Name: spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)
Uploaded: 2018-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS at JoVE.c

אנו מודים פול אובריאן, מינה Marizel, איזבלה פרידמן לניסויים בבעלי חיים, Jacquie גונזלס, ויינר דניאל מ- NIH/NIAID לעזרה עם גמא הקרנה של רקמות ארנב לפני לייזר לכידת microdissection ו Jansy Sarathy עבור כתב יד מחשבות ועצות. עבודה זו נתמכה על ידי מימון הצעת החוק ולהעניק ומלינדה גייטס (OPP1174780) ומכשור NIH משותפים 1S10OD018072. אנו מודים Eliseo א Eugenin על מתן גישה המיקרוסקופ לייקה LMD 6500 ושיתוף מומחיות וייעוץ. הרכישה, ותמיכה מתמשכת של, 6500 LMD מומן על ידי מענק של לאומי המכון לבריאות הנפש, MH096625, המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, שבץ מוחי, NS105584, PHRI מימון (E.A.E) GSK תרומות (E.A.E).

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל בוצעו על פי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים באישור בעלי חיים מוסדיים אכפת והוועדה שימוש של NIAID (NIH), בבתסדה, מרילנד
1. הניסויים ואוסף רקמות
סעיף זה של הפרוטוקול מתאר נהלים בעלי חיים וגבייה מדגם בתנאים אבטחה ברמה 3 (BSL3). הפרוטוקולים מפורט של שחפת Mycobacterium תרסיס זיהום הליך התרופות, המינהל היה הפרוטוקולים ארנבים שתוארה לעיל11,12.
<ol><li>להדביק ארנבים ניו זילנד הלבן (זכר ונקבה -בת 4-5 חודשים) עם מ. שחפת HN878 באמצעות מערכת תרסיס האף בלבד, כפי שצוין בעבר תיאר11.</li>
	<li>לנהל את הסמים שבחרת (Ethambutol בדוגמה המובאת כאן) דרך המסלול המועדף, המתת חסד החיות של 2, 6 ו- 24 שעות לאחר ניהול. ראשית, עזים ומתנגד הארנב בזריקה תוך שרירית של קטמין 35 מ"ג/ק"ג, חריגות השירותים הווטרינריים-5 מ"ג/ק"ג. לחכות 10 דקות ואשר ההרדמה המתאים על-ידי צובט את הזנב ונגיעה בעדינות את העין. אם אין תגובה, המתת חסד על ידי עירוי לוריד של פנטוברביטל, פניטואין (ראה טבלה של חומרים) ב 1 מ"ל/4.5 ק"ג ב 2 מ ל תמיסת מלח סטרילית. הערה: אלה timepoints אופטימלית לחפות את הפרופיל פרמוקוקינטיים Ethambutol, מחייבים התאמת/אופטימיזציה עבור תרופות מחקר אחרות.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, מספריים, ו/או אזמל, להסיר את הריאות בחלל החזה, נכרות ביופסיות הריאה המכיל גדול גרנולומות נמק נעוץ סביב רקמת הריאה מעורב (כמתואר קודם לכן3). נמק גרנולומות מופיעות בז, צבע, בדרך כלל בולטות מעט מן הריאות שצבעו אדום/ורוד שמסביב. כדי להקל על cryosectioning קל, ודא ביופסיות יותר מ- 2 x 1.5 x 1.5 ס מ.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, מקם את הביופסיה על גבי מגש cryomold שכותרתו מראש עם משטח החיתוך הרצוי במגע ישיר עם הבסיס של המגש. לאחר הקפאה, פעולה זו תספק משטח שטוח שממנו יהיה לחתוך cryosections.</li>
	<li>להקפיא את הביופסיה ב אדי חנקן נוזלי. למלא את מיכל קלקר עד לעומק של 2 ס מ עם חנקן נוזלי ומניחים מתלה צינור מתכת. המתלה צריכים לבלוט מעל פני השטח של החנקן הנוזלי מתן משטח שטוח שעליו ממוקמים המגשים רקמות. מקם את המכסה על המכולה קלקר ולהשאיר רקמות ל-10 דקות להקפיא באופן מלא.</li>
	<li>להסיר את המגשים רקמות, במהירות לעטוף בסרט אלומיניום, למקם באופן אינדיבידואלי עם התווית שקיות פלסטיק לסגירה חוזרת וחותמת. להעביר ל-80 מעלות צלזיוס מקפיא לאחסון. הערה: השלבים 1.1-1.6 מבוצעות בתנאים BSL3 (כולל כל העבודה בעלי חיים וטיפול של האיברים הנגועים). גמא שקסמה מקרין והביופסיות ריאות ב- 3 Megarads כדי לאפשר טיפול מחוץ BSL3 הבלימה. ניתן לבצע לייזר microdissection לכידת על רקמות הפטריה בתוך BLS3 המתקן אם תאושר פרוטוקול הבטיחות נמצאים במקום. עם זאת, השארית של פרוטוקול זה מתאר עיבוד במורד הזרם במתקן BSL-2.</li>
</ol>2. רקמת חלוקתה
<ol><li>הגדר את cryostat הטמפרטורה הרצויה חיתוך. להעביר את הביופסיה ריאות מוקרן-גמא-80 ° C אחסון cryostat ולהשאיר למשך 30 דקות equilibrate הטמפרטורה ברקמות. הערה:-20 ל-22 ° C הוא אופטימלי ביופסיות הנגע טרה-בתים.</li>
	<li>באמצעות פינצטה, לתקן את הביופסיה לצ'אק cryostat באמצעות כמות קטנה של דבק טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) לדבוק הבסיס של רקמות הצ'אק. אוריינט הרקמה כך משטח שטוח (זה היה בקשר עם בסיס cryomold) הוא השטח החשוף לחיתוך. ודא ש-OCT לא לזהם את השטח רקמות, כמו זה עלולים להפריע הניתוח ספקטרומטר מסה עוקבות.</li>
	<li>חותכים לשלושה חלקים רקמות-עובי 25 מיקרומטר והר אל מחמד ממברנה שקופיות. בעדינות לגעת הקרום בסעיף רקמות והסר. אם מוחל מדי לחץ, קרום דק לגזרים.<ol>
<li>הימנע טיפול מופרז של השקופיות לפני הרכבה כפי התוצאה תהיה קרום חיית המחמד להיות טעון ועניים הידבקות של הסעיפים רקמות. ודא כי השקופית הממברנה נשמרת בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר אדהזיה ההפשרה-הרכבה ומוצלח של הרקמה למוח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסר את השקופית cryostat, מאפשרים מילה נהדרת. במשך 3 דקות. אם הפונקציה LCM-LC/MS/MS לא תתבצע באופן מיידי, חותם את השקופית בתיק קטן אטום sealable, העברת אחסון-80 ° C עד נדרש ניתוח.</li>
	<li>לגזור מקטע הסמוך ב 10-12 מיקרומטר, הפשרה-mount על משטח זכוכית רגילה עבור Hematoxylin ואאוזין (H & E) צביעת והפניה. סעיפים נוספים ניתן לחתוך בשלב זה עבור אחרים כתמים להסטולוגיה הרצוי (כגון צביעה-Niellsen להמחשת שחפת Mycobacterium (MTB)).</li>
</ol>3. Microdissection
<ol><li>להסיר את שקית אטומה המכילה את השקופית מ-80 מעלות צלזיוס אחסון ומאפשרים להגיע בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הערה: אם השקופית קר חשוף מיד לאווירה מעבדה, הרקמה להפוך מצופה עיבוי, עלולה לסכן את שלמות המרחבי של התרופה.</li>
	<li>הפעל את המיקרוסקופ ואת לייזר (לייזר דורש 5-10 דקות להתחמם לפני חיתוך יכול להתחיל). לטעון mL 0.20 כובע שטוח המבחנות לתוך למחזיק.</li>
	<li>הסר שקופיות מתוך התיק ולקחת תמונה אופטי של סעיף הרקמה בשקופית מחמד באמצעות סורק משטח אופקי.</li>
	<li>מקם את השקופית לתוך מחזיק שקופיות (רקמות פונה כלפי מטה) והקצה אוסף נפרד צינורות לאזורים ספציפיים גרנולומה עניין שימוש בתוכנה מיקרוסקופ. בדרך כלל, אלה יהיו 'ריאות מעורב,' 'הסלולר גרנולומה,' ו- 'caseum' (נמק במרכז), אבל עשוי להשתנות בהתאם פתולוגיה ספציפית של גרנולומה/הביופסיה.</li>
	<li>מתמקדים הרקמה באמצעות 5 X מיקרוסקופ אובייקטיבי. ההגדלה זה צריך לספק תמונה כללית של הרקמה המכילה בשני התחומים גרנולומה הסלולר, נמק. התוכנה בחר את הצינור המיועד 'caseum' כדי להעבירו למצב תחת הרקמה.</li>
	<li>הזן את הפרמטרים הרצויים לנתיחה. הגדרות אופייניות עבור מקטע ריאות עבה מיקרומטר 25 הם עוצמת הלייזר 30, 15, ומהירות צמצם 35 (שרירותי יחידות). עם זאת, אלו ישתנו בהתאם המיקרוסקופ משמש ופוטנציאל פוחתת כוח בגלל גילו של הלייזר.</li>
	<li>בחרו בכלי 'חינם-draw' ו, באמצעות עט או עכבר או מסך מגע, המתאר את האזור הרצוי לצורך ניתוח. פני השטח של האזור יוצג בתוכנה. לשמור על אזורים שנבחרו תחת 500,000 מיקרומטר2 (0.5 מ מ2) כדי להקל על ניתוח קל יותר. חזור על הקרע עד 3 מיליון מיקרומטר2 (3 מ מ2) שנאסף בסך הכל הצינורית.<ol>
<li>לעיתים, באזור גזור עשוי להשאר תקועים למוח שמסביב (למשל עקב משיכה סטטית), אל תיפול לתוך הכיפה אוסף. להסיר אזורים אלה מצטברים שטח הפנים הכולל על-ידי בחירת והסרה ידנית בתוך התוכנה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר את הכובע על 'הנגע הסלולר' ולאסוף 3 מיליון מיקרומטר2 של רקמות שימוש באותו התהליך כמתואר בשלב 3.7.</li>
	<li>בחר את הכובע 'ריאות מעורב' ולאסוף 3 מיליון מיקרומטר2 של רקמות שימוש באותו התהליך כמתואר בשלב 3.7. שימו לב כי רקמת הריאה מעורב מכיל bronchioles רבים ורווחים מכתשי. שים לב כדי לא לכלול את אלה מאזורים רקמות שהוגדרו עבור ניתוח.</li>
	<li>בעל כיפה, בזהירות להיפרם, חותם, שלוף כל שפופרת. להגן על הרקמות גזור סביב אוויר הפרעות (למשל מאנטנת זרימת אוויר התפרצותם דלת הפתיחה). לנתח את רקמות גזור באופן מיידי, או לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס, להפשיר לפני עיבוד וניתוח איכות המזון.</li>
</ol>4. הפקת וניתוח איכות המזון
<ol><li>הכנת מיצוי פתרון של acetonitrile 1:1 / Ethambutol d-10 תקן פנימי המכיל מתנול. בעת בחירת תקן פנימי, שימוש טופס שכותרתו יציב של התרופה analyte (כגון התווית על-ידי דאוטריום EMB המשמש ההדגמה) עם shift המוני מספיק כדי להימנע איזוטופ לחצות לדבר בין סמים analyte תקן (בדרך כלל מינימום של 4 daltons) . הערה: יצירת תקנים ב- homogenate של כל אחד מסוגי רקמות בהתאמה קשה כי יש שליטה מוגבלת מאוד רקמות עם אשר כדי ליצור סטנדרטים homogenate. בתור חלופה להפיכת תקנים מתוך מדגם homogenate מחודדים, תקן יכולים להיווצר על-ידי הוספת רקמות ריק מבחן מתחם יחד, לחילוץ. נפח של רקמות שליטה homogenate שמתאים האחסון היעד מהסעיפים המחקר דגימת רקמה משולבת ישירות עם כמות של הבדיקה מתחם זה יהיה נוכח ריכוז נתון.</li>
	<li>לחשב האחסון רקמות יישוב מבוסס על פני השטח ואת עובי של סעיף הרקמה ולקבוע את גורם הכרחי דילול homogenate שימוש באמצעי האחסון של homogenate אשר יתווספו תקן ו- QC דגימות. חישובים מומחשים מתחת לאזור היעד גזור2 (3 מ מ2) 3 מיליון מיקרומטר עם מיקרומטר עובי 25, 2 µL נפח של homogenate. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>בהנחה צפיפות רקמה של 1 g/mL, להכין את המניה homogenate על-ידי במשקל של 50 מ"ג של רקמות שליטה והוספת PBS מאגר לדלל (באמצעות הגורם דילול 26.67 homogenate שחושבו בצעד 4.2, diluent זה 1.283 מ"ל). Homogenize על ידי להכות רקמת הריאה ומאגר PBS במשך 5 דקות ב- 1750 סל"ד על מהמגן חרוז חרוז. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>למהול 1 מ"ג/מ"ל ריכוז התרופה מניות ב- 1:1 acetonitrile/מים כדי ליצור עיקול רגיל עולה פתרונות. לקבוע עולה ריכוז רגיל המבוסס על ספייק ונפח האחסון רקמת המטרה. הדוגמה מאויר מיועדת 100 ננוגרם למ"ל רגיל באמצעות אמצעי אחסון ספייק µL 10. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>להסיר את הצינורות המכילים הרקמות microdissected מ-80 מעלות צלזיוס אחסון ומאפשרים להגיע בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של פתרון 1:1 acetonitrile/מים ו- 2 µL PBS מאגר הצינורות המכיל רקמות microdissected.</li>
	<li>עיקול רגיל וצינורות בקרת איכות, להוסיף 10 µL של עולה פתרון 2 µL של שליטה ריאות homogenate.</li>
	<li>להוסיף 50 µL של פתרון מיצוי כל שפופרת.</li>
	<li>מערבולת כל שפופרת למשך 5 דקות, sonicate במשך 5 דקות, צנטריפוגה-5000 סל ד למשך 5 דקות כדי ליצור גלולה של הסרט ורקמות בתוך כל שפופרת.</li>
	<li>להעביר 50 µL של תגובת שיקוע צלחת עמוקה 96-טוב-טוב, לדלל עם µL 50 נוספים מים יונים מכל קידוח.</li>
	<li>לבצע ניתוח LC/MS/MS באמצעות כלי אופטימיזציה פרמטרים עבור Ethambutol ו- Ethambutol-d10 תקן פנימי (כאמור שמתואר פרט12).</li>
	<li>השתמש גורם לדילול כדי לתקן את הסכום המדויק של רקמות גזור עבור כל דגימה. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. שיטת אימות
<ol><li>ליצור homogenate של רקמת הריאה שליטה על-ידי שילוב ריאות חלק 1, PBS חלקים 2 ו- 3-4 חרוזים פלדה. לנצח את רקמת הריאה ומאגר PBS למשך 5 דקות ב- 1750 סל"ד באמצעות מהמגן חרוז.</li>
	<li>ספייק homogenate על-ידי הוספת 10 µL של 1 מ"ג/מ"ל Ethambutol דימתיל סולפוקסיד מניות לתוך 990 homogenate µL כדי ליצור ריכוז סופי של 10,000 ng/mL (10 mg/mL) ו מערבולת במשך דקה אחת.</li>
	<li>יצירת בלוק קפוא homogenate על-ידי לשפוך את homogenate לתוך cryomold במהירות קפוא בקרח יבש למשך 5 דקות.</li>
	<li>להכין 25 סעיפים עבה מיקרומטר מהגוש homogenate כמתואר בצעדים 2.1-2.5.</li>
	<li>לנתח אזור הרקמה היעד כמפורט בשלבים 3.2-3.10.</li>
	<li>להוסיף 10 µL 1:1 acetonitrile/מים ו- 2 µL PBS מאגר הצינורות המכיל רקמות microdissected.</li>
	<li>להוסיף 50 µL של פתרון מיצוי כל שפופרת. בצע שלבים 4.9-4.12 כדי ליצור עיקול רגיל ולקבוע את ריכוז התרופה בבלוק homogenate רקמות.</li>
	<li>לחשב יעילות חילוץ באמצעות הנוסחה שלהלן: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li><li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+(DESI)+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection.">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling.">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li><li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-mode+continuous-flow+liquid+microjunction+mass+spectrometry+imaging+of+proteins+in+thin+tissue+sections.">Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections.</a> Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).</li><li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies.">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li><li>Dilillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging,+laser+capture+microdissection,+and+LC-MS/MS+of+the+same+tissue+section.">Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section.</a> J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).</li><li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics:+methodologies+and+clinical+applications.">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li><li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+dissection+sampling+modes+for+direct+mass+spectral+analysis.">Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+A+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).</li><li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy.">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li><li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis.">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model.">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li><li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response.">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

נפתרה במרחב כימות של סמים בתוך נגעים שחפת הריאה נדרשת כדי לקבוע אם התרופה חשיפה מגיע ריכוזים לחיטוי על אוכלוסיות חיידקים השוכנים התאים הנגע שונים. השיטה LCM-LC/MS המתוארות כאן מאפשר כימות מוחלטת של תכשירים נגד שחפת בתוך הנגע התאים, כולל את caseum חיידקים-עשיר, שימוש רק 1-3 מקטעי רקמת בסך הכל. רקמה מ...

היכולת לזהות ולכמת רמות התרופה במרחב היא דרישה חיונית לקביעת אם תרופות נגד שחפת להגיע subpopulations חיידקי בתוך נגעים ריאתי-לחיטוי ריכוזים1. חשיבות מיוחדת הוא בקביעת סמים חדירה לתוך הליבה נמק של הנגע (שנקרא caseum), אשר בדרך כלל מכילה את המספר הגבוה ביותר של החיידקים, וייתכן שהוא לקוי נגיש לסמים עקב העדר vascularization.
שיטות מסורתיות כדי להעריך את הנגע חדירה, שכרוכים המגון הנגעים ריאתי נכרת ואחריו החילוץ הממס וניתוח ספקטרומטר מסה (LC/MS) כרומטוגרפיה נוזלית, הם מאוד רגישים, סלקטיבי עבור הסמים של ריבית. עם זאת, שיטות אלה מציעים מידע מרחבי המסכן, מוגבל לגודל של הרקמה homogenized המקורי. מסה ספקטרומטר הדמיה גישות, כגון לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון (MALDI)2,3, desorption ספקטרומטריית electrospray יינון (דסי)4 או חילוץ שטח משופרת נוזל5, 6 מציעים יכולות הדמיה מאוד במרחב-נפתרה, אבל כימות ישיר יכול להיות מאתגר מאוד או בלתי אפשרי בשל היעילות חילוץ שונות של analyte מהתא שונים ואפקטים של דיכוי יון הטרוגניות או רקמות סוגי7. בנוסף, גישות הדמיה הישירה ביותר של רקמות MS הם מטבעם פחות רגישים יותר LC/MS עקב חוסר ההפרדה כרומטוגרפי של אנדוגני מינים מתחרים על יינון ואת היעילות החילוץ הממס נמוכה יותר של הסם מרקמות.
לייזר לכידת microdissection (LCM) בשילוב עם ניתוח LC/MS יש כבר מיושם באופן שגרתי כדי לבודד לאפיין אזורים רקמה נפרדות עבור פרוטיאומיה מבנית מחקרים8,9 , לאחרונה מנוצל על כימות סמים ב עצומות ברקמות בעלי חיים10. כאן אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת החלת LCM בשילוב עם ניתוח LC/MS (LCM-LC/MS) לכמת תכשירים נגד שחפת בתוך תאים נפרדים גרנולומה. בתהליך microdissection לכידת לייזר, לייזר UV הוא מרוכז באמצעות המטרה מיקרוסקופ לתוך מקטע רקמות, אשר חותך ומבודד אזור הרקמה הרצויה על-ידי ביצוע נתיב המוגדר על-ידי המשתמש. עבור בסיוע הכובד LCM (בטכניקה השתמשו לצורך מחקר זה), סעיף הרקמה הוא רכוב לשקופית קרום דק פולימרי (PET או עט), הרקמה נלכד בתוך הצינורית אוסף מוצב מתחת לשקופית. הסמים מופקים מכל רקמת נכרת, לכמת באמצעות גישות LC/MS סטנדרטי. כמות רקמת נדרש להיות שנאספו נקבעת בסופו של דבר את ריכוז התרופה נוכח הרקמה הצפוי, הרגישות של שיטת ביופידבק. עבור רוב ניתוחים של סמים עצומות ברמות טיפולית וניתח באמצעות ספקטרומטר מסה פאול טריפל שגרתית, 3 מיליון מיקרומטר2 (3 מ מ2) של רקמת שטח מספיקה.
פרוטוקול זה מתאר שילוב רב עוצמה של פרופיל המרחבי, כימות מלא מוצעים על ידי אופנת LCM-LC/MS, מתן סמים מוחלטת ריכוזים בתוך התאים של גרנולומות טרה-בתים. ניתן להחיל את הטכניקה גם לקביעת ריכוזי התרופה ברקמות רבות חולה אחר מתן מידע חיוני סמים בגילוי ופיתוח.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White rabbits</td><td>Covance</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A456-212</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>W6212</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL flat-cap PCR tubes</td><td>Corning</td><td>07-200-392</td><td></td></tr><tr><td>Steel frames, PET-membrane</td><td>Leica</td><td>11505151</td><td></td></tr><tr><td>Premium Frosted Microscope Slides</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>96 Deep well plate 2.0ML PP RB</td><td>Fisher</td><td>NC0363259</td><td></td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 &amp;mu;m)</td><td>Agilent</td><td>820631-001D</td><td></td></tr><tr><td>&quot;Zipper&amp;rdquo; Seal Sample Bags</td><td>Fisher</td><td>01-816-1B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM1850 cryostat</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica CM1860 is the current model</td></tr><tr><td>Laser Microdissection System 6500</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica LMD 6 is the current model</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000 QTRAP Mass Spectrometer</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)

השחפת היא עדיין גורם התחלואה והתמותה ברחבי העולם. שיפורים משטרי סמים הקיים ופיתוח של הריפוי דרושים בדחיפות. היכולת של תרופות במינון טרה-בתים כדי להגיע, לעקר את החיידקים בתוך גרוע vascularized נמק מחוזות (caseum) גרנולומות ריאתי חיונית התערבות טיפולית מוצלחת. משטרי טיפולית יעילה ולכן חייב להכיל תרופות עם סגולות חדירה caseum חיובית. השיטות הקיימות LC/MS עבור לכימות רמות התרופה ברקמות ביולוגיות מוגבלת ליכולות הרזולוציה המרחבית, ולכן קשה לקבוע במדויק ריכוז סמים מוחלטת בתוך תאי רקמת קטן כמו אלה שנמצאו בתוך גרנולומות נמק. כאן אנו מציגים פרוטוקול המשלב לייזר לכידת microdissection (LCM) של רקמות באופן פתולוגי, נבדל אזורים עם ביופידבק כמת. טכניקה זו מספקת כימות מוחלטת של סמים בתוך caseum גרנולומה, סביב הנגע הסלולר ואת רקמת הריאה מעורב, לכן, באופן מדויק קובע אם ריכוזים אחרים להיות מושגת. בנוסף המחקר שחפת, הטכניקה יש יישומים פוטנציאליים רבים על כימות נפתרה במרחב של סמים לרקמות החולות.

סקירה כללית של הגישה LCM-LC/MS מוצג באיור1. לאחר לחיטוי הרקמה על ידי גמא-הקרנה, כל השלבים הבאים (מתוך רקמת חלוקתה ואילך) מתקיימים מחוץ BSL3 תנאים. איור 2 מציג הנגע מקטעים ביופסיה לפני ואחרי רקמות בידוד על ידי אופנת LCM. אזורי נמק הסלולר של נגעים טרה-ב...

Watch this Scientific Journal Video about Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS at JoVE.c

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות לייזר לכידת microdissection בשילוב עם ניתוח LC/MS במרחב-לכמת הפצות סמים בתוך גרנולומות שחפת הריאה. הגישה יש ישימות רחבה כדי לכימות ריכוז סמים בתוך רקמות-פירוט מרחבית גבוהה.

כימות המרחבי של תרופות נגעים שחפת הריאה על ידי לייזר ללכוד Microdissection נוזלי כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

spatial-quantification-drugs-pulmonary-tuberculosis-lesions-laser

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Medicine

Unit 1

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Lower Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K Views.  Rutgers, The State University of New Jersey. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות לייזר לכידת microdissection בשילוב עם ניתוח LC/MS במרחב-לכמת הפצות סמים בתוך גרנולומות שחפת הריאה. הגישה יש ישימות רחבה כדי לכימות ריכוז סמים בתוך רקמות-פירוט מרחבית גבוהה.

Video: Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

לדוגמא הכנה של<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; תמציות ללימודי metabolomic תהודה מגנטיים גרעיניים

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Immunology and Infection

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

ספקטרוסקופיית ראמאן משולבת ופלטפורמת ספקטרומטר המסה ללימוד תא יחיד קליטת סמים, מטבוליזם, ואפקטים

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Biochemistry

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

גישה החדשנית Microdissection לשחזור<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; תמלילים ספציפיים מפרפין קבוע פורמלין משובץ ריאות גרנולומות

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

דגם רקמות 3D ריאות אדם ללימודים פונקציונליים ב<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; זיהום

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay מחייב Assay כי חוזה חדירה לסמים בשחפת נגעים

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

ניתוח של 18FDG PET/CT הדמיה ככלי לימודי שחפת Mycobacterium זיהום וטיפול פרימטים לא אנושית

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

שחפת מולקולרית העמסה בקטריאלי שיטת (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. Human-infective trypanosomatid parasites include Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease; Trypanosoma brucei, the&#160;causative agent of sleeping sickness; and Leishmania species, causative agents of leishmaniasis. Jointly, they affect 20 million people across the globe. These parasites show specific tropism: heart, esophagus, colon for T. cruzi, adipose tissue, pancreas, skin, circulatory system and central nervous system for T. brucei, skin for dermotropic Leishmania strains, and liver, spleen, and bone marrow for viscerotropic Leishmania strains. A spatial perspective is therefore essential to understand trypanosomatid disease pathogenesis. Chemical cartography generates 3D visualizations of small molecule abundance generated via liquid chromatography-mass spectrometry, in comparison to microbiological and immunological parameters. This protocol demonstrates how chemical cartography can be applied to study pathogenic processes during trypanosomatid infection, beginning from systematic tissue sampling and metabolite extraction, followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry data acquisition, and concluding with the generation of 3D maps of metabolite distribution. This method can be used for multiple research questions, such as nutrient requirements for tissue colonization by T. cruzi, T. brucei, or Leishmania, immunometabolism at sites of infection, and the relationship between local tissue metabolic perturbation and clinical disease symptoms, leading to comprehensive insight into trypanosomatid disease pathogenesis.

This protocol describes the steps to generate a 3D model of metabolite distribution during trypanosomatid infection, including sample collection, metabolite extraction, an overview of liquid chromatography-tandem mass spectrometry data acquisition, 3D model generation, and finally, data visualization.

גישות קרטוגרפיה כימית לחקר זיהום טריפנוסומטיד

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

מאומת LC-MS/MS הפאנל לכמת 11 תרופות עמידות לפני שחפת בדגימות שיער קטן

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

האצת קביעת שחפת בשיטת Micro-CFU

Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during the 2019-2021 pandemic. The disease is caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb). The Mycobacterium bovis strain Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), the only TB vaccine, is the oldest licensed vaccine in the world, still in use. Currently, there are 12 vaccines in clinical trials and dozens of vaccines under pre-clinical development. The method of choice used to assess the efficacy of TB vaccines in pre-clinical studies is the enumeration of bacterial colonies by the colony-forming units (CFU) assay. This time-consuming assay takes 4 to 6 weeks to conclude, requires substantial laboratory and incubator space, has high reagent costs, and is prone to contamination. Here we describe an optimized method for colony enumeration, the micro-CFU (mCFU), that offers a simple and rapid solution to analyze M.tb vaccine efficacy results. The mCFU assay requires tenfold fewer reagents, reduces the incubation period threefold, taking 1 to 2 weeks to conclude, reduces lab space and reagent cost, and minimizes the health and safety risks associated with working with large numbers of M.tb. Moreover, to evaluate the efficacy of a TB vaccine, samples may be obtained from a variety of sources, including tissues from vaccinated animals infected with Mycobacteria. We also describe an optimized method to produce a unicellular, uniform, and high-quality mycobacterial culture for infection studies. Finally, we propose that these methods should be universally adopted for pre-clinical studies of vaccine efficacy determination, ultimately leading to time reduction in the development of vaccines against TB.

מחבר זרקור: אופטימיזציה של קביעת CFU להערכה יעילה של יעילות החיסון לשחפת וניתוח הצגת אנטיגן 

The determination of colony-forming units (CFU) is the gold-standard technique for quantifying bacteria, including Mycobacterium tuberculosis which can take weeks to form visible colonies. Here we describe a micro-CFU for CFU determination with increased time efficiency, reduced lab space and reagent cost, and scalability to medium and high throughput experiments.

בדיקת יחידה להקמת מושבות מיקרו להערכת יעילות חיסונים נגד שחפת

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during ...

כימות המרחבי של תרופות נגעים שחפת הריאה על ידי לייזר ללכוד Microdissection נוזלי כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (LCM-LC/MS)

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

לדוגמא הכנה של

ספקטרוסקופיית ראמאן משולבת ופלטפורמת ספקטרומטר המסה ללימוד תא יחיד קליטת סמים, מטבוליזם, ואפקטים

גישה החדשנית Microdissection לשחזור

דגם רקמות 3D ריאות אדם ללימודים פונקציונליים ב

An

ניתוח של ¹⁸FDG PET/CT הדמיה ככלי לימודי שחפת Mycobacterium זיהום וטיפול פרימטים לא אנושית

שחפת מולקולרית העמסה בקטריאלי שיטת (TB-MBLA)

גישות קרטוגרפיה כימית לחקר זיהום טריפנוסומטיד

מאומת LC-MS/MS הפאנל לכמת 11 תרופות עמידות לפני שחפת בדגימות שיער קטן

בדיקת יחידה להקמת מושבות מיקרו להערכת יעילות חיסונים נגד שחפת