Name: megakaryocyte differentiation and platelet formation from human cord blood-derived cd34+ cells
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells at JoVE.com

המחברים להכיר את התמיכה של בריאות אוסטרלי המועצה למחקר רפואי (פרויקט גרנט 1012409 קשורה BHC).

פרוטוקול זה אושר על ידי דרום מזרח סידני האנושי מחקר ועדת האתיקה, שאושררה על-ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי של האוניברסיטה של ניו סאות וויילס. דם טבורי שהושג מתורמים בריאים סופק על ידי סידני בנק דם טבורי (NSW, סידני, אוסטרליה). כרכים של 100 מ ל שימשו עבור הליך זה.
הערה: עבודה ב- cabinet באמצעות הטכניקה aseptic Class II אבטחה. Decontaminate החיצוני של שקית הדם טבורי עם 70% אתנול. להשתמש בכלים סטריליים (מספריים, פינצטה) עבור הליך זה.
1. כבל תאי הדם הכנה ובידוד של CD34 תאים+
<ol>
	<li>להכין את ההפרדה סטרילי מאגר (SB) בתמיסת פוספט buffered (PBS), ב- pH 7.2, המכילה 0.5% שור אלבומין ו- 2 מ מ EDTA.</li>
	<li>לוותר על 10 מ"ל של SB לתוך צינור חרוטי 50 מ ל (צינור אחד לכל 10 מ"ל של דם זה נדרש). באמצעות מחט בוטה G18 רכוב על מזרק 10 מ"ל, לצייר 10 מ"ל של דם מתוך התיק, לוותר על תוך הצינורות 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של SB.</li>
	<li>להוסיף 15 מ"ל של לימפוציטים ההפרדה מדיה (ראה טבלה של חומרים) לתחתית הצינור המכיל את הדם מדולל, יצירת שתי שכבות. הערה: לוותר על מדיה לאט בחלק התחתון של צינור כדי להימנע מערבוב הרבדים השונים.</li>
	<li>צנטריפוגה צינורות ב g × 1,200 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם בלי הפסקה, אין האצה.</li>
	<li>להעביר את השכבה ליד המרכז של הצינור המכיל תאי תאים (כ 5-10 מ"ל מהצינור כל) לתוך צינור 50 מ ל באמצעות פיפטה של פסטר. להוסיף SB כל שפופרת את הנפח הכולל של 50 מ.</li>
	<li>Centrifuge ב 400 g × 10 דקות ב RT. להשליך את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend תא כדורי בזהירות עם פיפטה פסטר ב 5-10 מ ל SB. לשלב את התאים מושעה ולהביא נפח 50 מ עם SB.</li>
	<li>ספירת תאים באמצעות צביעת Trypan blue ו- hemocytometer או אוטומטיות תא מונה (ראה טבלה של חומרים). כדי לקבוע את אחוז CD34+ תאים במדגם, resuspend 2.5 × 105 תאים µL 100 של SB, כתם על-ידי הוספת 10 µL של נוגדן anti-CD34-PE למשך 15-30 דקות ב 4 º C. ניתוח על ידי cytometry זרימה (איור 1 א').</li>
	<li>צנטריפוגה צינורות ב 400 g × 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע. הערה: אם לא מיידית, תאי תאי שיכול להיות קפוא בשלב זה.</li>
	<li>Resuspend תאים µL 300 של SB לכל 108 תאים. להוסיף 100 µL של ה-FcR האנושי IgG (חסימת ריאגנט, ראה טבלה של חומרים) ו- µL 100 של CD34 beads מגנטי לכל 108 תאים. לערבב בעדינות, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30-40 דקות. הערה: השעיה תא בודד נדרש (אם יש צורך, להעביר התאים למרות מסנן 30 מיקרומטר לפני הוספת ריאגנטים). השתמש את הכרכים ריאגנט המתוארים כאן עבור 108 תאים או פחות. עבור יותר מ-108 תאים, קנה המידה של ריאגנטים (SB, חסימת פתרון ולאחר beads מגנטי CD34) בהתאם.</li>
	<li>להכין את העמודה ההפרדה האם במהלך תקופת הדגירה על ידי הצבת העמודה LS בעל מגנטי כביסה עם 3 מ של SB. להשליך למסקנות. הערה: ניתן לטעון? האם ההפרדה עמודות עם תאים הכולל8 × 10 עד 2. עמודות קטן יותר, גדול יותר זמינים.</li>
	<li>להוסיף 5-10 מ ל SB לתערובת תא וזורקים צנטריפוגה ב 400 × g במשך 10 דקות את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend התאים ב- 1.5 מ ל SB וטען התליה תא (1.5 מ ל) אל העמודה LS. לאסוף את הזרימה המכילות את התאים ללא תווית בשפופרת איסוף 15מל (שבר שלילי #1). תן את הנוזל לרוקן ולשטוף את העמודה עם 1.5 מ ל SB.</li>
	<li>לטעון את הזרימה (3 מ"ל) שנאספו בחזרה לתוך העמודה ולאסוף את הזרימה לשפופרת אוסף 15 מ"ל זהה (שבר שלילי #1). לשטוף את העמודה LS 3 פעמים עם 3 מ"ל של SB. הערה: אם יש צורך, תאים השבר שלילי (12 מ ל) יכול להיות מוכתם נוגדן anti-CD34 לאמת לכידתו של CD34+ תאים לפי העמודה LS.</li>
	<li>הסר העמודה במפריד מגנטי ותורידי תאים לאט עם פומפה מזרק לתוך צינור 15 mL החדש עם 2 מ ל SB.</li>
	<li>במקום העמודה בחזרה על עומס mL 2 תאים ומפריד מגנטי בחזרה לתוך העמודה. לאסוף את הזרימה, לשטוף עם 2 מ ל SB. זהו השבר שלילי #2 (4 מ ל).</li>
	<li>הסר האם העמודה מפריד מגנטי ולהוסיף 2 מ"ל של תאים SB. סומק בהתמדה בנחישות עם פומפה מזרק כדי לאסוף את CD34+ תא שבר. לספור את התאים באמצעות trypan blue מכתים, hemocytometer או מונה תא אוטומטית.</li>
	<li>צנטריפוגה צינור עם השבר חיובי ב g × 400 למשך 15 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע. Resuspend תאים בתקשורת ללא סרום עבור CD34+ תאים (SFM, ראה טבלה של חומרים). הערה: אם לא מיידית, תאים שיכול להיות קפוא בחנקן נוזלי בשלב זה.</li>
</ol>
2. טוהר הסימון של CD34 מבודד התאים+
<ol>
	<li>כתם 2 x 104 תאים מן השבר חיובית עם נוגדן anti-CD34-PE µL, 20 µL נוגדן anti-CD45-PerCP למשך 15 דקות ב 4 ° C (שימוש נפרד צינור עבור פקדים isotype) 10 (איור 1B).</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של SB לשטוף. צנטריפוגה-400 g × עבור 10 דקות Resuspend צנפה ב 200 µL של SB.</li>
	<li>לבצע ניתוח תזרים cytometric, שער האוכלוסייה תא חי כדי לא לכלול פסולת (איור 1B). להגדיר את השער עבור אוכלוסיות חיובי PE ו- PerCP באמצעות PE ו- PerCP isotype שולטת (איור 1B), לקבוע את אחוזי CD34+/CD45+ תאים.</li>
</ol>
3. מגקריוציט בידול
<ol>
	<li>זרע 5 × 105 תאים למ"ל CD34+ תאי 2 מ של SFM בתוספת 50 ng/mL רקומביננטי האנושי thrombopoietin (rhTPO) לכל טוב בצלחת 12-. טוב. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 באווירה humidified. אם התאים נמצאים confluent לפני שהם נדרשים לניתוח, לקצור את התאים, התפצל ולס מרובים עם rhTPO ומדיה חדשה. הערה: צריך להיות מוכן בארות שניים או שלושה במיוחד כדי לפקח על בידול בנקודות זמן שונות (למשל, ימים 7, 9 ו-10).</li>
	<li>קציר תאים מן הבארות להפריש לפקח בידול מבלי להפריע התאים הבארות אחרים.</li>
	<li>כתם תאים עם נוגדן anti-GPIIb/CD41-FITC 20 µL, 10 µL, אנטי-GPIX/CD42a-Alexa עבור חיל הים 647 נוגדן באמצעי אחסון הסופי של µL 100. הגדר פקד צינור באמצעות נוגדנים שליטה isotype בהתאמה. תקופת דגירה של 15-30 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של SB לשטוף.</li></ol>צנטריפוגה-400 g × עבור 10 דקות להשליך תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- 200-300 µL של נתח SB. על ידי cytometry זרימה.
	<li>עבור כל fluorophore, לנתח את הפקדים isotype כדי להגדיר את gating לאוכלוסיות חיובית FITC, אלכסה הקמח 647. לנתח את הדגימות תא מוכתם כדי לקבוע את אחוז CD41+/CD42a+ להכפיל תאים חיובית, אשר מייצג את ח"כ בוגרת (איור 1C).</li>
	<li>להמחשת מיקרוסקופי של תאים סמני פני כתם תאים כמתואר ב- 3.3.<ol>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של SB לשטוף. צנטריפוגה-400 g × עבור 10 דקות Resuspend בגדר 100 µL של SB, ספין על זכוכית-1000 g x עבור 5 דק תאים תיקון בשקופית על-ידי טבילה ב מתנול 30 ס' אוויר יבש, להוסיף 20 µL של טעינת המדיה המכילה דאפי (ראה טבלה של חומרים) , מכסים עם coverslip ולאחר להמחיש באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 א).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>עבור ויזואליזציה של אנטיגנים תאיים, resuspend תאים ב- PBS ותקן עם paraformaldehyde (ריכוז סופי 1%) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. כדי permeabilize את התאים, להוסיף טריטון-X 100 (0.1%), תקופת דגירה של תאים 15 דקות לשטוף עם 2 מ"ל PBS/0.1% טריטון-X 100. Resuspend ב µL 100 של PBS/0.1% טריטון-X 100, להוסיף אנטי-vWf, אנטי CD62p נוגדנים (דילול 1:200), תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.<ol>
		<li>לשטוף עם טריטון PBS/0.1% 2 מ ל- X 100, צנטריפוגה ב 400 g × 10 דקות, resuspend ב µL 100 באותו מאגר ולהוסיף העכבר אנטי איג-Alexa 594 וארנבת אנטי-488 IgG-Alexa (1: 100). תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף עם טריטון PBS/0.1% 2 מ ל- X 100, resuspend ב µL 100 באותו מאגר ולהוסיף 20 µL של אנטי-CD42b-APC. ואז לסובב את התאים על גבי מדרון זכוכית כפי שמתואר בשלב 3.6.1, הכנת דוגמאות להמחשת מיקרוסקופיים כפי שמתואר בשלב 3.6.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>עבור פלואידיות נחישות, הקציר תאים ב ימים 12 או 13 של בידול. להוסיף 1 מ"ל של SB לשטוף. צנטריפוגה ב 400 × g 10 דקות, הכתם עם נוגדן anti-GPIIb/CD41-FITC µL 20 בנפח סופי של 100 µL. Incubate ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.<ol>
		<li>לשטוף פעם עם 1 מ"ל של SB, resuspend צנפה ב- 300 µL של ציטראט היפוטוניק מאגר (1.25 מ"מ סודיום ציטרט, 2.5 מ מ נתרן כלורי, 3.5 מ מ דקסטרוז) המכיל 20 µg/ml propidium יודיד ל- 0.05% 100 טריטון-X. תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 ° C מוגן מפני אור.</li>
		<li>להוסיף RNase ריכוז סופי של 20 µg/mL, תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 ° C מוגן מפני אור. לקבוע את עוצמת יודיד propidium על ידי cytometry זרימה על ידי איסוף אירועים 30,000 כדי 50,000 מכלל האוכלוסייה CD41-FITC+ (איור 2C).</li>
	</ol>
	</li>

4. proplatelet סופרים, ספירת טסיות, והפעלה טסיות
<ol>
	<li>הקציר תאים (מתוך שלב 3.1) ב ימים 8 או 9 של בידול, זרע-1 × 104 תאים/טוב ב- 48-ובכן הצלחות µL 200 של SFM טרי בתוספת 50 ננוגרם למ"ל rhTPO. תרבות במשך 5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2- הערה: לצורך כימות, זרע בארות דולר. צפיפות נמוכה זה נדרש עבור ויזואליזציה, ספירת proplatelet מניבי קרונית דחיפה קלה Proplatelets בדרך כלל מתחילים להופיע לאחר יומיים של תרבות. הפסגה היא בין ימים 4 ו- 5.</li>
	<li>לספור את מספר proplatelet מניבי ח"כ בבאר שלם על מיקרוסקופ אור הפוך באמצעות 10 X או מטרות X 20. הערה: שלב מיקרוסקופ מחוממת (37 מעלות צלזיוס) היא עדיפה, מאז להשאיר את התאים בטמפרטורת החדר לתקופה ממושכת גורמת הצטמקות של הרחבות proplatelet. Proplatelets הם נצפו כהרחבות ארוך מהגוף MK. כל ח"כ ייתכן כמה בליטות proplatelet. כפי proplatelets לפתח, הגוף של ח"כ הקטנת גודל.</li>
	<li>קציר תאים, צנטריפוגה ב 400 x g 10 דקות בטמפרטורת החדר. כתם תאים עם נוגדן אנטי-האדם CD41-FITC µL 20, כפי שתואר בשלבים 3.3 ו- 3.4. לחשב את האחוזים של ח"כ מניבי proplatelet (pbMK): pbMK (%) = [(Proplatelet מניבי חברי כנסת/טוב) / (סה כ CD41+ תאים / טוב)] x 100</li>
	<li>כדי לספור טסיות שוחרר לתוך המדיום תרבות, בעדינות לערבב את התאים עם פיפטה פסטר ולאסוף 100 µL ימים 14 או 15 של תרבות.<ol>
		<li>כתם עם נוגדנים CD41-FITC נגד µL 20 למשך 20-30 דקות ב 4 º C. להגדיר את צינור שליטה באמצעות הנוגדן שליטה isotype בהתאמה.</li>
		<li>להוסיף 150 µL של SB ו 50 µL של ספירת חרוזים.</li>
		<li>לניתוח cytometric זרימה, הגדר את FSC ואת האס על סולם לוגריתמי. שימוש רגיל האנושית טסיות דם של טסיות דם עשיר פלזמה מוכתמים CD41-FITC כמתואר בסעיף 4.4.1 כדי להגדיר את דרך השער של טסיות הדם (איור 3 א).</li>
		<li>לנתח את טסיות הדם ויטראז'ים עם סופר חרוזים מאת cytometry זרימה. לאסוף 1,000 אירועים של ספירת חרוזים באמצעות את FSC מול מגרש פיזור האס (איור 3 א). לחשב את מספר טסיות בהתבסס על CD41-FITC חיובי אירועים (איור 3B) תוך שימוש בנוסחה: טסיות לכל µL = [(מספר אירועים חיוביים CD41-FITC)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/לדגום נפח)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>כדי לנתח טסיות הפעלה, בעדינות לערבב את התאים עם פיפטה פסטר ולאסוף 100 µL ימים 14 או 15 של תרבות. להוסיף 1 מ"ל של מאגר (137 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, MgCl 1 מ2, 1.8 מ"מ CaCl2, 0.2 מ מ נה2HPO4, 12 מ מ NaHCO3, 5.5 מ מ D-גלוקוז, pH 6.5) של Tyrode, צנטריפוגה g x 200 עבור 5 דקות כדי הצניפה תאים.<ol>
		<li>לאסוף את תגובת שיקוע צנטריפוגה ב g 800 x 10 דקות הצניפה חלקיקים בגודל טסיות.</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע, resuspend ב µL 100 מאגר של Tyrode. להוסיף 20 µL של נוגדן PAC1-FITC, אדנוזין diphosphate (ADP) ריכוז סופי של 20 מיקרומטר. Incubate בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות נתח מאת cytometry זרימה כדי לקבוע את אחוז FITC אירועים חיוביים. טסיות דם אנושי טרי לשימוש מטופלים באופן זהה כפקד חיובי (איור 3C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nakeff, A., Maat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+megakaryocytes+from+mouse+bone+marrow+by+velocity+sedimentation.">Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation.</a> Blood. 43 (4), 591-595 (1974).</li><li>Zeigler, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+megakaryocytopoietic+and+thrombopoietic+activity+of+c-mpl+ligand+(TPO)+on+purified+murine+hematopoietic+stem+cells.">In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells.</a> Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).</li><li>Reems, J. -. A., Pineault, N., Sun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Megakaryocyte+Production+and+Platelet+Biogenesis:+State+of+the+Art.">In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).</li><li>Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+generated+in+vitro+from+proplatelet-displaying+human+megakaryocytes+are+functional.">Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional.</a> Blood. 85 (2), 402-413 (1995).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monopartite+sequence+is+essential+for+p45+NF-E2+nuclear+translocation,+transcriptional+activity+and+platelet+production.">A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production.</a> J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).</li><li>Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+primary+human+CD34+CD38lo+cells+differentiating+along+the+megakaryocyte+lineage.">Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage.</a> Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).</li><li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+universal+platelets+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).</li><li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+megakaryocyte+differentiation+of+fresh+and+ex-vivo+expanded+cord+blood+cells:+rapid+and+transient+megakaryocyte+reconstitution.">In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution.</a> Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).</li><li>Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+thrombocytopenia:+antiplatelet+autoantibodies+inhibit+proplatelet+formation+by+megakaryocytes+and+impair+platelet+production+in+vitro.">Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro.</a> Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).</li><li>Lev, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+proplatelet+formation+in+immune+thrombocytopenia:+a+novel+mechanism+contributing+to+decreased+platelet+count.">Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count.</a> Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).</li><li>Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+generating+platelet-like+fragments+from+megakaryocytic+cell+lines+and+human+progenitor+cells.">A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells.</a> Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).</li><li>Lu, S. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+generated+from+human+embryonic+stem+cells+are+functional+in+vitro+and+in+the+microcirculation+of+living+mice.">Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice.</a> Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).</li><li>Moreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+megakaryocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+by+chemically+defined+forward+programming.">Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming.</a> Nature Commun. 7, 11208 (2016).</li><li>De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+of+megakaryocyte+progenitor+cells:+cord+blood+versus+mobilized+peripheral+blood.">Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood.</a> Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).</li><li>Nimgaonkar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+population+of+CD34++cells+in+cord+blood.">A unique population of CD34+ cells in cord blood.</a> Stem cells. 13 (2), 158-166 (1995).</li><li>Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+proplatelet+elaboration.">Mechanics of proplatelet elaboration.</a> J Thromb Haemost. 5, 18-23 (2007).</li><li>Matsunaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+large-scale+generation+of+human+platelets+from+cord+blood+CD34++cells.">Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells.</a> Stem cells. 24 (12), 2877-2887 (2006).</li><li>Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+continuous+in+vitro+human+platelet+production+using+three-dimensional+scaffolds.">Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds.</a> Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).</li><li>Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+ex+vivo+expansion+of+megakaryocytes+from+human+cord+blood+CD34+-enriched+cells+in+the+presence+of+thrombopoietin+and+limiting+amounts+of+stem+cell+factor+and+Flt-3+ligand.">Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).</li><li>Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+megakaryocytes+do+not+complete+maturation,+as+indicated+by+impaired+establishment+of+endomitosis+and+low+expression+of+G1/S+cyclins+upon+thrombopoietin-induced+differentiation.">Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation.</a> Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).</li><li>Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+Immune+Thrombocytopenia.">Drug-induced Immune Thrombocytopenia.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).</li><li>Stasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+thrombocytopenic+purpura:+Current+concepts+in+pathophysiology+and+management.">Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management.</a> Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן מתאימה לייצור עקבית של ח"כ ולבנים וטסיות דם בתרבות של דם טבורי. תאים אלה ניתן ללמוד תהליכים שונים כגון ההשפעה של תרופות או פעילויות ביולוגיות על ח כ התפשטות, בידול, היווצרות proplatelet וייצור טסיות.
מגוון רחב של שילובים ציטוקין ומדיה תרבות הוצגו בספרות. תוספ?...

בידוד של מספרים נאותה של ראשי megakaryocytes האנושית (ח"כ) לשימוש מעבדה רגיל הוא לא ריאלי עקב שלהם בתדר נמוך במח העצם, שבו הם מהווים ~0.01% של תאים nucleated1. חלופה נוחה היא הרחבה שמחוץ הבידול של גזע hematopoietic, ובתאים בנוכחות גורמי גדילה ספציפי. מספר של ציטוקינים כולל גורם לתאי גזע (SCF; ליגנד c-kit), אינטרלויקין (IL)-3 ו- IL-11 היו מועסקים במערכות תרבות לייצר מק ש. Thrombopoietin (TPO) היא הגורם היעיל ביותר בהתפתחותם עבור תרבויות megakaryocytic הוא יעיל לבד או עם אחרים ציטוקינים, כגון SCF ו- IL-32. TPO יכול לפעול על תאי גזע אוכלוסיות את התוצאה התפשטות וגם ההבשלה של חברי כנסת2.
ח"כ טסיות התוצרת מן בליטות cytoplasmic שנקרא proplatelets, אין ויוו, כ עונה 1 פרק 1011 טסיות הם יצרו מדי יום כדי לקיים את ספירת טסיות של 150-400 x 109/L. טסיות ייצור במבחנה הוא עד 1000 -מקפלים נמוך יותר מאשר ה- ויוו הערכות3, זה נתן עלייה לתנאים תרבות רבים באמצעות CD34+ ובתאים hematopoietic כדי לשפר את ח"כ, טסיות ייצור במבחנה. המקור הראשוני של CD34+ התאים המשמש ח"כ בידול היה דם היקפיים אנושי4. מקורות תא אחרים כוללים את מח העצם5,6, עובריים תאי גזע/המושרה pluripotent תאי גזע (ESC/iPSC)7הטבור דם (UCB)8,9,10 . מח עצם האדם CD34+ 11 ו העכבר שושלת היוחסין שלילי מח עצם תאים5 התוצרת ח"כ ולבנים וטסיות דם בתוך חוץ גופית; ובכל זאת, חוסר זמינות של מח עצם האדם מגביל את השימוש בו כמקור CD34+ תאים. לעומת זאת, ESC, iPSC מייצגים מקור מוגבל של תאים עבור ייצור טסיות במבחנה . טסיות ייצור של תאים אלה דורש מזין תאים תאים OP9 מאתר ו תקופות ארוכות יותר של תרבות. טסיות נגזר בתנאים ללא מזין להיראות פחות פונקציונלי12. טסיות נגזר iPSC נוטים להיות השימוש בהגדרות קליני מאז הם ניתן להרחיב בקנה מידה גדול. תהליך זה דורש lentiviral בתיווך התמרה חושית של גורמי שעתוק, תא לטווח ארוך תרבות13.
UCB הוא מקור נגיש של CD34+ התאים יכולה בקלות לשמש מחקר הגדרות. TPO לבד יכול לקדם את הבידול של כבל דם-derived CD34+ תאים וזה מעורר חברי כנסת מאוד טהור, בוגר ללא צורך תוספי סרום או תרבות משותפת עם מזין תאים. ציטוקינים אחרים כגון SCF עשויה להקטין בידול מ- UCB CD34+ תאים, בעוד ליגנד Flt-3 ו- IL-11 לקדם את הייצור של ילדותי megakaryocytes14. פרוטוקול זה מתאר את הייצור של תרבויות ח"כ מאוד טהור של דם טבורי CD34+ תאים בתנאים ללא סרום.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cell Culture Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TPO</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9605</td><td>Serum-free media for CD34+ cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;CD34 Isolation Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead kit ultrapure</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12).</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies</td><td>1114545</td><td>Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL)</td></tr><tr><td>Sterile separation buffer (SB)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Flow Cytometry and Cell Staining Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>340669</td><td>Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution.</td></tr><tr><td>PerCP mouse anti-human CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>347464</td><td>1:10 dilution</td></tr><tr><td>PerCP isotype control</td><td>BD Biosciences</td><td>349044</td><td>1:10 dilution</td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-Human CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>340929</td><td>Final antibody concentration 1:5 dilution.</td></tr><tr><td>APC Mouse anti-Human CD42b</td><td>BD Biosciences</td><td>551061</td><td>This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1227A647T</td><td>Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA928A647</td><td>Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody</td></tr><tr><td>Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>V450 mouse anti-humna CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>58425</td><td>1: 20 dilution</td></tr><tr><td>V450 isotype control</td><td>BD Biosciences</td><td>580373</td><td>1:20 dilution</td></tr><tr><td>PAC1-FITC antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>340507</td><td>1:10 dilution</td></tr><tr><td>Anti CD62p mouse monoclonal</td><td>Abcam</td><td>AB6632</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11020</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>Ig Isotype Control cocktail-C</td><td>BD Biosciences</td><td>558659</td><td>Isotype control antibody</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>C36950</td><td>Counting beads</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Smaller and larger columns are also commercially available</td></tr><tr><td>MidiMACS Separator magnet</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile</td><td>In Vitro technologies</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Mounting media with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Antifade mounting medium with DAPI</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Leica</td><td>DMIRB inverted microscope</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Zeiss</td><td>Vert.A1</td><td></td></tr><tr><td>Cell analyser</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>Cytospin 4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell analyser software</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Diva Software</td><td></td></tr><tr><td>Single cell analysis software</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope software</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2 blue edition</td><td></td></tr></tbody></table>

megakaryocyte differentiation and platelet formation from human cord blood-derived cd34+ cells

ייצור טסיות מתרחשת בעיקר במח העצם על תהליך המכונה thrombopoiesis. במהלך thrombopoiesis, להבדיל hematopoietic ובתאים כדי מבשרי טסיות טופס שנקרא megakaryocytes, אשר להבדיל סופני לשחרר טסיות דם מן התהליכים זמן cytoplasmic כינה proplatelets. Megakaryocytes הם נדירים תאים מוגבל במח העצם, ולכן הם קשים לקצור או מספיקים לשימוש מעבדה. ייצור יעיל של megakaryocytes האנושית יכולה להיות מושגת במבחנה מאת culturing CD34+ תאים בתנאים מתאימים. פרוטוקול מפורט כאן מתאר בידוד של CD34+ תאים על-ידי תא מגנטי מיון של דגימות דם חבל הטבור. מתוארים הצעדים הדרושים כדי לייצר megakaryocytes מאוד טהור, בוגרת בתנאים ללא סרום. הפרטים של ניתוח פנוטיפי של בידול מגקריוציט והנחישות של היווצרות proplatelet וייצור טסיות הינם גם מסופקים. ניתן להוסיף effectors המשפיעים על בידול מגקריוציט ו/או היווצרות proplatelet, כגון נוגדנים נגד טסיות או מימטיקה thrombopoietin, תאים בתרבית לבחון תפקוד ביולוגי.

פרוטוקול זה מאפשר הכנת תרבויות ח"כ הטהור מאד מכבל דם-derived CD34+ תאים. האחוז של CD34+ תאים כבל דם הוא כ 1.3%15 (איור 1 א') ואת המספר הכולל של תאי תאי (שלב 1.8) נע בין 90-300 x 106 ליחידה UCB. טוהר CD34 + CD45 + תאים לאחר בידוד נעה בין 90 ל 99% (איור...

Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells at JoVE.com

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

אוכלוסיה מאוד טהור של megakaryocytes ניתן להשיג כבל דם-derived CD34+ תאים. שיטה CD34+ בידוד תאית התמיינות מגקריוציט מתואר כאן.

מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל CD34 נגזר דם תאים+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

19.6K Views.  University of New South Wales. אוכלוסיה מאוד טהור של megakaryocytes ניתן להשיג כבל דם-derived CD34+ תאים. שיטה CD34+ בידוד תאית התמיינות מגקריוציט מתואר כאן.

Video: Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine induced differentiation of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells to the four myeloid lineage cells. CD34+ cells are isolated from human umbilical cord blood and co-cultured with MS-5 stromal cells in the presence of cytokines. Immunophenotypic characterization of the stem and progenitor cells, and the differentiated myeloid lineage cells are described. Using this protocol, CD34+ cells may be incubated with small molecules or transduced with lentiviruses to express myeloid disease mutations to investigate their impact on myeloid differentiation.

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Here, we present a protocol for immunophenotypic characterization and cytokine induced differentiation of cord blood derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells to the four myeloid lineages. The applications of this protocol include investigations on the effect of myeloid disease mutations or small molecules on myeloid differentiation of the CD34+ cells.

פאן-מיאלואיד הבידול של האדם כבל דם נגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Developmental Biology

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through megakaryopoiesis. The final stages of this process are complex and classically involve the bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) and the unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). These populations precede the formation of bona fide megakaryocytes and, as such, their isolation and characterization could allow for the robust and unbiased analysis of megakaryocyte formation. This protocol presents in detail the procedure to collect hematopoietic cells from mouse bone marrow, the enrichment of hematopoietic progenitors through magnetic depletion and finally a cell sorting strategy that yield highly purified MEP and MKp populations. First, bone marrow cells are collected from the femur, the tibia, and also the iliac crest, a bone that contains a high number of hematopoietic progenitors. The use of iliac crest bones drastically increases the total cell number obtained per mouse and thus contributes to a more ethical use of animals. A magnetic lineage depletion was optimized using 450 nm magnetic beads allowing a very efficient cell sorting by flow cytometry. Finally, the protocol presents the labeling and gating strategy for the sorting of the two highly purified megakaryocyte progenitor populations: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) and MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright). This technique is easy to implement and provides enough cellular material to perform i) molecular characterization for a deeper knowledge of their identity and biology, ii) in vitro differentiation assays, that will provide a better understanding of the mechanisms of maturation of megakaryocytes, or iii) in vitro models of interaction with their microenvironment.

This method describes the purification by flow cytometry of MEP and MKp from mice femurs, tibias, and pelvic bones.

בידוד אבות מקרוציטים עכבר

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

Biology

Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation

The in vitro expansion and differentiation of human hematopoietic progenitors into megakaryocytes capable of elongating proplatelets and releasing platelets allows an in-depth study of the mechanisms underlying platelet biogenesis. Available culture protocols are mostly based on hematopoietic progenitors derived from bone marrow or cord blood raising a number of ethical, technical, and economic concerns. If there are already available protocols for obtaining CD34 cells from peripheral blood, this manuscript proposes a straightforward and optimized protocol for obtaining CD34+ cells from leukodepletion filters readily available in blood centers. These cells are isolated from leukodepletion filters used in the preparation of blood transfusion products, corresponding to eight blood donations. These filters are meant to be discarded. A detailed procedure to collect hematopoietic progenitors identified as CD34+ cells from these filters is described. The method to obtain mature megakaryocytes extending proplatelets while discussing their phenotypic evolution is also detailed. Finally, the protocol present a calibrated pipetting method, to efficiently release platelets that are morphologically and functionally similar to native ones. This protocol can serve as a basis for evaluating pharmacological compounds acting at various steps of the process to dissect the underlying mechanisms and approach the in vivo platelet yields.

This protocol describes in detail all the steps involved in obtaining leukofilter-derived CD34+ hematopoietic progenitors and their in vitro differentiation and maturation into proplatelet-bearing megakaryocytes that are able to release platelets in the culture medium. This procedure is useful for in-depth analysis of cellular and molecular mechanisms controlling megakaryopoiesis.

תאי CD34+ שמקורם במסנני לויקודלציה כמקור לתא לחקר בידול מגהקריוציט והיווצרות טסיות דם

The in vitro expansion and differentiation of human hematopoietic progenitors into megakaryocytes capable of elongating proplatelets and releasing ...

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and extremely large cell (40-60 &#181;m). As opposed to the fast-increasing knowledge in megakaryopoiesis at the cell biology and molecular level, the characterization of megakaryopoiesis by flow cytometry is limited to the identification of mature MKs using lineage-specific surface markers, while earlier MK differentiation stages remain unexplored. Here, we present an immunophenotyping strategy that allows the identification of successive MK differentiation stages, with increasing ploidy status, in human primary sources or in vitro cultures with a panel integrating MK specific and non-specific surface markers. Despite its size and fragility, MKs can be immunophenotyped using the above-mentioned panel and enriched by fluorescence-activated cell sorting under specific conditions of pressure and nozzle diameter. This approach facilitates multi-Omics studies, with the aim to better understand the complexity of megakaryopoiesis and platelet production in humans. A better characterization of megakaryopoiesis may pose fundamental in the diagnosis or prognosis of lineage-related pathologies and malignancy.

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Here, we present an immunophenotyping strategy for the characterization of megakaryocyte differentiation, and show how that strategy allows the sorting of megakaryocytes at different stages with a fluorescence-activated cell sorter. The methodology can be applied to human primary tissues, but also to megakaryocytes generated in culture in vitro.

אימונופנוטיפינג ומיון תאים של חברי כנסת אנושיים ממקורות ראשוניים אנושיים או מובחנים במבחנה מאבות ההמטופיאטיים

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and ...

<meta charset="utf8"></head><body>מידול אריתרופואיזיס באמצעות HSPCs מדם טבורי ומח עצם

A Comprehensive Pipeline to Assess the Efficiency of Human Erythropoiesis In Vitro and Ex Vivo

Erythropoiesis, a remarkably dynamic and efficient process responsible for generating the daily quota of red blood cells (approximately 280 &plusmn; 20 billion cells per day), is crucial for maintaining individual health. Any disruption in this pathway can have significant consequences, leading to health issues. According to the World Health Organization, an estimated 25% of the global population presents symptoms of anemia. This protocol describes how to generate human erythroid cells both in vitro using hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from sources such as umbilical cord blood (UCB) or blood taken from healthy donors and ex vivo with HSPCs isolated from patients' bone marrow. Using genetic approach, genes of interest can be modulated in HSPCs, and their impact on erythropoiesis can be monitored at various stages of the differentiation process. This method allows for the screening of compounds perturbing, enhancing, or rescuing the capacity of HSPCs to differentiate into mature erythroid cells and to investigate the role of genes of interest during the erythroid differentiation process.

<meta charset="utf8"></head><body>זרקור המחבר: קידום מחקר אריתרופואיזיס - צינור פשוט להערכת תפקוד תאי גזע המטופויאטיים בתסמונות מיאלודיספלסטיות

Modeling erythropoiesis provides a valuable chance to comprehend the biological significance of actors in this process and to evaluate novel therapeutic approaches that may alleviate differentiation defects. Here, we describe a simple and reliable method to efficiently differentiate CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells ex vivo.

צינור מקיף להערכת היעילות של אריתרופואיזיס אנושי במבחנה ובחוץ גופית

Erythropoiesis, a remarkably dynamic and efficient process responsible for generating the daily quota of red blood cells (approximately 280 &plusmn; 20 ...

מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל CD34 נגזר דם תאים⁺

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

יישום קליני של

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

פאן-מיאלואיד הבידול של האדם כבל דם נגזר CD34⁺ המטפאות גזע ותאים מחולל

בידוד אבות מקרוציטים עכבר

תאי CD34+ שמקורם במסנני לויקודלציה כמקור לתא לחקר בידול מגהקריוציט והיווצרות טסיות דם

אימונופנוטיפינג ומיון תאים של חברי כנסת אנושיים ממקורות ראשוניים אנושיים או מובחנים במבחנה מאבות ההמטופיאטיים

צינור מקיף להערכת היעילות של אריתרופואיזיס אנושי במבחנה ובחוץ גופית

צינור מקיף להערכת היעילות של אריתרופואיזיס אנושי במבחנה ובחוץ גופית