ביצים, להעביר את האצווה לתוך אמבטיה של מדיום M16 שחומם מראש. ו דגירה אותם לפחות 30 דקות לפני השתלתם. 16 שעות לאחר הזדווגות נקבות נורמליות לזכרים עם vasectomies, לבדוק את תקעי הזדווגות.
השתמש בנקבות האלה להשתלה. לאחר מכן, להפוך פיפטים השתלה עם קוטר פנימי של כ 150 מיקרון. ועם טיפים מלוטשים להבה כי הם כארבעה עד חמישה מילימטרים ארוכים.
לטעון פיפטה עם עובר נבדק, שמן parafin קל רק מעל נקודת הכתף. לאחר מכן, שאף בועת אוויר קטנה וטען עוד יותר את הפיפטה עם מדיום M2. לאחר מכן, שאף בועת אוויר שנייה.
עכשיו, לצייר את העוברים לתוך פיפטה אחד מאחורי השני, מזעור נפח המדיום בין העוברים. לסיים, על ידי שאספירה טיפה קטנה מאוד של שמן parafin רק עובר אחד רחב. הכנת פיפטה reimplantation הוא המפתח צריך הרבה תרגול.
ביצים בפיפיט חייבות להיות מיושרות כמעט ללא מדיום ביניהן. לאחר מכן, לאחר הרדמה של העכבר ואשר את ההרדמה עם קמצוץ בוהן לגלח את שתיים, שתי רצועות סנטימטר של שיער לאורך חוט השדרה ברמה של הצלע האחרונה. עכשיו, מניחים את העכבר על משטח חימום על שדה סטרילי ולעטפת אותו, משאיר חלון לעור החשוף.
לאחר מכן, לחטא את העור החשוף עם קרצוף לסירוגין של iodoprovidone ו 70 אחוז אתנול. עבור ההשתלה, תחילה לעשות חתך רוחבי סנטימטר אחד, ולאחר מכן להחליק את העור באופן רוחבי עד השחלה בצבע כתום גלוי דרך קיר הגוף. לאחר מכן, לעשות חתך חמישה מילימטר עם המספריים בסדר להרים את כרית השומן עם מלחצי בולדוג אטראומטי.
לאחר כרית הוא תפס, לשלוף את השחלה, oviduct ואת החלק העליון של הרחם. לאחר מכן, לאתר את האמפולה ולעשות hemisection עם מספריים ואנה, על קטע oviduct המקשר את השחלה לאמפיולה. לאחר מכן, להציג את פיפטה עובר העברה ולפלט את הביצים.
עוצרים בבועת האוויר הראשונה לאחר שהביצים שוחררו. יש את החומרים הדרושים מוכנים לחזור על ההליך על oviduct השני. וברגע שתסתיים, סגור את העור עם פצעים.
מיד לאחר סגירת העור, להזריק משכך כאבים תוך-פרטיים ולהחדיר את החיה בתא ההתאוששות עם גוף חימום 39 מעלות צלזיוס. לפקח עד שהוא ער לחלוטין. בעלי חיים מהו מהודרים נוצרו בשיטה המוצגת.
וקטורים טיטר lentiviral גבוהה יוצרו באמצעות משפר בסיס 2.3 קילו עבור Neurogenin-3 כדי לנהוג eGFP. או כפקד, שבר של כרומוזום שש לנהוג eGFP. ההשתלבות בעוברים הייתה מוצלחת למדי.
מן העוברים, ניצן הלבלב היה חתך ו immunostained לחפש ביטוי מקומי של eGFP. מעל 90 אחוזים של הווקטורים, עם משפר Neurogenin-3, הביע eGFP ב Neurog3 הבעת תאים. עם זאת, אף אחד מווקטור הבקרה המשולב לא ביטא eGFP באיבו של הלבלב.
אתרי אינטגרציה טרנסג'ין הוערכו על ידי PCR כמותי, באמצעות הגן CDX2 כפקד. המספר הממוצע של אתרי אינטגרציה היה כ -20 באמצעות מבנה Neurogenin-3, או 10 באמצעות מבנה הבקרה. באופן מוזר, טיטר התברות ויראלי המשמש עבור מבנה Neurogenin-3, היה בערך כפול של וקטור הבקרה.
מציע קשר בין טיטר ההשתלבות לבין מספר האינטגרציות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך ליצור מספר גדול של עוברים מהודקים מייסד באמצעות הזרקת perivitelline של וקטורים lentiviral עם יעילות גבוהה. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה לייצר עד 50 בעלי חיים מייסד בתוך יום אחד של microinjection, אם זה מבוצע כראוי.
בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו הזרקת DNA pronuclear טיטר יכול להתבצע, על מנת להקים קווי עכבר מהוססים. אל תשכח כי עבודה עם וקטורים lentiviral כפוף לאישור מוועדת GMO המקומית שלך. וקטורים אלה יכולים להיות מסוכנים ביותר ויש לנקוט אמצעי זהירות תמיד בעת ביצוע הליך זה.
