Name: rapid nanoprobe signal enhancement by in situ gold nanoparticle synthesis
Uploaded: 2018-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis at JoVE.com

מימון של המועצה האירופית למחקר תחת תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP/2007-2013) / ERC גרנט הסכם מס 615458, מועצת המחקר השבדי ומצוינות Pronova מרכז לטכנולוגיה חלבון (VINNOVA - שוודית סוכנות ממשלתית למערכות חדשנות) הוא הודה בהכרת תודה.

הדוגמאות סרום האנושי התקבלו בהתאם לדרישות המשפטית והאתית של המדינה של אוסף, כלומר. עם האישור של ועדת האתיקה (או דומה) ועם הסכמה בכתב של התורם.
1. שיפור הפתרון הכנה:
<ol><li>להכין מאגר ה-pH 6 MES 10 מ מ על ידי השעיית MES נתרן מלח במים יונים. להתאים את ה-pH 6 באמצעות פתרון NaOH 4 M.</li>
	<li>להכין 5 מ מ HAuCl פתרון4 10 מ מ- MES-pH 6-מאגר (פתרון 1).</li>
	<li>להכין פתרון2 O של21.027 M H ב- 10 מ מ- MES-pH 6-מאגר (פתרון 2). הערה: אמצעי האחסון של פתרון 1 וגם פתרון 2 תלוי המספר והגודל של מיקרו-מערכים כדי להיות משופרת. לדוגמה, microarray של 10 x 10 מ מ דורש 100 μL הנפח הכולל (פתרון 1 + פתרון 2) כדי להבטיח האזור microarray בקשר עם הפתרון שיפור. לאחר דילול,2O H2 אמור לשמש בתוך כ- 30-45 ימים.</li>
</ol>2. חלקיקים הכנה:
<ol><li>להכין 40 ננומטר AuNPs כפי שתואר על ידי Bastús et al. 16 . בקצרה, להזריק 1 מ"ל של 25 מ מ מימית HAuCl4 קודמן לתוך פתרון רותחים של 2.2 מ"מ סודיום ציטרט (149 מ"ל). המתן עד צבע יין אדום נצפית. להשתמש פתרון זה של חלקיקים כמקורות עבור שלבי הצמיחה זרע.</li>
	<li>ב 90 מעלות צלזיוס, להזריק 1 מ"ל של 60 מ מ סודיום ציטרט ואחריו 1 מ"ל של 25 מ מ HAuCl4 לתוך הזרע המכיל פתרון. לאחר 30 דקות, התגובה היא מלאה. חזור על השלב זרע-צמיחה חמש פעמים עד 40 ננומטר חלקיקים מתקבלים, כפי שתואר על ידי Bastús et al. 16
</li>
	<li>למדוד את ספיגת UV-vis של הפתרון הסופי של חלקיקים לקביעת הגודל של חלקיקים. 17 . לחלופין, שידור אלקטרון micrographs (TEM) יכול להיות רכשה, המשמשת לקביעת הגודל של חלקיקים.</li>
	<li>להכין 90 ננומטר AgNPs כפי שתואר על ידי ריברו ואח. 18 . בקצרה, להוסיף dimethylaminoborane (DMAB) פתרון נמרצות מנוער של פולי (חומצה אקרילית, מלח נתרן) (במספר דוכנים) ו- AgNO3. הנפח הסופי של הפתרון הוא 50 מ ל, הריכוז הסופי של DMAB, במספר דוכנים, AgNO3 1.6 מ מ, 10 מ מ, מ מ 3.33, בהתאמה. הערה: 100 ננומטר IONPs ששינה עם קבוצות carboxyl ו- 50 ננומטר SiNPs ששינה עם קבוצות carboxyl נרכשו.</li>
	<li>Functionalize את AuNPs עם נוגדנים בעקבות פרוטוקול שתואר על ידי Puertas et al. 19 . בקצרה, להוסיף 1 מ ג של COOH-פג-SH (5000 g·mol− 1) פתרון של 1.2x10-9 מ' AuNPs (10 צפיפות אופטית, יתר). להתאים את ה-pH ל-12 עם פתרון של 4 M NaOH.<ol>
<li>לתת את הפתרון דגירה בן לילה, בטמפרטורת החדר (~ 22 מעלות צלזיוס), בתנאים מלהיב מתון.</li>
		<li>להסיר את עודף של פג על ידי צריך שתוציאו את הפתרון ב g x 13800 למשך 15 דקות.</li>
		<li>Resuspend בגדר עם 500 μL של מים יונים.</li>
		<li>דגירה של AuNPs פג-השתנה עם 5 μmol של N-(3-Dimethylaminopropyl) N'-ethylcarbodiimide הידרוכלוריד (EDC) ו- 7.5 μmol של מלח נתרן N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) ב- pH MES 10 מ מ 6 מאגר למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להסיר את עודף של EDC, sulfo-NHS על ידי צריך שתוציאו את הפתרון ב g x 13800 במשך 5 דקות.</li>
		<li>Resuspend בגדר ב 500 µL 10 מ מ MES pH 6 המאגר ולהוסיף g·mL 100-1 של נוגדן. לתת את הפתרון תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להסיר את עודף של נוגדנים על ידי צריך שתוציאו את הפתרון ב 13800 g x 10 דקות פעמיים, resuspend בגדר ב 500 μL של 10 מ מ סודיום פוספט pH 7.5, 0.3 M NaCl מאגר. לתת את הפתרון תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להסיר את הנוגדן מאוגד לא ספציפי על ידי צריך שתוציאו את הפתרון ב 13800 g x 10 דקות פעמיים, resuspend בגדר ב 500 μL של 1% אלבומין שור (BSA) במאגר ה-pH 6 MES 10 מ מ. דגירה בדגימות ב 4 ° C בלילה.</li>
		<li>לשטוף את העודפים של BSA על-ידי צריך שתוציאו את הפתרון ב 13800 g x 10 דקות פעמיים ולאחר resuspending בגדר ב 500 μL מאגר ה-pH 6 MES 10 מ מ.</li>
		<li>בצע את השלבים 2.5.1 דרך 2.5.9 עבור השינוי של 5 מ' AgNPs, 0.5 מ ג של IONPS ו 0.5 מ ג של SiNPs עם נוגדן, התאמת הכמויות של EDC, sulfo-NHS בהתאם.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. אנכי לזרום מבחני המבוסס על נייר:
<ol><li>הכן את מיקרו-מערכים באמצעות הפקדת ריכוז הדרגתי של חלבון G על קרום נייר ניטרוצלולוזה עם מדפסת רובוטית. לאחר ההדפסה, תן מיקרו-מערכים הלילה יבש בטמפרטורת החדר (~ 22 ° C).</li>
	<li>לבצע וזמינותו זרימה אנכית עם הקרום בסוגריים בעל מסנן. זורמים פתרון 8 מ' של IgG-השתנה AuNPs באמצעות משאבת אולטרה-מזרק בקצב של mL·min 1− 1. חזור על שלב זה עם פתרון של AgNPs מ' אג-לאחרונה 17, mg·mL 0.1− 1 IgG-השתנה SiNPs ו- 0.1 mg·mL− 1 IONPs IgG-השתנה.</li>
	<li>תן את מיקרו-מערכים יבש בטמפרטורת החדר (~ 22 ° C) במשך 30 דקות וסרוק אותם סורק סטילס ברזולוציה של 4800 dpi. לשמור את התמונות כקובצי TIFF 24-bit צבע.</li>
</ol>4. מבחני המבוסס על זכוכית מסחרי הפניה:
<ol><li>דגירה שתי שקופיות זכוכית עבור 120 דקות לצורך זיהוי מרכיבי לאלרגן עם 4 דגימות בנסיוב אדם שונים בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש לשטוף את מיקרו-מערכים עם מים יונים.</li>
	<li>Incubate שקופית אחת עם הנוגדן IgE נגד מצומדת פלורסנט בטמפרטורת החדר (~ 22 ° C) במשך 30 דקות Incubate השקופית השניה עם האנטי-האדם IgE נוגדנים-ששינה AuNPs למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש לשטוף את מיקרו-מערכים עם מים יונים.</li>
	<li>למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית microarray זה, נדגרה עם הנוגדן IgE נגד פלורסנט עם לייזר סורק המנגנון. Digitalize microarray זה נדגרה עם האנטי-האדם IgE נוגדנים-השתנה AuNPs עם סורק שולחני עבור רכישת אות ערכי צבע מוחלטים.</li>
	<li>לאחר דיגיטיזציה, דגירה של microarray עם הפתרון שיפור בטמפרטורת החדר (~ 22° C) במשך 5 דקות.</li>
	<li>לשטוף את החיישן במים יונים ולאפשר לו להתייבש במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (~ 22 ° C).</li>
	<li>Digitalize את microarray עם סורק שולחני ברזולוציה 4800 dpi עבור רכישת אות ערכי צבע מוחלטים. שמור התמונות בגווני אפור 16 סיביות קובצי TIFF.</li>
</ol>5. Microarray הדגירה עם שיפור פתרון:
<ol><li>מראש לערבב את אותה כמות של פתרון 1 ו- 2 פתרון או לערבב אותם ישירות על המשטח של החיישן ולהבטיח כי האזור של ריבית על microarray מכוסה התערובת של פתרון.</li>
	<li>תן החיישן דגירה בטמפרטורת החדר עם הפתרון שיפור עבור עד כדי 5 דק יותר זמן דגירה זמן יכולות להניב משופרת ברגישויות, כמו גם יחס אות/רעש גבוה יותר, במיוחד עבור מיקרו-מערכים המבוסס על נייר.</li>
	<li>לשטוף את microarray מאת השוקע זה במים יונים פעם אחת למשך 5 ס. תשאיר את זה לייבוש בטמפרטורת החדר. הערה: הזמן של השלב הייבוש תלוי החומר microarray. עבור microarray המבוסס על נייר, הצעד ייבוש דורש כ 30 דקות. עבור microarray המבוסס על זכוכית, הצעד ייבוש דורש כ 5-10 דקות.</li>
</ol>6. הדמיה ניתוח:
<ol><li>לנתח את עוצמות קרינה פלואורסצנטית עם כלי תוכנה. שקול כל התוצאות שווה או גדול מ- 0.3 החבוט Standardize יחידות (ISU), הנחיות השימוש (DfU) של היצרן חיישן.</li>
	<li>לנתח את עוצמות ערכי צבע מוחלטים באמצעות כלי תוכנה. הפוך את קובצי התמונה, למדוד את עוצמת בכל מקום, לחשב את עוצמת פיקסל מרושע. השתמש את הערכים של המקומות triplicate כדי לחשב את הערך הסופי אות כמו ממוצע של שלוש עוצמות פיקסל ספוט מרושע.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+biosensing+applications:+a+review.">Nanomaterials for biosensing applications: a review.</a> Front. Chem. 2, 1 (2014).</li><li>Conde, J., Dias, J. T., Graz&#250;, V., Moros, M., Baptista, P. V., de la Fuente, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Front. Chem. 2, 48 (2014).</li><li>Sato, K., Onoguchi, M., Sato, Y., Hosokawa, K., Maeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cross-linking+gold+nanoparticle+aggregation+for+sensitive+detection+of+single-nucleotide+polymorphisms:+Optimization+of+the+particle+diameter.">Non-cross-linking gold nanoparticle aggregation for sensitive detection of single-nucleotide polymorphisms: Optimization of the particle diameter.</a> Anal. Biochem. 350 (1), 162-164 (2006).</li><li>Cao, X., Ye, Y., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticle-based+signal+amplification+for+biosensing.">Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing.</a> Anal. Biochem. 417 (1), 1-16 (2011).</li><li>Fraire, J. C., Motrich, R. D., Coronado, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+novel+plasmonic+nanoconjugated+analytical+tool+for+ultrasensitive+antigen+quantification.">Design of a novel plasmonic nanoconjugated analytical tool for ultrasensitive antigen quantification.</a> Nanoscale. 8 (39), 17169-17180 (2016).</li><li>Taton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanometric+DNA+Array+Detection+with+Nanoparticle+Probes.">Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes.</a> Science. 289 (5485), 1757-1760 (2000).</li><li>Cao, C., Gontard, L. C., Thuy Tram, L. L., Wolff, A., Bang, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Enlargement+of+Gold+Nanoparticles:+From+Mechanism+to+Scanometric+Detection+of+Pathogenic+Bacteria.">Dual Enlargement of Gold Nanoparticles: From Mechanism to Scanometric Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Small. 7 (12), 1701-1708 (2011).</li><li>Lu, Y., Shi, W., Qin, J., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+cost,+portable+detection+of+gold+nanoparticle-labeled+microfluidic+immunoassay+with+camera+cell+phone.">Low cost, portable detection of gold nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay with camera cell phone.</a> Electrophoresis. 30 (4), 579-582 (2009).</li><li>Zhang, M., Wittstock, G., Shao, Y., Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electrochemical+microscopy+as+a+readout+tool+for+protein+electrophoresis.">Scanning electrochemical microscopy as a readout tool for protein electrophoresis.</a> Anal. Chem. 79 (13), 4833-4839 (2007).</li><li>Zayats, M., Baron, R., Popov, I., Willner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Growth+of+Au+Nanoparticles:+From+Mechanistic+Aspects+to+Biosensors+Design.">Biocatalytic Growth of Au Nanoparticles: From Mechanistic Aspects to Biosensors Design.</a> Nano Lett. 5 (1), 21-25 (2005).</li><li>Wang, S., Chen, Z., Choo, J., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naked-eye+sensitive+ELISA-like+assay+based+on+gold-enhanced+peroxidase-like+immunogold+activity.">Naked-eye sensitive ELISA-like assay based on gold-enhanced peroxidase-like immunogold activity.</a> Anal. Bioanal. Chem. 408 (4), 1015-1022 (2016).</li><li>de la Rica, R., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmonic+ELISA+for+the+ultrasensitive+detection+of+disease+biomarkers+with+the+naked+eye.">Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye.</a> Nat. Nanotechnol. 7 (12), 821-824 (2012).</li><li>Liu, D., Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Oxidase-Catalyzed+Growth+of+Gold+Nanoparticles+Enables+Quantitative+Detection+of+Attomolar+Cancer+Biomarkers.">Glucose Oxidase-Catalyzed Growth of Gold Nanoparticles Enables Quantitative Detection of Attomolar Cancer Biomarkers.</a> Anal. Chem. 86 (12), 5800-5806 (2014).</li><li>Qu, W., Liu, Y., Liu, D., Wang, Z., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-mediated+amplification+allows+readout+of+immunoassays+by+the+naked+eye.">Copper-mediated amplification allows readout of immunoassays by the naked eye.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 50 (15), 3442-3445 (2011).</li><li>Wang, X., Niessner, R., Knopp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+growth+of+immunogold+for+amplified+optical+detection+of+aflatoxin+B1.">Controlled growth of immunogold for amplified optical detection of aflatoxin B1.</a> Analyst. 140 (5), 1453-1458 (2015).</li><li>Bast&#250;s, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetically+controlled+seeded+growth+synthesis+of+citrate-stabilized+gold+nanoparticles+of+up+to+200+nm:+size+focusing+versus+Ostwald+ripening.">Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening.</a> Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).</li><li>Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Size+and+Concentration+of+Gold+Nanoparticles+from+UV-Vis+Spectra.">Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra.</a> Anal. Chem. 79 (11), 4215-4221 (2007).</li><li>Rivero, P. J., Goicoechea, J., Urrutia, A., Arregui, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+both+protective+and+reducing+agents+in+the+synthesis+of+multicolor+silver+nanoparticles.">Effect of both protective and reducing agents in the synthesis of multicolor silver nanoparticles.</a> Nanoscale Res. Lett. 8 (1), 101 (2013).</li><li>Puertas, S., Batalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+Advantage+of+Unspecific+Interactions+to+Produce+Highly+Active+Magnetic+Nanoparticle-Antibody+Conjugates.">Taking Advantage of Unspecific Interactions to Produce Highly Active Magnetic Nanoparticle-Antibody Conjugates.</a> ACS Nano. 5 (6), 1-8 (2011).</li><li>Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+signal+enhancement+method+for+nanoprobe-based+biosensing.">Rapid signal enhancement method for nanoprobe-based biosensing.</a> Sci. Rep. 7 (1), 6837 (2017).</li><li>Shen, G., Zhang, S., Hu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+enhancement+in+a+lateral+flow+immunoassay+based+on+dual+gold+nanoparticle+conjugates.">Signal enhancement in a lateral flow immunoassay based on dual gold nanoparticle conjugates.</a> Clin. Biochem. 46 (16-17), 1734-1738 (2013).</li><li>Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+optimization+of+gold+nanoparticle-based+silver-enhanced+immunoassays.">Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כיום, טכניקות שיפור האות מבחני עם זיהוי מבוסס nanoprobe או מבוססי אנזים12, דורשים קבוצה שנייה של חלקיקים למטרה nanoprobes זיהוי21 , או, במקרה של צביעת טכניקות, מוגבלים ל השימוש AuNPs או AgNPs כמו זיהוי הגששים. 22 . כאן, שיטה פשוטה, מהירה ונטולת אנזים מתואר עבור שיפור האות של מבחני זיהוי מבוסס nanoprobe. בשיטה זו, ניתן היה לשפר את האות ערכי צבע מוחלטים שסופקו על-ידי 4 סוגים של nanoprobes: AuNPs, AgNPs, IONPs ו- SiNPs.
הגורם הגברה שנצפו עבור כל ערכה של nanoprobes היה של 100-fold, למעט SiNPs שבו כימות של הגורם שיפור איננה אפשרית עקב חוסר שיפור קדם אותות. גורם שיפור זה מרמז כי היעילות של הפרוטוקול דומה בין כל סוגי nanoprobes. יתר על כן, כאשר פרוטוקול שיפור בוצעה על תמיכה נייר שבו הודפס סדרה דילול של השעיה AuNPs מניות, זה נצפתה גורם הגברה 10000-fold. הקודם כדי שיפור, המקומות גלוי עם המספר הנמוך ביותר של AuNPs היו בו הודפסו כ 10000 חלקיקים, לאחר שיפור המקומות הסתרת חלקיקים פחות מ- 10 הפך גלוי. 20
התנאים הוקמה עבור פרוטוקול שיפור שהוצגו כאן אפשרו ניצול של צמצום Au3 + Au0 לשיפור אותות, תוך שמירה על רעשי הרקע למינימום. ניתן לבצע השיפור אחרי וזמינותו מתבצע כמו גם על מיקרו-מערכים זה שהם אוחסנו עבור עד מספר חודשים לאחר וזמינותו בוצעה. הפתרון שיפור מורכבת תערובת 1:1 של פתרון 1 פתרון 2. שני פתרונות שניתן בעבר מעורב או מעורב ישירות כאשר pipetted על גבי microarray. ההבדל בין ערבוב מראש או ערבוב ישיר משפיע רק משך חיי המדף של הפתרון שיפור. כאשר טרום מעורב משך חיי המדף של 5-7 ימים גדל ל 30-45 ימים אם לא טרום מעורב.
ניתוח נוסף של התוצאות הראו כי שיטת שיפור אינה מפריעה ניתוח כמותי של החיישן. מתאם ליניארי בין עוצמת נצפתה ריכוז analyte היה מתוחזק (טבלה 1). הנתונים שהתקבלו עבור 4 דגימות קליניים מאופיין מראש באמצעות מתכלה microarray רכיב של אלרגן המבוסס על זכוכית, עם קרינה פלואורסצנטית רגילה איתור וזיהוי ערכי צבע מוחלטים, הראה קונקורדנציה טוב בין שתי השיטות לזיהוי. להשוות את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) ואת עוצמת ערכי צבע מוחלטים רשע (MCI), ממוצע R2 = 0.79 ± 0.08 היה מתקבל כאשר הנתונים הם 10 רשום על שני הצירים. הניסוי הראה כי שיטת שיפור ניתן להחיל על ערכה המסחרי אם משתמש את nanoprobes לצורך זיהוי או ניתן להתאים לצורך זיהוי מבוסס nanoprobe.
שיפור יעילות השיטה מסתמכת על שני היבטים קריטיים. זה חשוב להבטיח כי התערובת של פתרון 1, פתרון 2 הוא הומוגני. ללא תערובת הומוגנית, החיישן יהיה בקשר עם שברים של הפתרון שיפור איפה השולט לעומת השני פתרון 1 או 2. זה יקטין את היעילות של צמצום Au3 + Au0, ובכך לפגוע את היעילות של השיפור. חשוב גם שיהיה את כל שטח לטובת microarray בקשר עם הפתרון שיפור במהלך תקופת הדגירה.
כדי להשיג שיפור העדינה של אות, יידרש זמן דגירה ארוך (כ- 5 דקות) עם הפתרון שיפור. כדי למנוע ההתפתחות של רעש רקע זה יכול להתערב עם רכישת אות, השטח microarray צריך להיות שנחסם קודם לכן (למשל BSA, פג) כדי למנוע מהירה התצהיר לא ספציפי של יצירת0 והסוגר Au זהב שכבה.
מגבלה שיטת שיפור הוא מהותי היעילות של וזמינותו. וזמינותו מחייבת יש פקדים ואתאיזם המבטיחים שיפור האות נצפתה ניתן לייחס תוצאות אמת-חיוביות. אם יש שאינם ספציפיים ולאמוד nanoprobes עם המטרה, אותות רכשה לאחר שיפור לא יהיה חוקי.
טכניקות שיפור אחרות הן בהתאם גם צבירת ננו-חלקיק או ההגדלה של חלקיקים עם חומר המאפשר רכישת אות משופרת. באמצעות קידום הצטרפותם של מספר חלקיקים באתר זיהוי, רכישת אות ניתן יהיה גם מבחינה ויזואלית או מדידות UV-Vis. 5 טכניקות שיפור האות אלה מסתמכים על מערכת זיהוי שני שלבים, הגילוי הראשוני של analyte של עניין שלב שני שבו העיתונאית נדרשת כדי לאגד הבונה הזיהוי הראשוני. אסטרטגיות כאלה חסרי אוניברסאליות עקב הדרישה של שיפור מסוים פרוטוקול אופטימיזציה עבור כל סוג של וזמינותו.
טכניקות שיפור מוכתמים, כגון כסף מכתים, הרבה כמו פרוטוקול שהוצג כאן, לאפשר שיפור ישיר של המבנה זיהוי האות. עם זאת, בניגוד בפרוטוקול שמוצג כאן, צביעת כסף רק הוכח שיוחל או AuNPs או AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9
תחולתה של שיטה זו סביר יכול להקיף כל assay המשתמשת AuNPs, AgNPs, IONPs או SiNPs כסוכני זיהוי. עבודה נוספת מתבצעת ללמוד את היישום של השיטה סנסורים המורכב של חומרים אחרים.

השימוש של ננו-חומרים, כמו חלקיקי זהב (AuNPs) או חלקיקי תחמוצת ברזל (IONPs) אפשרה את היישומים ב- biosensing עם רגישות משופרים ורב-תכליתיות. 1 שפע של שיטות שפותחו עבור הקישוט של פני השטח של חלקיקים עם ליגנדים שונים, כדי לנצל את פני השטח גבוהה שלהם יחס נפח, אפשרו את העיצוב של חיישנים עם רגישות משופרת. 2 . עם זאת, כלי biosensing הוא תלוי מספר nanoprobes הדרוש להשגת אות לזיהוי. לדוגמה, במקרה של 40 ננומטר AuNPs, לרכוש אות באמצעות UV-vis ספקטרוסקופיה, כ nanoprobes6 × 10 90 נדרש כדי לזהות ביעילות ביעד של ריבית. 3 מגבלה זו צפיפות nanoprobe יכול שיפרו באמצעות הגברה של האות. אסטרטגיות כאלה4 יכול להתבסס על צבירת interparticle או הצטברות, שבו הצפיפות של nanoprobes הראשונית מתגברת על ידי צבירת קבוצה שנייה של nanoprobes השני. 5 הגדלת מספר חלקיקים במיקום נתון על משטח החיישן מאפשר חזותי או UV מול האות רכישה. עם זאת, הרגישות של וזמינותו תקושר מטבעו בהתאם לקיבולת מיקוד של הסט השני של חלקיקים כלפי הקבוצה הראשונית של nanoprobes. אסטרטגיות אחרות להסתמך על ההכתמה של nanoprobes או זהב וכסף. 6 , 7 ההכתמה מושגת באמצעות הפחתה בצריכת יוני כסף על גבי המשטח של חלקיקים, הפעלת של visual או לזיהוי UV-vis. 8 בשיטות אלה להגביר את האות של הקיים זהב או כסף nanoprobes על ידי potentiating פלזמון תהודה משטח את האות, לא בהתאם משני אירועים מיקוד כמו הצטברות interparticle שיטות. עם זאת, שיטות מכתימים כסף רק דווחו עם השימוש nanoprobes זהב או כסף. 8 , 9
בשנת 2005, Zayats et al. 10 דיווח ההפחתה של Au יונים על פני nanoprobes זהב כדי להגביר את האות תהודה פלזמון משטח. בעבודה זו תלויי-אנזים, מימן על-חמצני נוצר על ידי גלוקוז אוקסידאז זרז, יחד עם cetyltrimethylammonium כלוריד מותר ההפחתה של חומצה chloroauric.
לאחרונה וואנג ואח. דיווח על שיטת שיפור שבו נוצרת שכבת זהב על פני השטח של nanoprobes הקיים. 11 nanoprobes מוגדלת אלה מוצגים peroxidase כמו פעילות קטליטית נגד המצע 3′, 5, יונקות-tetramethylbenzidine (שוייץ) המאפשר את החזיית צבע כחול בהיר בעין בלתי מזוינת.
סטיבנס. et al. דיווח על התפתחות plasmonic assay מבוסס-אליסה. 12 לאחר זיהוי אנטיגן ספציפי הערמונית (PSA) באמצעות אסטרטגיה אליסה המסורתית, נוגדנים משניים המסומנת קטלאז, נדגרה בעזרת חיישן אחרי אשר החיישן היה שקוע פתרון המכיל מימן על-חמצני, חומצה chloroauric. הנוכחות של משני קטלאז-לאחרונה הנוגדן (תוצאה חיובית) תקדם את צריכת חמצן, מאט הפחתת חומצה chloroauric, מניב מעין כדורית monodispersed AuNPs עם צבע אדום. העדר של הנוגדן קטלאז-לאחרונה (תוצאה שלילית) אפשרה את ריכוז חמצן ללא פגע, ובכך לקדם את ההפחתה chloroauric מהירה, מניב AuNPs עם האחראי על צבע כחול/סגול ברורות וההקשר מורפולוגיות . ריכוז חמצן, נקבע על ידי פעילות קטלאז, הוצגה בקורלציה לריכוז analyte עניין. הצורך של נוגדנים משניים קטלאז-לאחרונה, השליטה של התנאים של פעילות קטליטית הם שני הגורמים המעכבים את האוניברסליות של שיטה זו. יתר על כן, היווצרות של אשכולות זהב, באופן עצמאי AuNPs קיימים, עשויים להציג נושאים רקע רעש את האסטרטגיה הגברה.
הטכניקות הנ ל, כמו גם כמה אחרים13,14,15, שהפכו עבור ביולוגיים מבוססי nanoprobe להשיג את הגבולות של זיהוי שוה עם טכניקות מסורתיות.
כאן, שיטה שיפור זהב הרומן הוא הפגין, איפה האות של nanoprobe הקיים מוגבר על-ידי שמגדיל יכולתו או היכרות עם אות תהודה פלזמון משטח. לאחר הזיהוי מתבצעת עם השימוש של זהב, כסף, סיליקה או חלקיקי תחמוצת ברזל, החיישן מותר דגירה עם פתרון של תערובת של מימן על-חמצני וחומצה chloroauric ב 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic (MES) חומצה pH 6 מאגר. הריכוזים של הרכיבים השונים הפתרון שיפור אופטימציה לטובת בתצהיר של Au0 על פני השטח של nanoprobes הקיים. עבור כל למד nanoprobe סוגי, כלומר. AuNPs, סילבר חלקיקים (AgNPs), חלקיקי סיליקה (SiNPs), IONPs, היווצרות רובד ברורות וההקשר הניב או augmented הפיזור של האור אשר הביא אות גלוי לזיהוי או מוגבר. עלייה אות עם גורם הגברה 100-fold הושג nanoprobes נייר, זכוכית מבוסס מיקרו-מערכים, התהליך לוקח פחות מ 5 דקות כדי לרכוש אות. רכישת אות יכול להיעשות על ידי בעין בלתי מזוינת, UV-vis ספקטרוסקופיה או הדמיה כלים זולים כגון מצלמה דיגיטלית או סורק שולחני. יתר על כן, הוכח כי פרוטוקול שיפור זה ניתן בקלות ליישם assay אבחון אלרגיה זמינים מסחרית ללא צורך אופטימיזציה ספציפיים.

<table><tbody><tr><td>Chloroauric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254169 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylaminoborane&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>476668 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Poly(acrylic acid, sodium salt)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>416037 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Silver nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204390 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>100 nm magnetic nanoparticles</td><td>Ademtech</td><td>021111</td><td></td></tr><tr><td>50 nm silica nanoparticles</td><td>Corposcular</td><td>140510-10</td><td></td></tr><tr><td>COOH-PEG-SH&amp;nbsp;</td><td>RAPP Polymere</td><td>135000-4-32</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.06462&amp;nbsp;EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&amp;rsquo;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03449&amp;nbsp;SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56485&amp;nbsp;ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95313 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>IgG antibody</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483&amp;nbsp;ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&amp;nbsp;SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>422351S</td><td></td></tr><tr><td>Protein G</td><td>Thermo Scientific</td><td>21193</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose paper membrane</td><td>Whatman</td><td>10402096</td><td></td></tr><tr><td>Nanoplotter 2.1 robotic printer</td><td>GeSIM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter holder</td><td>Merck</td><td>XX3001200</td><td></td></tr><tr><td>PhD2000 Ultrasyring pump</td><td>Harvard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-human IgE antibody-modified AuNPs&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning LuxScan 10/K</td><td>Capital Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro</td><td>Epson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid nanoprobe signal enhancement by in situ gold nanoparticle synthesis

השימוש nanoprobes כגון זהב, כסף, סיליקה או חלקיקי תחמוצת ברזל כמו ריאגנטים זיהוי במבחני וביו-אנליטיות וואלידציה יכול לאפשר רגישות גבוהה ולא נוחה readout ערכי צבע מוחלטים. עם זאת, צפיפות גבוהה של חלקיקים נדרשים בדרך כלל עבור זיהוי. הפרוטוקולים זמינים שיפור מבוסס-סינתזה או חלקיקים מוגבל של כסף וזהב, או להסתמך על שליטה מדויקת אנזימטי ואופטימיזציה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לשפר את המדידה ערכי צבע מוחלטים של זהב, כסף, סיליקה, תחמוצת ברזל nanoprobes. זה היה ציין כי האות ערכי צבע מוחלטים יכולים להשתפר על ידי עד גורם 10000-fold. הבסיס לאסטרטגיה שיפור כזה האות הוא צמצום הכימי Au3 + Au0. ישנם מספר תגובות כימיות המאפשרים צמצום Au3 + Au0. בפרוטוקול, יכולות buffers ו- H2O2 משמשים ויש אפשרות להעדיף בתצהיר של Au0 על פני nanoprobes הקיימים, ב לרעת של היווצרות של חלקיקי זהב חדש. הפרוטוקול מורכב הדגירה של microarray פתרון בהיקף של חומצה chloroauric ו- H2O2 ב 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה pH 6 מאגר בעקבות וזמינותו זיהוי מבוסס nanoprobe. ניתן להחיל את הפתרון שיפור נייר וחיישנים מבוססי זכוכית. יתר על כן, זה יכול לשמש immunoassays זמינים מסחרית כפי שמתואר על-ידי היישום של השיטה כדי microarray אלרגן המסחרי. התפתחות האות דורש פחות מ 5 דקות של דגירה עם הפתרון שיפור, המדידה יכול להיות מוערך על ידי בעין או התקנים רכישת התמונה זולים כמו סורק שולחני או מצלמה דיגיטלית.

לאחר assay מתבצעת, באמצעות nanoprobes כסוכני זיהוי, עשוי להיות מאוכלס האזור זיהוי חיישן עם nanoprobes (איור 1). אם המספר של nanoprobes מתחת למגבלה עבור זיהוי חזותי, זיהוי analyte, בתחילה, ייחשב השלילי. באמצעות פרוטוקול המובאת כאן (איור 1b), האות של nanoprobes זה potentiated על ידי החדרת רובד ברורות וההקשר של Au (איור 1c).
המבוסס על נייר מתכלה המיועדים זיהוי של חלבון G בוצע כדי להציג לראווה את האפקטיביות של פרוטוקול שיפור (איור 2). AuNPs, AgNPs, SiNPs ו IONPs היו ששינה עם נוגדנים IgG ו המשמש לאיתור סוכנים. מיקרו-מערכים נייר הוכנו וכן הדרגתי של מספר מולקולות חלבון G לכל מקום.
לאחר assay הוצאה לפועל, זה היה ציין כי IgG AuNPs שונה (IgG-AuNPs) היו מסוגלים לזהות יהיה נמוך ככל 2 מולקולות5 × 10 לכל נקודה (איור 2), IgG AgNPs שונה (IgG-AgNPs) היו מסוגלים לזהות יהיה נמוך ככל × 10 24 מולקולות לכל נקודה (איור 2c), IgG שונה IONPs (IgG-IONPs) היו מסוגלים לזהות נמוך ככל 2 מולקולות7 × 10 לכל נקודה (איור 2e) ולשנות IgG SiNPs (IgG-SiNPs) לא היו מסוגלים לספק אות חזותי ( איור 2g).
מאת המקננת על מיקרו-מערכים עם הפתרון שיפור, ניתן היה להגדיל את האות על ידי 100-fold בין כל סוגי חלקיקים בשימוש. במקרה של SiNPs, הפתרון שיפור שאפשר להתבונן אות שבו אין אות חזותי נצפתה ללא הפתרון שיפור (איור 22f 2d, b, ו- 2 h).
האפשרות של היישום של השיטה מתכלה המסחרי הקיים הוערך. השיפור בוצע בראגנטים microarray רכיב אלרגן המבוסס על זכוכית. סט של 4 לאמת, מאופיין סרום דגימות מחולים אלרגית הוערכו עם microarray (דוגמאות נקבעו כ- a, b, c ו- d). זיהוי fluorometric רגיל assay הזה נמשל מכתים עם אנטי-IgE הנקרא AuNPs ואחריו השיפור של האות (איור 3). לפני שיפור, אין כתמים אותרו על מיקרו-מערכים היכן הגילוי בוצע עם אנטי-IgE הנקרא AuNPs. לאחר שיפור, מספר נקודות היו גלויים בעין בלתי מזוינת, מטענו נרשמה על ידי תמונה דיגיטיזציה (איור 3). עם זיהוי פלורסצנטיות, מגוון רחב של מקומות היו זוהה (איור 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig1.jpg"> איור 1 . איור של השלבים microspot עובר מהגילוי analyte לאות משופרת. nanoprobes () שני נוגדנים-השתנה לאחר זיהוי analyte ותשמרו על microspot, (b) דגירה של microarray עם פרוטוקול שיפור וצמיחה עוקבות זרע-של נוגדן-השתנה nanoprobes ( microspot c) איפה גדל לגודל nanoprobes לאחר המקננת 5 דקות עם הפתרון שיפור. איור זה כבר dapted של דיאס ואח. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig2.jpg"> איור 2 . תמונה מורכבת של מיקרו-מערכים איתור של חלבון G. בצד השמאל של כל microarray הן microspots נצפתה לפני שיפור של זיהוי מתבצעת עם () IgG-AuNPs, (ג) IgG-AgNPs, (e) IgG-IONPs, (g) IgG-SiNPs. בצד ימין של כל microarray הן microspots לאחר שיפור של (b) IgG-AuNPs, (ד) IgG-AgNPS, (f) IgG-IONPs, (h) IgG-SiNPs. כל הריכוז של חלבון G היה שהופקדו על microarray דולר. חישוב של המספר של חלבון ש-g נעשתה על סמך ריכוז החלבון מודפס לכל microspot. איור זה כבר ממאמרו של דיאס ואח. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig3.jpg"> איור 3 . מיתאם בין עוצמת פלורסנט בעוצמה ערכי צבע מוחלטים השיג עבור מבחני מתבצעת עם וזמינותו אבחון האלרגיה מסחרי. כלומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית (MFI), כלומר עוצמת ערכי צבע מוחלטים (MCI) שנמדד עבור הגילוי של אלרגנים הדגימות a, b, c, ו ד כניסות הם נתוני יומן 10 הפך את המרווחים שבו נצפתה מתאם ליניארי בין שתי השיטות. עוצמת microspots נצפתה איתור בהתבסס על הנוגדן fluorophore-לאחרונה (Fluorophore-Ab) היא פליטת קרינה פלואורסצנטית. בהירות microspots נצפתה איתור בהתבסס על וזמינותו Ab-AuNPs הושג לאחר פרויקט את microarray, היפוך התמונה עם תוכנות ליצירת תמונות. מיקרו-מערכים מיועדים וכן triplicates אנכי עם פקדים חיובי לגילוי קרינה פלואורסצנטית בתחתית הימין הקיצוני. שלוש פינות אחרות משמשות להערכת התוכנה. תמונות נותחו בגווני 16 סיביות. איור זה כבר ממאמרו של דיאס ואח. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>R2 שיפור מוקדמת</td>
			<td>R2 אחרי שיפור</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNPs אג</td>
			<td>8.70E-01</td>
			<td>7.80E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>AgNPs אג</td>
			<td>9.10E-01</td>
			<td>9.60E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IONPs אג</td>
			<td>9.17E-01</td>
			<td>9.30E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>SiNPs אג</td>
			<td>-</td>
			<td>8.50E-01</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. R2 ערכים עבור זיהוי של חלבון G, מוקדמת, לאחר שיפור, באמצעות קבוצות שונות של חלקיקים. הערכים2 R התקבלו לאחר התאמת עוצמת המקומות עם הריכוז של analyte נמדד.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis at JoVE.com

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

בעבודה זו, מוצג עבור שיפור האות של biosensing nanoprobe מבוססי פרוטוקול. הפרוטוקול מבוסס על ההפחתה של חומצה chloroauric על פני nanoprobes הקיים המורכבים של זהב, כסף, סיליקה או חלקיקי תחמוצת ברזל.

שיפור האות Nanoprobe מהירה על ידי באתרו בתוך Nanoparticle זהב סינתזה

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

rapid-nanoprobe-signal-enhancement-situ-gold-nanoparticle

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Chemistry

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

7.5K Views.  KTH Royal Institute of Technology. בעבודה זו, מוצג עבור שיפור האות של biosensing nanoprobe מבוססי פרוטוקול. הפרוטוקול מבוסס על ההפחתה של חומצה chloroauric על פני nanoprobes הקיים המורכבים של זהב, כסף, סיליקה או חלקיקי תחמוצת ברזל.

Video: Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, a large infrastructure of immunoassay instruments and materials can be found. For example, 96- and 384-well polystyrene plates are available commercially and have a standard design to accommodate ultraviolet-visible (UV-Vis) spectroscopy machines from various manufacturers. In addition, a wide variety of immunoglobulins, detection tags, and blocking agents for customized immunoassay designs such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) are available.
Despite the existing infrastructure, standard ELISA kits do not meet all research needs, requiring individualized immunoassay development, which can be expensive and time-consuming. For example, ELISA kits have low multiplexing (detection of more than one analyte at a time) capabilities as they usually depend on fluorescence or colorimetric methods for detection. Colorimetric and fluorescent-based analyses have limited multiplexing capabilities due to broad spectral peaks. In contrast, Raman spectroscopy-based methods have a much greater capability for multiplexing due to narrow emission peaks. Another advantage of Raman spectroscopy is that Raman reporters experience significantly less photobleaching than fluorescent tags1. Despite the advantages that Raman reporters have over fluorescent and colorimetric tags, protocols to fabricate Raman-based immunoassays are limited. The purpose of this paper is to provide a protocol to prepare functionalized probes to use in conjunction with polystyrene plates for direct detection of analytes by UV-Vis analysis and Raman spectroscopy. This protocol will allow researchers to take a do-it-yourself approach for future multi-analyte detection while capitalizing on pre-established infrastructure.

Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.

בודה UV-Vis ראמאן ספקטרוסקופיה פלטפורמת Immunoassay

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Biochemistry

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

זהב Nanostar סינתזה עם שיטת Seed כסף מתווכת צמיחה

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Bioengineering

A Simple Method for the Size Controlled Synthesis of Stable Oligomeric Clusters of Gold Nanoparticles under Ambient Conditions

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like oligomeric clusters of these yellow nanoparticles of narrow size distribution are synthesized under ambient conditions via two methods. The delay-time method controls the number of subunits in the oligoclusters by varying the time between the addition of HAuCl4 to alkaline solution and the subsequent addition of reducing agent, NaSCN. The yellow oligoclusters produced range in size from ~3 to ~25 nm. This size range can be further extended by an add-on method utilizing hydroxylated gold chloride (Na+[Au(OH4-x)Clx]-) to auto-catalytically increase the number of subunits in the as-synthesized oligocluster nanoparticles, providing a total range of 3 nm to 70 nm. The crude oligocluster preparations display narrow size distributions and do not require further fractionation for most purposes. The oligoclusters formed can be concentrated &#62;300 fold without aggregation and the crude reaction mixtures remain stable for weeks without further processing. Because these oligomeric clusters can be concentrated before derivatization they allow expensive derivatizing agents to be used economically. In addition, we present two models by which predictions of particle size can be made with great accuracy.

We describe a simple method for producing highly stable oligomeric clusters of gold nanoparticles via the reduction of chloroauric acid (HAuCl4) with sodium thiocyanate (NaSCN). The oligoclusters have a narrow size distribution and can be produced with a wide range of sizes and surface coats.

שיטה פשוטה עבור סינתזת מבוקרת הגודל של אשכולות Oligomeric היציבים של זהב חלקיקים בתנאי סביבה

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like ...

Hydroquinone Based Synthesis of Gold Nanorods

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the synthetic methods for the preparation of gold nanorods are still not fully optimized. In this paper we describe a new, highly efficient, two-step protocol based on the use of hydroquinone as a mild reducing agent. Our approach allows the preparation of nanorods with a good control of size and aspect ratio (AR) simply by varying the amount of hexadecyl trimethylammonium bromide (CTAB) and silver ions (Ag+) present in the "growth solution". By using this method, it is possible to markedly reduce the amount of CTAB, an expensive and cytotoxic reagent, necessary to obtain the elongated shape. Gold nanorods with an aspect ratio of about 3 can be obtained in the presence of just 50 mM of CTAB (versus 100 mM used in the standard protocol based on the use of ascorbic acid), while shorter gold nanorods are obtained using a concentration as low as 10 mM.

This paper describes a protocol for the synthesis of gold nanorods, based on the use of hydroquinone as reducing agent, plus the different mechanisms for controlling their size and aspect ratio.

סינתזה הידרוקינון המבוססת של Nanorods הזהב

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

Microfabrication של דפוסי זהב Nanoporous לסלולרי מהותי מחקרי אינטראקציה

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen application of the method is the identification of rare mutations in circulating cell-free DNA from liquid biopsies, with a relevance in cancer diagnostics and stratification of oncological patients for personalized therapy. As a proof of concept, the test has been designed to detect the BRAFV600E mutation in the BRAF gene, which is important to identify the sub-group of melanoma patients that can benefit from targeted therapies with BRAF inhibitors. However, this colorimetric test can be easily generalized to other somatic mutations of clinical relevance due to the use of universal detection probes, thus providing strong potential in oncological diagnostics.
The test detects 0.5% of BRAFV600E in an excess of BRAFWT DNA, which matches the sensitivity of some commercial instrumental assays. Such sensitivity is clinically relevant for diagnostic purposes, allowing the early identification of drug-sensitive patients. In contrast to commercial assays based on real-time PCR, this test requires minimal instrumentation and processing, as it can be performed on DNA amplified with a standard PCR (or isothermal techniques) and provides a naked-eye readout with a one-tube reaction of a few steps in only one hour. At present, the test has been used only on synthetic DNA samples. However, the latter have been designed to mimic a real sample amplified from circulating cell-free DNA, to favor the translation of the test to clinical diagnostics.

This protocol permits the naked-eye identification of point mutated DNA in a 200-fold excess of wild type DNA molecules, by exploiting gold nanoparticles and paramagnetic microparticles.

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen ...

Gold Nanoparticle Synthesis

Gold nanoparticles (Au nanoparticles) that are ~12 nm in diameter were synthesized by rapidly injecting a solution of 150 mg (0.15 mmol) of tetrachloroauric acid in 3.0 g (3.7 mmol, 3.6 mL) of oleylamine (technical grade) and 3.0 mL of toluene into a boiling solution of 5.1 g (6.4 mmol, 8.7 mL) of oleylamine in 147 mL of toluene. While boiling and mixing the reaction solution for 2 hours, the color of the reaction mixture changed from clear, to light yellow, to light pink, and then slowly to dark red. The heat was then turned off, and the solution was allowed to gradually cool down to room temperature for 1 hour. The gold nanoparticles were then collected and separated from the solution using a centrifuge and washed three times; by vortexing and dispersing the gold nanoparticles in 10 mL portions of toluene, and then precipitating the gold nanoparticles by adding 40 mL portions of methanol and spinning them in a centrifuge. The solution was then decanted to remove any remaining byproducts and unreacted starting materials. Drying the gold nanoparticles in a vacuum environment produced a solid black pellet; which could be stored for long periods of time (up to one year) for later use, and then redissolved in organic solvents such as toluene.

A protocol for synthesizing ~12 nm diameter gold nanoparticles (Au nanoparticles) in an organic solvent is presented. The gold nanoparticles are capped with oleylamine ligands to prevent agglomeration. The gold nanoparticles are soluble in organic solvents such as toluene.

סינתזת חלקיקי זהב

Gold nanoparticles (Au nanoparticles) that are ~12 nm in diameter were synthesized by rapidly injecting a solution of 150 mg (0.15 mmol) of ...

מדידות SERS של מולקולה יחידה המופעלות על ידי ננו-אנטנות אוריגמי DNA פלסמוני

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) SERS is able to provide molecule-specific spectroscopic information about individual molecules and therefore yields more detailed chemical information than other SM detection techniques. At the same time, there is the potential to unravel information from SM measurements that remain hidden in Raman measurements of bulk material. This protocol outlines the SM SERS measurements using a DNA origami nanoantenna (DONA) in combination with atomic force microscopy (AFM) and Raman spectroscopy. A DNA origami fork structure and two gold nanoparticles are combined to form the DONAs, with a 1.2-2.0 nm gap between them. This allows an up to 1011-fold SERS signal enhancement, enabling measurements of single molecules. The protocol further demonstrates the placement of a single analyte molecule in a SERS hot spot, the process of AFM imaging, and the subsequent overlaying of Raman imaging to measure an analyte in a single DONA.

מחבר זרקור: מדידות פיזור ראמאן משופרות על פני השטח של מולקולה אחת המופעלות על ידי ננו-אנטנות אוריגמי DNA פלסמוני  

This protocol demonstrates single-molecule surface-enhanced Raman scattering (SERS) measurements using a DNA origami nanoantenna (DONA) combined with colocalized atomic force microscopy (AFM) and Raman measurements.

מדידות פיזור ראמאן משופרות על פני השטח של מולקולה אחת המופעלות על ידי ננו-אנטנות אוריגמי DNA פלסמוני

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) ...

שיפור האות Nanoprobe מהירה על ידי באתרו בתוך Nanoparticle זהב סינתזה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בודה UV-Vis ראמאן ספקטרוסקופיה פלטפורמת Immunoassay

זהב Nanostar סינתזה עם שיטת Seed כסף מתווכת צמיחה

שיטה פשוטה עבור סינתזת מבוקרת הגודל של אשכולות Oligomeric היציבים של זהב חלקיקים בתנאי סביבה

סינתזה הידרוקינון המבוססת של Nanorods הזהב

Microfabrication של דפוסי זהב Nanoporous לסלולרי מהותי מחקרי אינטראקציה

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

סינתזת חלקיקי זהב

מדידות פיזור ראמאן משופרות על פני השטח של מולקולה אחת המופעלות על ידי ננו-אנטנות אוריגמי DNA פלסמוני

מדידות פיזור ראמאן משופרות על פני השטח של מולקולה אחת המופעלות על ידי ננו-אנטנות אוריגמי DNA פלסמוני

מדידות פיזור ראמאן משופרות על פני השטח של מולקולה אחת המופעלות על ידי ננו-אנטנות אוריגמי DNA פלסמוני