Name: enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain at JoVE.com

המחברים מודים ד"ר ג'ים בורסי, אלן Levey, היחידה לנוירולוגיה של אמורי, על הערות מועילות והצעות. עבודה זו מומן בחלקו על ידי האצת שותפות רפואה המענק (U01AG046161-02), אמורי האלצהיימר של מרכז המחקר של המחלה (P50AG025688) ואת הלאומי להזדקנות הענק (R01AG053960-01) ל- N.T.S. מחקר זה גם נתמך בחלקה על ידי הגרעין Neuropathology של המענק אמורי Neuroscience NINDS הליבה מתקנים, P30NS055077.

אתיקה במשפט: לכל רקמות מוח, התקבלו האלצהיימר אמורי &#39; s מחלות מחקר במרכז (ADRC) המוח הבנק. רקמות לאחר המוות נרכשו תחת פרוטוקולים לוח סקירה מוסדיים (IRB) תקין.
 1. המגון ו Fractionation <ol><li>רקמות הבחירה הערה: קפוא רקמות לאחר המוות החזיתית מ בקרה בריאים (Ctl), באופן פתולוגי מקרים מאושרים של המודעה נבחרו מתוך אמורי ADRC המוח הבנק (n = 2). הערכה neuropathological פוסט-מורטם של הפצה פלאק עמילואיד בוצעה על פי האיחוד להקים רישום עבור אלצהיימר &#39; s המחלה למחצה כמותיים ניקוד קריטריונים 24, למרות סבך neurofibrillary פתולוגיה הוערך לפי מערכת הזמני braak. 16 <ol><li>קבל קפוא רקמת המוח לאחר המוות מ בקרה בריאים (Ctl), באופן פתולוגי לספירה מקרים מאומתים. ניצול מיכלים של קרח יבש, מלקחיים, סכין גילוח, בלו ~ 250 מ"ג חלקים של החומר האפור של כל דגימה רקמה על הפנויה tared שוקל סירות, לטפל כדי למנוע את הרקמה מפשיר. להקליט את המשקל של כל פיסת להיות הומוגני.</li>
		<li>בלו ~ 250 מ"ג של החומר האפור באמצעות מלקחיים, גילוח על-ידי בדיקה חזותית כדי לאתר את הממשק בין החומר האפור החיצוני לבין חומר לבן פנימי. להימנע חומר לבן וחשוב יותר, כל כלי דם גדולים או אזורים מדם, קרומי המוח או מאטר מעידה. לשמור את הרקמה קפוא במהלך תהליך חיתוך על ידי עובדים במהירות והצבת לעתים קרובות הסירה במשקל עם רקמת המוח לתוך מיכלים פוליסטירן עם קרח יבש</li>
		<li>רושמות את משקל מדויק של החומר האפור טוחנות מ כל חתיכה קפוא באמצעות איזון האנליטי. חישוב הנפח של מאגר מלח נמוכה (LS) (ראה טבלה 1) לצורך המגון דאונס (5 מ ל/g או 20% w/v).</li>
		<li>10 להכין מאגר מ ל LS עם 1 x מעכב פרוטאז, פוספטאז קוקטייל ולא צונן על קרח</li>
		<li>להסיר רקמות שנשקל והסירה במשקל קרח יבש והן הקוביות לחתיכות מ מ 2 x 2 בערך כמו זה מפשירה. העברת צינור מהמגן 2 מ"ל דאונס טרום מקורר על קרח</li>
		<li>הוסף 5 מ ל/g (20% w/v) מאגר מלח נמוכה כקרח (LS) עם 1 X מעכב פרוטאז, פוספטאז קוקטייל.</li>
		<li>Homogenize רקמת המוח על קרח באמצעות כ 10 קווים של סיווג גבוהות שהעקב A ו- 15 משיכות של סיווג נמוך שהעקב B.</li>
		<li>העברת homogenate כל צינור פוליפרופילן 2 mL באמצעות כוס פסטר פיפטה. תווית ברכבת התחתית עם &#8220; תאנון &#8221; (כולל Homogenate), הרקמה קייס המספר, homogenate נפח. Aliquot 0.8 מ לתוך צינור שכותרתו mL 1.5. כל homogenate עודף יכול להיות דומה aliquoted ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס</li>
		<li>כל 0.8 מ ל aliquot, להוסיף 100 µL כל של 5 M NaCl ו- 10% (w/v) sarkosyl ריכוזים של 0.5 M ו- 1% w/v, בהתאמה. לערבב צינורות היטב על ידי היפוך, דגירה על קרח במשך 15 דקות צינורות בתווית עם &#34; ה-S &#34; (סה כ Homogenate-Sarkosyl) כדי לציין homogenates פועלות sarkosyl-מאגר (טבלה 1).</li>
		<li>Sonicate כל שפופרת עבור s 5 3 פולסים במהירות של 30% משרעת על קרח (העוצמה המקסימלית = 40%) באמצעות בדיקה microtip.</li> <li>לקבוע ריכוז חלבון homogenates באמצעות החומצה bicinchoninic (BCA) assay 25 שיטת. 
		הערה: ריכוז חלבון הממוצע של ה-S homogenates מוכן ב 5 מ ל LS לגרם של רקמות היא 15-20 מ"ג/מ"ל. Homogenates ניתן fractionated מיד או המאוחסנים ב- 80 ° C עד השימוש.</li>
		<li>Homogenates ה-S לדלל כדי 10 מ"ג/מ"ל באמצעות מאגר סארק כקרח (טבלה 1) עם 1 x מעכבי פרוטאז, פוספטאז.</li>
		<li>להעביר 5 מ ג חלבון (0.5 מ ל) של כל אחד homogenate ה-S לתוך 500 µL פוליקרבונט ultracentrifuge צינורות, זוג-איזון עם סארק-buffer. לטעון צינורות לתוך טרום מקורר רוטור ultracentrifuge ב 180,000 x g למשך 30 דקות ב- 4 supernatants העברה sarkosyl מסיסים מעלות צלזיוס (S1) כדי 1.5 mL צינורות ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס 
		הערה: (שטיפת אופציונלי) µL להוסיף 200 סארק-המאגר כדי ultracentrifuge צינורות המכילים שברים דטרגנט-לא מסיס (P1) ועוקרות כדורי (P1) מהחלק התחתון של הצינורות ultracentrifuge באמצעות טיפ פיפטה 200 µL.</li>
		<li>בקצרה את הדופק-ספין הפוך צינורות עבור s 2-3 (&#8804; 2,500 x g) ב- microcentrifuge כדי להעביר את החבילות (P1) ואת מאגר הצינורות 1.5 mL להלן. Resuspend כדורי לא מסיסים (P1) במאגר-סרק על ידי pipetting למעלה ולמטה כדי להבטיח בגדר מופרת.</li>
		<li>זוג-איזון, צנטריפוגה ב 180,000 x g למשך 30 דקות נוספות ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע שטיפת אופציונלי (S2), דגירה כדורי sarkosyl-לא מסיס (P2) ב- 50-75 µL מאגר אוריאה (טבלה 1) עם 1 x תמונה (פרוטאז, פוספטאז מעכב קוקטייל) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי solubilize צניפה- 
		הערה: מאגר אוריאה חמים לטמפרטורת החדר לפני השימוש כדי למנוע מרחביות משקעים. ליישומים הרגישים דטרגנט, להשמיט זמנים תוססים מהמאגר אוריאה ולשקול שטיפה בגדר לא מסיסים (P2) במאגר מלח נמוכה לפני resuspending במאגר שתנן.</li>
		<li>להעביר את כדורי resuspended (P2) צינורות 0.5 mL ולהשתמש קצר (1 s) microtip sonication-משרעת 20% (העוצמה המקסימלית = 40%) כדי באופן מלא solubilize כדורי.</li>
		<li>לקבוע את ריכוזי חלבונים מסיסים sarkosyl (S1) ו- assay לא מסיסים שברים (P2) באמצעות BCA את השיטה. להשתמש שברים אלה באופן מיידי או לאחסן ב- 80 ° C עד שימוש.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol><li>המערבי סופג הערה: סופג המערבית בוצעה על פי הנהלים שדווחה בעבר עם שינויים קלים. 5 , 10 <ol><li>40 להכין דגימות µg סה כ homogenates (ה-S), סארק מסיסים (S1), סארק-לא מסיס שברים (P2) במאגר מדגם X Laemmli מרחביות-דף 1 עם 5 מ מ TCEP pH 7. דגירה בדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דק</li>
		דוגמאות <li>טען ב- Bis-טריס precast 10-ובכן 4-12% מרחביות-דף ג'ל. Electrophorese-80 V על הסנטימטר הראשונה (10 דקות) ו 120 V עד לתום (60 דקות) או עד לצבוע מעקב מגיע לתחתית של הג'ל.</li>
		<li>להשתמש טריים גילוח וסכין ג'ל על פיצול-פתיחה בקלטת ג'ל טרומי. בעדינות לחתוך משם את קומבס ואת התחתון של הג'ל עם סכין גילוח טריים.</li>
		<li>Resuspend כדורי לא מסיסים (P1) 200 µl סארק-מאגר עם x 1 PIC על-ידי pipetting למעלה ולמטה.</li>
		<li>העברת קרום ניטרוצלולוזה 0.2 µm באמצעות שיטת העברה יבש על מכונת blotting (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>לחסום את הקרום במאגר חסימה (BB) ללא Tween 20 למשך 30 דקות, ואחריו עם BB עם 0.05% 20 Tween (BB/T) למשך 30 דקות. לאחר חסימת, לשטוף את הקרום ב- TBS/T (0.1% Tween 20) עבור 5 דקות כדי להסיר עודפי מאגר חסימה.</li>
		<li>הכן דילולים 1:1,000 של נוגדנים ראשי pT231, טאו-2 (פאן טאו), AT8 ו EEA1 ב BB/T (0.05% Tween 20).</li>
		<li>תדגור על הממברנות בפתרון נוגדן ראשוני בין לילה ב 4 ° C עם עצבנות מעגלית לשטוף את הקרום ב- TBS/T עבור 3 x 15 דק</li>
		<li>בדיקה הקרום לדילול 1:20,000 שכותרתו fluorescently ליד-IR משני הנוגדן ב- BB/T עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר בחושך בשייקר. לשטוף את הקרום 3 x 10 דקות ב- TBS/T ו- 2 x 5 min ב- TBS.</li>
		<li>לסרוק את הקרום באמצעות אינפרא מערכת-הגל המתאימים עירור (לדוגמא 700 nm (ערוץ אדום) עבור צבע אינפרא-אדום 680 עז העכבר אנטי איג (H + L) המשנית, 800 nm (ערוץ ירוק) עבור צבע אינפרא-אדום 790 החמור נגד אינץ ארנב IgG (H + L הדמיה ) משני).</li>
		<li>משתמש בתוכנת הדמיה לכמת עוצמות האות ולבצע מדידות densitometry לפי היצרן &#39; s הוראות, הבטחת אוטומטי-רקע הגדרת מוגדר ממוצע את הרקע כולו.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease.">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991 (1991).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li><li>Ram&#237;rez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+exploration+of+the+influence+of+the+protein+stability+on+amyloid+fibril+formation+in+vitro.">A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).</li><li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Beta+Peptide:+A+Chemist's+Perspective.+Role+in+Alzheimer's+and+Fibrillization.">The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization.</a> Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).</li><li>Diner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+Properties+of+the+Small+Nuclear+Ribonucleoprotein+U1-70K+in+Alzheimer+Disease.">Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease.</a> J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).</li><li>Gozal, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+Analysis+Reveals+Novel+Components+in+the+Detergent-Insoluble+Subproteome+in+Alzheimer's+Disease.">Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease.</a> J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).</li><li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+detergent-insoluble+brain+proteome+linked+to+amyloid+and+tau+in+Alzheimer's+Disease+progression.">Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression.</a> PROTEOMICS. , (2016).</li><li>Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).</li><li>Nizhnikov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Screening+for+Amyloid+Proteins.">Proteomic Screening for Amyloid Proteins.</a> PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).</li><li>Seyfried, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+detergent-insoluble+brain+proteome+in+frontotemporal+lobar+degeneration+using+SILAC+internal+standards.">Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards.</a> J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).</li><li>Woltjer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+determination+of+widespread+detergent+insolubility,+including+A&#946;+but+not+tau,+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including A&#946; but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> FASEB J. , (2005).</li><li>Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+the+Core+Structure+of+&#945;-Synuclein+Filaments.">Biochemical Characterization of the Core Structure of &#945;-Synuclein Filaments.</a> J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).</li><li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+&#945;-Synuclein+Is+Ubiquitinated+in+&#945;-Synucleinopathy+Lesions.">Phosphorylated &#945;-Synuclein Is Ubiquitinated in &#945;-Synucleinopathy Lesions.</a> J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130 (2006).</li><li>Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Intrinsically+Disordered+Low+Complexity+Domain+is+Required+for+U1-70K+Self-association.">An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association.</a> FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes.">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li><li>Noguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived,+Toxic,+High+Mass+Amyloid+&#946;-Protein+(A&#946;)+Assembly+from+Alzheimer+Disease+Brains.">Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid &#946;-Protein (A&#946;) Assembly from Alzheimer Disease Brains.</a> J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer's+disease.">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+&#946;-Amyloid+Protein+Is+Covalently+Modified+when+Dissolved+in+Formic+Acid.">Alzheimer's &#946;-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid.</a> J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).</li><li>Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Released+from+Paired+Helical+Filaments+with+Formic+Acid+or+Guanidine+Is+Susceptible+to+Calpain-Mediated+Proteolysis.">Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis.</a> J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer's+disease.">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li><li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoproteins+(snRNPs)+aggregate+in+Alzheimer's+disease+due+to+autosomal+dominant+genetic+mutations+and+trisomy+21.">U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21.</a> Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).</li><li>Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+change,+aggregation+and+fibril+formation+induced+by+detergent+treatments+of+cellular+prion+protein.">Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein.</a> J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).</li><li>Mirra, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consortium+to+Establish+a+Registry+for+Alzheimer's+Disease+(CERAD).+Part+II.+Standardization+of+the+neuropathologic+assessment+of+Alzheimer's+disease.">The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Guo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+pathological+tau+conformers+from+Alzheimer's+brains+transmit+tau+pathology+in+nontransgenic+mice.">Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice.</a> J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).</li><li>Matveev, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+subfraction+of+A&#946;+is+responsible+for+the+high-affinity+Pittsburgh+compound+B-binding+site+in+Alzheimer's+disease+brain.">A distinct subfraction of A&#946; is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain.</a> J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בזאת אנו להציג ולדון פרוטוקול דטרגנט-fractionation צעד אחר צעד מקוצר הרלוונטיים למגוון רחב של יישומים ניסיוני ועד ניתוח פרוטאומיקס מסה ספקטרומטר מבוססי חלבונים פונקציונליים misfolding מבחני אפילו השחרת המערבי. 5 , 6 , 7 , 10 מתודולוג...

מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), נוירודגנרטיביות (ALS) ומחלות של פריון הקשורים קשר הדוק הן proteinopathies מאופיין על ידי הצטברות הדרגתית של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס במוח. עם ליווי קוגניטיבית לסרב. 1 , 2 תכונה פתולוגית משותפת זו הוא חשב לשחק תפקיד מרכזי אטיולוגיה, פתופיזיולוגיה של אלה מחלות ניווניות. 2 אגרגטים אלה בדרך כלל מורכבים של סיבי עמילואיד פולימריים, אשר מורכבים של חוזרות יחידות של חלבונים misfolded מפגין צלב β-מבנה. 1 , 2 , 3 , 4 . מבחינה ביוכימית, אגרגטים עמילואיד הם עמידים מאוד בפני דנטורציה כימי או תרמי ו- solubilization,3 אשר מציג אתגרים ייחודיים על טיהור שלהם, ניתוח וללמוד באמצעות טכניקות מסורתיות הביוכימי. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 באופן לא מפתיע, השבר לא מסיס-אבקת חלבון הייתה המוקד של מחקרים רבים לתוך הפתופיזיולוגיה של מחלות ניווניות הקשורות ההצטברות של חלבונים misfolded. 6 , 12 , 13 , 14
טכניקות fractionation הביוכימי כבר נעזרו לעיתים קרובות כדי להעשיר את השבר דטרגנט-לא מסיס מן המוח לאחר המוות homogenates. 6 , 12 , 13 , 14 באחת השיטות הנפוצות ביותר כרוך החילוץ רציפים של רקמת homogenates עם מאגרי וחומרי ניקוי של הגדלת לכתחילה, ואחריו ultracentrifugation מחיצות שברים מסיסים ובחלקם לא מסיסים. נפוץ fractionation רציפים פרוטוקול6,14 מערבת את המגון דגימות רקמה קפוא במאגר מלח נמוכה ללא דטרגנט (האם), כדורי לא מסיסים תוצאות ואז מופקים באופן רציף עם מאגרי המכילה מלח גבוהה, חומרי ניקוי ללא יונית, סוכרוז גבוהה, דטרגנטים יוניים, ולבסוף chaotropes כמו שתנן. 6 , 14 חסרון ברור מהפרוטוקולים fractionation רציפים הוא זמן ניכר ומחויבות לעבודה הדרושה כדי להשלים אותם. כולל המגון ultracentrifugation, פרוטוקול טיפוסי fractionation חמישה צעדים יכולה לקחת כמה שעות או אפילו ימים כדי להשלים. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 . בנוסף, אגרגטים חלבון פיפטות רבים נותרים מסיסים בסך הכל, אבל ה19,החריפה תנאים20 רוב השברים שנוצר הם בעלי ערך מוגבל. כך, המדרגות fractionation פחות מחמירים ניצול ריכוז המלח גבוה ודטרגנטים ללא יונית הם במידה רבה מיותר.
מחקרים קודמים הראו כי הנוזל יוניים לאוריל-N-sarcosine (sarkosyl) הוא מועמד מצוין עבור פרוטוקול fractionation דטרגנט מפושטת של צעד אחר צעד. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 כמו חומר ניקוי denaturing, sarkosyl היא מחמירה מספיק כדי solubilize הרוב המכריע של חלבונים מקופלים מקורי במוח ללא solubilizing אגרגטים חלבון misfolded המורכב בטא עמילואיד (Aβ),6,11 טאו phosphorylated (pTau),6 זפת DNA מחייב חלבון 43 (TDP-43),14 אלפא-synuclein,12,13 scrapie,23 או U1 קטן הגרעין ribonucleoproteins (U1 snRNPs) כגון U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 כמו sarkosyl הוא פחות מחמירים יותר סולפט dodecyl בכל מקום anionic נתרן דטרגנט (מרחביות), שומרת על צורות oligomeric פחות חזקים של אגרגטים חלבון misfolded שלא יכול לעמוד טיפול מרחביות. 9
בעבר, תיאר לנו פרוטוקול דטרגנט-fractionation מקוצר להשיג תוצאות להשוות מתודולוגיות fractionation רציפים יותר מפרך. 5 על-ידי השמטת את השלבים fractionation מחמירים פחות, הצלחנו לפתח פרוטוקול נתיישב fractionation צעד אחר צעד העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות. 5 פרוטוקול מפורט זה המתוארים בזאת הוא גם מתאים למגוון רחב של יישומים ניסיוני החל סופג המערבי, מבחני מבוססי ספקטרומטר מסה פרוטאומיקס חלבון פונקציונלי misfolding, צבירת זריעה. 5 , 6 , 21

<table><tbody><tr><td>Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>78441</td><td>protease &amp;amp; phosphatase inhibitor cocktail</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB505110</td><td>microtip ultrasonicator</td></tr><tr><td>Optimax TLX Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>361545</td><td>refrigerated ultracentrifuge</td></tr><tr><td>TLA120.1 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>362224</td><td>ultracentrifuge rotor</td></tr><tr><td>500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor</td></tr><tr><td>4X SDS sample buffer</td><td>Home-made</td><td>N/A</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TCEP solution, neutral pH</td><td>Thermo Fisher</td><td>77720</td><td>reducing agent</td></tr><tr><td>(TBS) blocking buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>37542</td><td>blocking buffer</td></tr><tr><td>(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20</td><td>Thermo Fisher</td><td>37543</td><td>blocking buffer and antibody diluent</td></tr><tr><td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW04120BOX</td><td>precast SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>MES SDS Running Buffer (20X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>SDS-PAGE running buffer</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5777-50G</td><td>detergent</td></tr><tr><td>Anti-Tau-2 (pan tau) antibody</td><td>Chemicon</td><td>MAB375</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5450</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)</td><td>Thermo Fisher</td><td>MN1020</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody</td><td>abcam</td><td>ab2900</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21058</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11374</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>iBlot2 Dry Blotting System</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB21001</td><td>Gel transfer</td></tr><tr><td>iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB23002</td><td>Gel transfer</td></tr></tbody></table>

enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול מקוצרת fractionation צעד אחר צעד העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות. ? הנוזל יוניים לאוריל-N-sarcosine (sarkosyl) solubilizes ביעילות באופן מקורי מקופל חלבונים ברקמת המוח המאפשר את העשרת של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מתוך מגוון רחב של proteinopathies ניווניות, כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון, נוירודגנרטיביות ומחלות פריון. לשליטת האדם ורקמות המוח לאחר המוות לספירה היו הומוגני, sedimented על ידי ultracentrifugation בנוכחות sarkosyl להעשיר אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס כולל פיפטות phosphorylated טאו, מרכיב מרכזי neurofibrillary קשרים לספירה. סופג המערב הפגינו המסיסות דיפרנציאלית של טאו phosphorylated צבור, החלבון דטרגנט מסיסים, מוקדם 1 אנטיגן אנדוזום (EEA1) ב AD המוח ובקרה. ניתוח פרוטיאומיה מבנית גם גילה העשרה של β-עמילואיד (Aβ), טאו, snRNP70 (U1 - 70 K), ו אפוליפופרוטאין E (ספקיות) ב sarkosyl-לא מסיס שברים של המוח לספירה בהשוואה לאלו של שליטה, בקנה אחד עם אסטרטגיות fractionation רקמות הקודם . לפיכך, פרוטוקול העשרה פשוטה זה הינו אידיאלי עבור מגוון רחב של יישומים ניסיוני החל סופג המערבי חלבון פונקציונלי צבירת שיתוף מבחני פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה.

פרוטוקול sarkosyl צעד אחר צעד מקוצרת-fractionation שימש להעשיר אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס של שליטה והמוח לספירה לאחר המוות (איור 1). חלבונים מן ה-S, S1, S2 ו- P2 שברים שנפתרו על ידי עמודים מרחביות, קבוע למשך 15 דקות Coomassie מאגר מקבע כחול ולאחריו מכתים עדין עם מאגר מוכתמים G-25...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain at JoVE.com

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

פרוטוקול fractionation מקוצר העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות מתואר.

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

enrichment-detergent-insoluble-protein-aggregates-from-human

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.0K Views.  Emory School of Medicine. פרוטוקול fractionation מקוצר העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות מתואר.

Video: Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's disease pathogenesis1. A&beta; is predominantly a 40- or 42-amino acid peptide that is prone to self-aggregation into &beta;-sheet-rich amyloid fibrils that are found in the cores of cerebral senile plaques in Alzheimer's disease. Increasing evidence suggests that low molecular weight, soluble A&beta; multimers are more toxic than fibrillar A&beta; amyloid2. The identification and quantification of low- and high-molecular weight multimeric A&beta; species in brain tissue is an essential objective in Alzheimer's disease research, and the methods employed also can be applied to the identification and characterization of toxic multimers in other proteopathies3. Naturally occurring A&beta; multimers can be detected by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by immunoblotting with A&beta;-specific antibodies. However, the separation and detection of multimeric A&beta; requires the use of highly concentrated cortical homogenates and antigen retrieval in small pore-size nitrocellulose membranes. Here we describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, separation of proteins by SDS-PAGE, and antigen-epitope retrieval/Western blotting with antibody 6E10 to the N-terminal region of the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect A&beta; monomers, dimers, trimers, tetramers, and higher molecular weight multimers in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&#946; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

We describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, protein separation by SDS-PAGE, antigen retrieval and immunoblotting with an antibody to the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect monomeric and multimeric A&beta; in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

איתור SDS-PAGE/Immunoblot של Multimers Aβ ברקמה קליפתיים האדם Homogenates באמצעות Antigen-epitope אחזור

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's ...

Neuroscience

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform PrPSc 1. PrPC is detergent-soluble and sensitive to proteinase K (PK)-digestion, whereas PrPSc forms detergent-insoluble aggregates and is partially resistant to PK2-6. The conversion of PrPC to PrPSc is known to involve a conformational transition of &alpha;-helical to &beta;-sheet structures of the protein. However, the in vivo pathway is still poorly understood. A tentative endogenous PrPSc, intermediate PrP* or "silent prion", has yet to be identified in the uninfected brain7.
Using a combination of biophysical and biochemical approaches, we identified insoluble PrPC aggregates (designated iPrPC) from uninfected mammalian brains and cultured neuronal cells8, 9. Here, we describe detailed procedures of these methods, including ultracentrifugation in detergent buffer, sucrose step gradient sedimentation, size exclusion chromatography, iPrP enrichment by gene 5 protein (g5p) that specifically bind to structurally altered PrP forms10, and PK-treatment. The combination of these approaches isolates not only insoluble PrPSc and PrPC aggregates but also soluble PrPC oligomers from the normal human brain. Since the protocols described here have been used to isolate both PrPSc from infected brains and iPrPC from uninfected brains, they provide us with an opportunity to compare differences in physicochemical features, neurotoxicity, and infectivity between the two isoforms. Such a study will greatly improve our understanding of the infectious proteinaceous pathogens. The physiology and pathophysiology of iPrPC are unclear at present. Notably, in a newly-identified human prion disease termed variably protease-sensitive prionopathy, we found a new PrPSc that shares the immunoreactive behavior and fragmentation with iPrPC 11, 12. Moreover, we recently demonstrated that iPrPC is the main species that interacts with amyloid-&beta; protein in Alzheimer disease13. In the same study, these methods were used to isolate Abeta aggregates and oligomers in Alzheimer's disease13, suggesting their application to non-prion protein aggregates involved in other neurodegenerative disorders.

A new species of cellular prion protein (PrPC) has recently been identified in uninfected human brains using the methods described here. These methods can be used to isolate various PrP species, while some of them are also useful in isolating other misfolded protein aggregates from human brains.

בידוד של oligomers PRP המסיס ובלתי מסיס במוח האנושי הרגיל

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Medicine

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, little is known about changes in neuronal chromatin and nuclear organization during the course of development and aging, or in chronic neuropsychiatric disease. However, to date most chromatin and DNA based assays (other than FISH) lack single cell resolution. To this end, the considerable cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation, because typically various subpopulations of neurons are intermingled with different types of glia and other non-neuronal cells. One possible solution would be to grow cell-type specific cultures, but most CNS cells, including neurons, are ex vivo sustainable, at best, for only a few weeks and thus would provide an incomplete model for epigenetic mechanisms potentially operating across the full lifespan.  Here, we provide a protocol to extract and purify nuclei from frozen (never fixed) human postmortem brain. The method involves extraction of nuclei in hypotonic lysis buffer, followed by ultracentrifugation and immunotagging with anti-NeuN antibody. Labeled neuronal nuclei are then collected separately using fluorescence-activated sorting. This method should be applicable to any brain region in a wide range of species and suitable for chromatin immunoprecipitation studies with site- and modification-specific anti-histone antibodies, and for DNA methylation and other assays. 

The cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation for the study of epigenetic markings in chromatin because most assays lack single cell resolution. Neurons typically are intermingled with glia and other non-neuronal cells. We provide a protocol to extract and collect neuronal nuclei from human brain.

גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Biology

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or pathological conditions. Basically, this technique is based on the separation of proteins according to their isoelectric point in a first step, and secondly according to their molecular weights by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this report an optimized sample preparation protocol for little amount of human post-mortem and mouse brain tissue is described. This method enables to perform both two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and mini 2DE immunoblotting. The combination of these approaches allows one to not only find new proteins and/or protein modifications in their expression thanks to its compatibility with mass spectrometry detection, but also a new insight into markers validation. Thus, mini-2DE coupled to western blotting permits to identify and validate post-translational modifications, proteins catabolism and provides a qualitative comparison among different conditions and/or treatments. Herein, we provide a method to study components of protein aggregates found in AD and Lewy body dementia such as the amyloid-beta peptide and the alpha-synuclein. Our method can thus be adapted for the analysis of the proteome and insoluble proteins extract from human brain tissue and mice models too. In parallel, it may provide useful information for the study of molecular and cellular pathways involved in neurodegenerative diseases as well as potential novel biomarkers and therapeutic targets.

A common protein extraction protocol using urea/thiourea/SDS buffer for human and mice brain tissue allows indentification of proteins by 2D-DIGE and their subsequent characterization by mini 2DE immunoblotting. This method enables one to obtain more reproducible and reliable results from human biopsies and experimental models.

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, oligomers and fibrils. During disease, &#945;-syn undergoes conformational changes to form oligomers and high molecular weight aggregates that tend to make the protein more insoluble. Abnormally aggregated &#945;-syn is a neuropathological feature of Parkinson&#39;s disease (PD), dementia with Lewy bodies (DLB) and multiple system atrophy (MSA). Biochemical characterization and analysis of insoluble &#945;-syn using buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation provides a powerful tool to determine the development of &#945;-syn pathology associated with disease progression. This protocol describes the isolation of increasingly insoluble/aggregated &#945;-syn from post-mortem human brain tissue. This methodology can be adapted with modifications to studies of normal and abnormal &#945;-syn biology in transgenic animal models harbouring different &#945;-syn mutations as well as in other neurodegenerative diseases that feature aberrant fibrillar deposits of proteins related to their respective pathologies.

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (&#945;-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of &#945;-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

הפקה רציפה של המסיס ובלתי מסיס אלפא-סינוקלאין ממוח פרקינסון

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin occurs in equilibrium in its two forms: monomeric globular (G-actin) and polymerized filamentous (F- actin). At the synaptic terminals, actin cytoskeleton forms the basis for critical pre- and post-synaptic functions. Moreover, dynamic changes in the actin polymerization status (interconversion between globular and filamentous forms of actin) are closely linked to plasticity-related alterations in synaptic structure and function. We report here a modified fluorescence-based methodology to assess polymerization status of actin in ex vivo conditions. The assay employs fluorescently labelled phalloidin, a phallotoxin that specifically binds to actin filaments (F-actin), providing a direct measure of polymerized filamentous actin. As a proof of principle, we provide evidence for the suitability of the assay both in rodent and post-mortem human brain tissue homogenates. Using latrunculin A (a drug that depolymerizes actin filaments), we confirm the utility of the assay in monitoring alterations in F-actin levels. Further, we extend the assay to biochemical fractions of isolated synaptic terminals wherein we confirm increased actin polymerization upon stimulation by depolarization with high extracellular K+.

We report a simple, time-efficient and high-throughput fluorescence spectroscopy-based assay for the quantification of actin filaments in ex vivo biological samples from brain tissues of rodents and human subjects.

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Nuclei Isolation and Super-Resolution Structured Illumination Microscopy for Examining Nucleoporin Alterations in Human Neurodegeneration

The nuclear pore complex (NPC) is a complex macromolecular structure comprised of multiple copies of ~30 different nucleoporin proteins (Nups). Collectively, these Nups function to regulate genome organization, gene expression, and nucleocytoplasmic transport (NCT). Recently, defects in NCT and alterations to specific Nups have been identified as early and prominent pathologies in multiple neurodegenerative diseases, including Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), Alzheimer&#39;s Disease (AD)/Frontotemporal Dementia (FTD), and Huntington&#39;s Disease (HD). Advances in both light and electron microscopy allow for a thorough examination of sub-cellular structures, including the NPC and its Nup constituents, with increased precision and resolution. Of the commonly used techniques, super-resolution structured illumination microscopy (SIM) affords the unparalleled opportunity to study the localization and expression of individual Nups using conventional antibody-based labeling strategies. Isolation of nuclei prior to SIM enables the visualization of individual Nup proteins within the NPC and nucleoplasm in fully and accurately reconstructed 3D space. This protocol describes a procedure for nuclei isolation and SIM to evaluate Nup expression and distribution in human iPSC-derived CNS cells and postmortem tissues.

This protocol describes an optimized workflow for nuclei isolation and super-resolution structured illumination microscopy to evaluate individual nucleoporins within the nucleoplasm and NPCs in induced pluripotent stem cell derived neurons and postmortem human tissues.

The nuclear pore complex (NPC) is a complex macromolecular structure comprised of multiple copies of ~30 different nucleoporin proteins (Nups). ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease (AD), amyloid-beta peptides form protofibrils in the extracellular space, which act as seeds that gradually grow and mature into large amyloid plaques. Despite this basic understanding, current knowledge of the amyloid fibril structure, composition, and deposition patterns in the brain is limited. One major barrier has been the inability to isolate highly purified amyloid fibrils from brain extracts. Affinity purification and laser capture microdissection-based approaches have been previously used to isolate amyloids but are limited by the small quantity of material that can be recovered. This novel, robust protocol describes the biochemical purification of amyloid plaque cores using sodium dodecyl sulfate (SDS) solubilization with sucrose density gradient ultracentrifugation and ultrasonication and yields highly pure fibrils from AD patients and AD model brain tissues. Mass spectrometry (MS)-based bottom-up proteomic analysis of the purified material represents a robust strategy to identify nearly all the primary protein components of amyloid fibrils. Previous proteomic studies of proteins in the amyloid coronae have revealed an unexpectedly large and functionally diverse collection of proteins. Notably, after refining the purification strategy, the number of co-purifying proteins was reduced by more than 10-fold, indicating the high purity of the isolated SDS insoluble material. Negative staining and immuno-gold electron microscopy allowed confirmation of the purity of these preparations. Further studies are required to understand the spatial and biological attributes that contribute to the deposition of these proteins into amyloid inclusions. Taken together, this analytical strategy is well-positioned to increase the understanding of amyloid biology.

This biochemical purification method with mass spectrometry-based proteomic analysis facilitates the robust characterization of amyloid fibril cores, which may accelerate the identification of targets for preventing Alzheimer's disease.

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

Source: Upadhyay, A. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/63816">Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the protocol for isolating&#160; amyloid fibrils from mouse brain tissue extract using density gradient centrifugation and digestion of non-amyloid proteins.

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Tissue harvesting and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

Isolation of Detergent-Insoluble Protein Aggregates From Human Postmortem Brain Tissue

Source: Diner, I., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55835">Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video explains the process of isolating and enriching detergent-insoluble protein aggregates from frozen postmortem human brain tissue. It demonstrates key steps, including homogenization, detergent treatment, sonication, and ultracentrifugation to separate and purify the insoluble aggregates. The final step involves solubilizing the aggregates in urea buffer for further analysis.

בידוד צברי חלבונים בלתי מסיסים בדטרגנט מרקמת מוח אנושית לאחר המוות

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.&#160;&#160;
1. Homogenization and ...

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

איתור SDS-PAGE/Immunoblot של Multimers Aβ ברקמה קליפתיים האדם Homogenates באמצעות Antigen-epitope אחזור

בידוד של oligomers PRP המסיס ובלתי מסיס במוח האנושי הרגיל

גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

הפקה רציפה של המסיס ובלתי מסיס אלפא-סינוקלאין ממוח פרקינסון

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

Nuclei Isolation and Super-Resolution Structured Illumination Microscopy for Examining Nucleoporin Alterations in Human Neurodegeneration

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

בידוד צברי חלבונים בלתי מסיסים בדטרגנט מרקמת מוח אנושית לאחר המוות

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

איתור SDS-PAGE/Immunoblot של Multimers Aβ ברקמה קליפתיים האדם Homogenates באמצעות Antigen-epitope אחזור

בידוד של oligomers PRP המסיס ובלתי מסיס במוח האנושי הרגיל

גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

הפקה רציפה של המסיס ובלתי מסיס אלפא-סינוקלאין ממוח פרקינסון

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

Nuclei Isolation and Super-Resolution Structured Illumination Microscopy for Examining Nucleoporin Alterations in Human Neurodegeneration

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

בידוד צברי חלבונים בלתי מסיסים בדטרגנט מרקמת מוח אנושית לאחר המוות

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting