ברצוננו להודות ג'ון וירט של הגנים אולבריך לאספקת באדיבות דגימות שימוש בפרוייקט זה. עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (R01HL115282 אל-G.R.G.) הקרן הלאומית למדע (DGE1144804 J.R.G, G.R.G.), המחלקה לכירורגיה באוניברסיטת ויסקונסין ואת קרן הבוגרים (H.D.L.). עבודה זו גם נתמך בחלקה על ידי הסוכנות להגנת הסביבה (כוכב גרנט 83573701 מס), מכוני הבריאות הלאומיים (R01HL093282-01A1 ו- UH3TR000506), הקרן הלאומית למדע (IGERT DGE1144804).

1. decellularization של רקמת הצמח באמצעות גישה מבוססת-חומרי ניקוי
<ol><li>
השתמש טרי או קפוא hispida פ, דגימות עלים. הקפאת דגימות טריים שאינם בשימוש מקפיא-20 ° C, חנות לשימוש עתידי (עד שנה). הערה: השתמש רקמות הגבעול או עלה של כמעט כל צמח הרצוי. אחסון מורחב פעמים יכול לגרום נזק לרקמות.<ol>
<li>לקבוע את הגודל והצורה של דגימות להיות מעובד על בסיס השימוש המיועד של המדגם (כלומר מדגמים חתוך לרצועות מתאימים היטב עבור יישומי בדיקות מכניות, בינתיים 8 מ"מ דיסק דוגמאות שימושיות ביישומים culturing רב טוב ). חותכים העלה 8 מ"מ דיסקים עם ביופסיה חדה, נקייה אגרוף בזמן שקוע מתחת לטמפרטורת החדר (20-25 ° C) יונים H2O. פתק: ניתן להשתמש בפרוטוקול זה על כל העלים והגבעולים. עם זאת, דגימות קטנות decellularize מהר יותר.</li>
		<li>דגירה בדגימות למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר (20-25 ° C) יונים H2O על סט צלחת טלטול להגדרת מהירות נמוכה לשטוף ו/או להפשיר אותם. השתמש מספיק יונים H2O כדי להבטיח שכל הדגימות wetted ביסודיות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להכין פתרון של 10% (w/v) dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) יונים H2O. המקום הדגימות במיכל מתאים (בכוס, או צלחת פלסטיק הוא אידיאלי) ולהוסיף מרחביות פתרון לכסות לגמרי את הדגימות. דגירה בדגימות במשך 5 ימים בטמפרטורת החדר (20-25 ° C) על סט צלחת לנער כדי מהירות נמוכה כדי למנוע נזק הדגימות. הערה: לא overcrowd את המיכל כמו זה יכול להאט את תהליך decellularization, להוביל טיפול לא אחיד לפי זמנים תוססים. במהלך שלב זה, דוגמאות כדאי לרכוש גוון חום.<ol>
<li>לאחר 5 ימים, החלף הפתרון מרחביות יונים H2O. Incubate הדגימות דקות 10-15 נוספים על הצלחת לנער כדי לשטוף ביסודיות כל פתרון מרחביות שיורית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין חומרים פעילי שטח ללא יונית של 1% (v/v) בתמיסה אקונומיקה 10% (v/v). כדי להפוך את פתרון 500 מ"ל, מערבבים 5 מיליליטר חומרים פעילי שטח ללא יונית עם 50 מ של אקונומיקה ואז להוסיף 445 מ של יונים H2O. Submerge דוגם בפתרון המוכנים באופן טרי. הערה: הפתרון חומרים פעילי שטח ללא יונית/אקונומיקה אין חיי מדף ארוכים, לכן, אמור לשמש בתוך 48 שעות של הכנה.</li>
	<li>
להחליף את הפתרון חומרים פעילי שטח ללא יונית/אקונומיקה בכל 24 שעות עד הדגימות נמחקים לחלוטין (עיין איור 1A להשוואה ויזואלית). ואז דגירה המדגם במים יונים על צלחת טלטול למשך 2 דקות כדי לשטוף הפתרון עודף חומרים פעילי שטח ללא יונית/אקונומיקה. הגדר את הצלחת לנער קביעת ערך נמוך כדי למנוע פגיעה הדגימות. הערה: הזמן הנדרש כדי לנקות את דגימות המשמשות משתנה, בהתאם לסוג מינים של הצמח. Discoloring מלאה של הדגימות הוא מרמז על decellularization מלא (לבצע כימות דנ א כדי להבטיח ניקוי יסודי).<ol>
<li>Lyophilize את הדוגמאות כדי לאחסן אותם עד שנה (פלאש הקפאה בעזרת חנקן נוזלי הוא המועדף, הקפאת דגימות ב- 80 ° C הוא גם מקובל) ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר (20-25 ° C) בלחות נמוכה.</li>
		<li>לשקם דוגמאות טריס-HCl (10 מ מ, pH 8.5) באמצעות מספיק כדי המעיל דגימות. לשטוף דגימות 2 - 3 פעמים בתקשורת ללא סרום בעדינות באמצעות micropipette לפני השימוש (קרי שימוש 150-300 µL לכל שטיפה, לתוך צלחת רגילה טוב 24). הערה: מאגר טריס-HCl ומדיה ללא סרום (קרי DMEM, אבל כל תרבות התא הבסיסי ניתן יהיה להחליף את המדיה) הם יעיל יותר בהורדת להשפעה תא הכדאיות של דגימות מרחביות התייחסו יותר מאלה שטופלו יונים H2O לבד.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת דוגמאות באמצעות גישה ללא חומרי ניקוי Decellularization
הערה: השלבים הראשונים של הליך זה מתנגשים עם שלבים 1.1-1.1.2 (ראה לעיל).
<ol><li>להכין 5% (v/v) מלבין (NaClO) של 3% (w/v) הפתרון סודיום ביקרבונט (NaHCO3). חממו את הפתרון בשכונה fume ל- 60-70 ° C עבור דגימות עלים פ hispida לחתוך לתוך דיסקים 8 מ"מ תוך כדי ערבוב על פלטה חמה. הערה: ניתן להחליף את סודה לשתייה עם נתרן פחמתי (2CO נה3), או הידרוקסיד הנתרן (NaOH). הטמפרטורה הרצויה משתנה באופן משמעותי (מ בטמפרטורת החדר עד 90 ° C), צריך להיות מותאם על פי המאפיינים של הדגימות בשימוש.</li>
	<li>מרגע שהתמיסה הטווח לטמפרטורה הרצויה, להטביע את הדגימות, להפחית את המהירות מלהיב כדי למנוע פגיעה בהם. לאחר הדגימות נמחקים בעליל (ראה איור 1B להשוואה ויזואלית), להסיר האמבטיה בקפידה. דגירה דגימות פעם ב יונים H2O למשך 1-2 דקות להסיר עודפי אקונומיקה פתרון. הערה: הזמן הנדרש כדי לנקות את הדגימות יכול להשתנות באופן נרחב. לדוגמה, פטרוזיליה חתוך ניתן לפנות ב 10-15 דקות, בזמן דגימות עבה יותר ו/או גדולים יותר כגון כל עלים או גבעולים ניתן לקחת שעות בטמפרטורה גבוהה אמבטיות כדי לנקות לחלוטין.</li>
	<li>Lyophilize את הדגימות ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר (20-25 ° C) בלחות נמוכה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+and+regenerative+medicine:+from+first+principles+to+state+of+the+art.">Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art.</a> Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+function+of+hepatocytes+on+a+novel+three-dimensional+synthetic+biodegradable+polymer+scaffold+with+an+intrinsic+network+of+channels.">Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels.</a> Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).</li><li>Park, A., Wu, B., Griffith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+surface+modification+and+3D+fabrication+techniques+to+prepare+patterned+poly(L-lactide)+substrates+allowing+regionally+selective+cell+adhesion.">Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion.</a> Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).</li><li>Steinhoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+pulmonary+heart+valves+on+allogenic+acellular+matrix+conduits:+in+vivo+restoration+of+valve+tissue.">Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue.</a> Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).</li><li>Stock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+valved+conduits+in+the+pulmonary+circulation.">Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation.</a> Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).</li><li>Ott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Guyette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+Human+Myocardium+on+Native+Extracellular+Matrix.">Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix.</a> Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).</li><li>Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Mesh+Implants+for+Abdominal+Hernia+Repair:+US+Food+and+Drug+Administration+Approval+Process+and+Systematic+Review+of+Its+Efficacy.">Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy.</a> JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).</li><li>Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+skin+substitutes:+an+overview.">Tissue-engineered skin substitutes: an overview.</a> Journal of Artificial Organs. 16 (4), 397-403 (2013).</li><li>Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+osteoblastic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells+on+hydroxyapatite/bacterial+cellulose+nanocomposite+scaffolds.">Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds.</a> Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).</li><li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+synthesis+of+hydroxyapatite/bacterial+cellulose+nanocomposites+for+biomedical+applications.">Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications.</a> Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).</li><li>Vinatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+injectable+cellulose-based+hydrogel+for+the+transfer+of+autologous+nasal+chondrocytes+in+articular+cartilage+defects.">An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).</li><li>Vinatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silanized+hydroxypropyl+methylcellulose+hydrogel+for+the+three-dimensional+culture+of+chondrocytes.">A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes.</a> Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).</li><li>Vinatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cartilage+with+human+nasal+chondrocytes+and+a+silanized+hydroxypropyl+methylcellulose+hydrogel.">Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).</li><li>Helenius, G., B&#228;ckdahl, H., Bodin, A., Nannmark, U., Gatenholm, P., Risberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+biocompatibility+of+bacterial+cellulose.">In vivo biocompatibility of bacterial cellulose.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 76 (2), 431-438 (2006).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+aligned+nanofibrous+collagen+scaffold+by+electrospinning+and+its+effects+on+in+vitro+fibroblast+culture.">An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).</li><li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shape-controlled+tuneable+microgel+platform+to+modulate+angiogenic+paracrine+responses+in+stem+cells.">A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells.</a> Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).</li><li>Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+microstructure+and+in+vivo+degradation+of+modified+bacterial+cellulose+sponges.">The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges.</a> Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).</li><li>M&#228;rtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+cellulose+sponge+degradable+or+stable+as+implantation+material?+An+in+vivo+subcutaneous+study+in+the+rat.">Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat.</a> Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).</li><li>Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+biocompatibility+of+cellulose+and+its+derivatives.">Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).</li><li>Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiac+cell+constructs+on+cellulose-based+scaffolding.">Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding.</a> Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).</li><li>Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+Subcutaneously+Implanted+Plant-Derived+Cellulose+Biomaterials.">Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials.</a> PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).</li><li>McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+transport+in+plants+obeys+Murray's+law.">Water transport in plants obeys Murray's law.</a> Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).</li><li>Gershlak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+kingdoms:+Using+decellularized+plants+as+perfusable+tissue+engineering+scaffolds.">Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds.</a> Biomaterials. 125, 13-22 (2017).</li><li>Fontana, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofunctionalized+Plants+as+Diverse+Biomaterials+for+Human+Cell+Culture.">Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).</li><li>Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+structural+materials.">Bioinspired structural materials.</a> Nature Materials. 14 (1), 23-36 (2015).</li><li>Gibson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hierarchical+structure+and+mechanics+of+plant+materials.">The hierarchical structure and mechanics of plant materials.</a> Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).</li><li>Hoshiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+Extracellular+Matrix+as+an+In+vitro+Model+to+Study+the+Comprehensive+Roles+of+the+ECM+in+Stem+Cell+Differentiation.">Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Guyette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+decellularization+of+whole+organs.">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li><li>Modulevsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apple+derived+cellulose+scaffolds+for+3D+mammalian+cell+culture.">Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture.</a> PLoS ONE. 9 (5), e97835 (2014).</li><li>Seba, A., Sloane, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomical+Preparation+of+Vegetables,+by+Albertus+Seba,+F.+R.+S.+Communicated+to+the+Royal+Society+by+Sir+Hans+Sloane,+Bart.+Pr.+R.+S.+and+Col.+Med.+Lond.+Translated+from+the+German,+by+Mr.+Zolman,+F.+R.+S.">The Anatomical Preparation of Vegetables, by Albertus Seba, F. R. S. Communicated to the Royal Society by Sir Hans Sloane, Bart. Pr. R. S. and Col. Med. Lond. Translated from the German, by Mr. Zolman, F. R. S.</a> Philosophical Transactions. 36 (407), 441-444 (1775).</li><li>Parrish, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phantom+Boutique:+A+Popular+Treatise+on+the+Art+of+Skeletonizing+Leaves+and+Seed-Vessels+and+Adapting+Them+to+Embellish+the+Home+of+Taste.">The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste.</a> The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. , (1865).</li><li>Coffin, S., Gaudette, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aprotinin+extends+mechanical+integrity+time+of+cell-seeded+fibrin+sutures.">Aprotinin extends mechanical integrity time of cell-seeded fibrin sutures.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (9), 2271-2279 (2016).</li><li>Zangala, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Genomic+DNA+from+Mouse+Tails.">Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e246 (2007).</li><li>Borselli, C., Cezar, C., Shvartsman, D., Vandenburgh, H., Mooney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+multifunctional+delivery+scaffold+in+the+ability+of+cultured+myoblasts+to+promote+muscle+regeneration.">The role of multifunctional delivery scaffold in the ability of cultured myoblasts to promote muscle regeneration.</a> Biomaterials. 32 (34), 8905-8914 (2011).</li><li>Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+Scaffolds+to+Enhance+Transplanted+Myoblast+Survival+and+Migration.">Designing Scaffolds to Enhance Transplanted Myoblast Survival and Migration.</a> Tissue Engineering. 12 (5), 1295-1304 (2006).</li><li>Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulating+activation+of+transplanted+cells+controls+tissue+regeneration.">Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (8), 2494-2499 (2006).</li><li>Ma, J., Holden, K., Zhu, J., Pan, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Application+of+Three-Dimensional+Collagen-Scaffolds+Seeded+with+Myoblasts+to+Repair+Skeletal+Muscle+Defects.">The Application of Three-Dimensional Collagen-Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-9 (2011).</li><li>Tyree, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+hydraulics:+the+ascent+of+water.">Plant hydraulics: the ascent of water.</a> Nature. 424 (6943), 923 (2003).</li><li>Raven, P., Evert, R., Eichhorn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Plants. , (2005).</li><li>Turrell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+area+of+the+internal+exposed+surface+of+dicotyledon+leaves.">The area of the internal exposed surface of dicotyledon leaves.</a> American Journal of Botany. 23 (4), 255-264 (1936).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

במסמך זה, מתוארות שתי שיטות decellularize רקמות הצמח. התוצאות שהוצגו כאן, יחד עם התוצאות של מחקרים קודמים25, מציע כי הפרוטוקולים הושיט צפויים החלים מגוון רחב של זנים של צמחים, יכול להתבצע על גבעולים ועלים. הליכים אלה הם פשוטים, אינם דורשים ציוד מיוחד, כך הצמח decellularization יכול להתבצע במעב?...

הנדסת רקמות הופיע בשנות השמונים כדי ליצור רקמה חיה תחליפים, ואפשרות כתובת משמעותית האיברים והרקמות מחסורים1. אסטרטגיה אחת השתמשה פיגומים כדי לעורר את הגוף להתחדש חסרים לרקמות או לאיברים מדריך. למרות מתקדם ייצור גישות כגון הדפסה תלת-ממדית יצרו פיגומים עם מאפיינים הפיזיים ייחודיים, היכולת לייצר פיגומים עם מגוון רחב של מאפיינים פיזיים וביולוגיים השגה נשאר אתגר2 , 3. יתר על כן, עקב מחסור של רשת כלי הדם פונקציונלי, טכניקות אלו היה מוגבל בהתחדשות רקמות תלת-ממדי. השימוש decellularized ברקמות בעלי חיים ואנושית כמו פיגומים עזר תוך עקיפת זו בעיה4,5,6,7. עם זאת, עלות גבוהה, השתנות אצווה-כדי-אצווה וזמינות מוגבלים עלולה להגביל השימוש הנרחב של פיגומים חיה decellularized8. ישנם חששות לגבי העברת מחלות פוטנציאליות לחולים ותגובה אוטואימונית כמה רקמות בתרבית של decellularized9.
תאית, נגזר צמח ו מקורות חיידקי, נעשה שימוש נרחב לייצר biomaterials למגוון רחב של יישומים רפואה רגנרטיבית. להלן מספר דוגמאות: עצם10,11, סחוס12,13,14 ו-15ריפוי הפצע. פיגומים זה מורכבות תאית יש יתרון נוסף בכך הם הם עמידים עמידים להיות שבור על-ידי תאי יונקים. זה בשל העובדה כי בתרבית של תאים אינם מייצרים אנזימים הדרושים לשבור מולקולות תאית. לשם השוואה, פיגומים המיוצר באמצעות מקרומולקולות של מטריצה חוץ-תאית, כמו קולגן, מפורקים ברצון16 , לא יכול להיות גם מתאים ליישומי לטווח ארוך. קולגמן יכול מיוצב על ידי cross-linking כימי. עם זאת, יש פשרה עקב רעילות הטבועה של cross-linkers להשפיע על התאימות של ה-פיגומים17. לעומת זאת, תאית יש פוטנציאל להיות נוכח באתר של ההשתלה לתקופות ממושכות של זמן כי הוא חסין מפני השפלה אנזימטי תאים בתרבית של18,19,20. זה יכול להשתנות על-ידי כיוונון הקצב של השפלה באמצעות הידרוליזה רעלני ואספקה שיתוף של פיגומים עם cellulases21. התאימות של תאית decellularized הצמחי פיגומים ויוו הוכח גם במסגרת מחקר על עכברים22.
דרך מאות מיליוני שנים של אבולוציה, צמחים יש מעודן שלהם מבנה והרכב כדי להגביר את היעילות של תחבורה נוזלים ושמירה. כלי הדם צמח למזער הידראולי ההתנגדות על ידי הסתעפות לתוך כלי קטן יותר, בדומה להערכת יונקים על פי החוק של מורי23. לאחר decellularization, רשת מורכבת של הצמח של כלים נקבוביות מחוברים נשמר. בהתחשב המספר העצום של מיני צמחים שונים זמינים, פיגומים הצמחי יש את היכולת להתגבר על מגבלות עיצוב משפיע כעת פיגומים הנדסת רקמות24,25. למשל, Modulevsky. et al. הוכיח כי ההעברה אנגיוגנזה ותא התרחשה כאשר אפל decellularized רקמות הושתל subcutaneously על גב עכבר22. באופן דומה, Gershlak. et al. הראה כי תאי אנדותל יכול להיות מבוגר בתוך להערכת העלים decellularized24. בניסוי נפרדים, Gershlak. et al. היו גם מסוגל להראות כי cardiomyocytes יכול להיות גדל על פני השטח של עלים, הצליחו חוזה24.
צמחים כוללים גם ארגון מורכב מן הטלפון הסלולרי הסולם מאקרוסקופית, שקשה להשיג אפילו עם טכניקות הייצור המתקדמים ביותר שפותחה עד היום. העיצוב הירארכי מורכבים של רקמות הצמח מחזק מסכום המרכיבים שלהם26אותם. צמחים בעלי שפע של תכונות מכאניות שונות החל נוקשה וקשוח רכיבים כגון הגבעולים, אלה הרבה יותר גמיש, גמיש כמו עלים27. העלים משתנים בהתאם המינים מבחינת גודל, צורה, לשבור את כוח, מידת vascularization, והוא מסוגל לשאת דרגות שונות של hydrophilicity. בסך הכל, מאפיינים אלה צמח מראים כי צמחים decellularized יכול לשמש פונקציונליים מאוד וייחודי ומכשור רפואי, כולל רקמות הנדסה פיגומים.
פרוטוקול זה מתמקד בשתי שיטות כדי decellularize רקמות הצמח, כגון עלים, גבעולים, לשימוש פיגומים בהנדסת רקמות. השיטה הראשונה היא טכניקה המבוססת על חומרי ניקוי המשתמשת סדרה של אמבטיות להסיר את ה-DNA והחומר הסלולר, אשר הותאם של טכניקה בשימוש נרחב decellularize יונקים ולשתול רקמות6,22,25 ,28,29,30. השיטה השנייה היא ללא דטרגנט והוא ממאמרו של פרוטוקול "skeletonization" משמש בדרך כלל כדי להסיר רקמות רכות של עלים31. בעבר הראו כי רותח עלים בפתרון אקונומיקה, סודיום ביקרבונט הקל פרידתה של להערכת הרקמות שמסביב31. טכניקה זו אפשר להביא חזרה על ניסויים שבוצעו ב 17 אתth ו המאותה 18, כגון העבודה של אלברטוס סבע32 ו אדוארד פאריש33. ניסויים אלה כיעד עוזב משנה הצמח, כגון עלים ופירות, שקוע במים לתקופות ממושכות של זמן (שבועות עד חודשים) ומאפשר הרקמות רך יותר לריקבון משם באופן טבעי. כאן הגישה "skeletonization" מותאמת לשימוש תנאים מתון יותר, כגון פעמים יותר זמן דגירה בטמפרטורות נמוכות, כדי להסיר את שאריות תאי וכדי למנוע באופן משמעותי לשבש את מבנה רקמות רכות. על הניסויים מפורט במסמך זה, שימשו שלושה סוגי צמחים: פיקוס hispida, Pachira aquatica , זן של Garcinia. התוצאות של ה-DNA כימות בדיקות מכניות, השפעה על פעילות חילוף החומרים הסלולר של שתי השיטות שתוארו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:771px;" width="771">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:136px;">75746-1KG</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:111px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:136px;">807426</td>
			<td style="width:277px;">Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite)</td>
			<td style="width:111px;">Clorox</td>
			<td style="width:136px;">Item #: 31009</td>
			<td style="width:277px;">Standard concentrated bleach.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:111px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">217120010</td>
			<td style="width:277px;">Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">8 mm Biopunch</td>
			<td style="width:111px;">HealthLink</td>
			<td style="width:136px;">15111-80</td>
			<td style="width:277px;">Cuts samples that fit well in 24 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">Belly Dancer-Shake table</td>
			<td style="width:111px;">Stovall Life Sciences</td>
			<td style="width:136px;">BDRAA115S</td>
			<td style="width:277px;">Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Isotemp hot/stir plate</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:277px;">Can use any style/brand of hot/stir plate.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">Beaker</td>
			<td style="width:111px;">Any</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:277px;">Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Tris Hydrochloride</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP153-500</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">DMEM</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">MT50003PC</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Quant-iT Picogreen dsDNA assay</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:136px;">P11496</td>
			<td style="width:277px;">Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two methods for decellularization of plant tissues for tissue engineering applications

השתלים עצמיים סינתטי, מהחי המשמשים כעת בתור פיגומים להחלפת רקמות יש מגבלות בשל זמינות נמוכה, הביו המסכן ועלות. רקמות הצמח יש מאפיינים חיוביים שהופכים אותם באופן ייחודי מתאים להשתמש פיגומים, כגון שטח גבוהה, תחבורת מים מעולה ושמירה, נקבוביות מחוברים, המקובץ רשתות כלי דם, ומגוון רחב של מכונות מאפיינים. שתי שיטות מוצלחת של צמח decellularization עבור יישומים הנדסת רקמות מתוארים כאן. השיטה הראשונה מבוססת על אמבטיות דטרגנט להסיר חומר הסלולר, הדומה שנוצרו קודם לכן שיטות השתמשו כדי לנקות רקמות יונקים. השניה היא שיטה ללא דטרגנט הותאם מפרוטוקול מבודד להערכת עלה, כרוכה בשימוש אקונומיקה מחוממת וחדר אמבט מלח כדי לנקות את העלים והגבעולים. שתי השיטות תשואות פיגומים עם תכונות מכניות דומות, השפעה מטבולית סלולרית נמוכה, ובכך מאפשר למשתמש לבחור פרוטוקול אשר מתאים יותר יישום המיועד שלהם.

שתי השיטות הניב פיגומים שהיו מתאימים עבור יישומי הנדסה תרבית תאים ורקמות. איור 1 מציג את תהליך העבודה הכללי של התהליך decellularization באמצעות עלים שלמים של שיטה המבוססת על חומרי ניקוי ו לחתוך דוגמיות (8 מ מ קוטר) עבור פעולת השירות ללא חומרי ניקוי. Decellularization מוצלחת...

Watch this Scientific Journal Video about Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications at JoVE.com

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

שתי שיטות Decellularization של רקמות הצמח ליישומים הנדסת רקמות

כאן אנו מציגים, ניגודיות שני פרוטוקולים נהגה decellularize רקמות הצמח: גישה מבוססת דטרגנט וגישה ללא חומרי ניקוי. שתי השיטות להשאיר מאחור את מטריצה חוץ-תאית של רקמות הצמח בשימוש, אשר אז יכול להיות מנוצל כמו פיגומים עבור יישומי הנדסת רקמות.

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

two-methods-for-decellularization-plant-tissues-for-tissue

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.5K Views.  University of Wisconsin-Madison. כאן אנו מציגים, ניגודיות שני פרוטוקולים נהגה decellularize רקמות הצמח: גישה מבוססת דטרגנט וגישה ללא חומרי ניקוי. שתי השיטות להשאיר מאחור את מטריצה חוץ-תאית של רקמות הצמח בשימוש, אשר אז יכול להיות מנוצל כמו פיגומים עבור יישומי הנדסת רקמות.

Video: Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

ייצור של חומרים בזריקות נגזר ביולוגית של הנדסת רקמות שריר הלב

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Decellularization ו Recellularization של כבדים שלמים

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS אלסטומרי פיגומים להנדסת רקמות העורקים

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Postproduction עיבוד Fibres Electrospun עבור הנדסת רקמות

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

אחזור כירורגי, בידוד ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הרחבת תאים הצולבות קדמי אדם נגזרים רצועה עבור יישומי הנדסת רקמות

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

הכנת Thermoresponsive Nanostructured משטחי הנדסת רקמות

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin exine capsules (SECs) are obtained when spores or pollen are processed so as to remove the internal sporoplasmic contents. The resulting hollow microcapsules exhibit a high degree of micromeritic uniformity and retain intricate microstructural features related to the particular plant species. Herein, we demonstrate a streamlined process for the production of SECs from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs. The current SEC isolation procedure has been recently optimized to significantly reduce the processing requirements which are conventionally used in SEC isolation, and to ensure the production of intact microcapsules. Natural L. clavatum spores are defatted with acetone, treated with phosphoric acid, and extensively washed to remove sporoplasmic contents. After acetone defatting, a single processing step using 85% phosphoric acid has been shown to remove all sporoplasmic contents. By limiting the acid processing time to 30 hr, it is possible to isolate clean SECs and avoid SEC fracturing, which has been shown to occur with prolonged processing time. Extensive washing with water, dilute acids, dilute bases, and solvents ensures that all sporoplasmic material and chemical residues are adequately removed. The vacuum loading technique is utilized to load a model protein (Bovine Serum Albumin) as a representative hydrophilic compound. Vacuum loading provides a simple technique to load various compounds without the need for harsh solvents or undesirable chemicals which are often required in other microencapsulation protocols. Based on these isolation and loading protocols, SECs provide a promising material for use in a diverse range of microencapsulation applications, such as, therapeutics, foods, cosmetics, and personal care products.

This protocol/manuscript describes a streamlined process for the production of sporopollenin exine capsules (SECs) from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs.

הפקת קפסולות צמחית עבור יישומי מיקרואנקפסולציה

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...

שתי שיטות Decellularization של רקמות הצמח ליישומים הנדסת רקמות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video