עבודה זו התאפשרה על ידי מענק טייס מהברית המחקר שיקום רגנרטיבית ו להכשרת (AR3T) ואת חבילת ההפעלה סגל מן ויין סטייט לכד. AR3T נתמך על ידי יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי הילד לבריאות, והתפתחות האדם (NICHD), המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, שבץ מוחי (NINDS), ואת הלאומית המכון של ביו הדמיה בביו-הנדסה (NIBIB ) של המכונים הלאומיים לבריאות תחת P2CHD086843 מספר פרס. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

<ol>
	<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li><li>Robertson, T. A., Grounds, M. D., Papadimitriou, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+aspects+of+murine+skeletal+muscle+regeneration+using+local+and+whole+body+irradiation.">Elucidation of aspects of murine skeletal muscle regeneration using local and whole body irradiation.</a> J Anat. 181 (Pt 2), 265-276 (1992).</li><li>Charge, S. B., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+regulation+of+muscle+regeneration.">Cellular and molecular regulation of muscle regeneration.</a> Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).</li><li>Brack, A. S., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+stem+cells:+lessons+from+the+skeletal+muscle+satellite+cell.">Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell.</a> Cell Stem Cell. 10 (5), 504-514 (2012).</li><li>Krag, T. O., Hauerslev, S., Sveen, M. L., Schwartz, M., Vissing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Level+of+muscle+regeneration+in+limb-girdle+muscular+dystrophy+type+2I+relates+to+genotype+and+clinical+severity.">Level of muscle regeneration in limb-girdle muscular dystrophy type 2I relates to genotype and clinical severity.</a> Skelet Muscle. 1 (1), 31 (2011).</li><li>Skuk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+myofibers+of+Duchenne+muscular+dystrophy+patients+following+intramuscular+injections+of+normal+myogenic+cells.">Dystrophin expression in myofibers of Duchenne muscular dystrophy patients following intramuscular injections of normal myogenic cells.</a> Mol Ther. 9 (3), 475-482 (2004).</li><li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source.">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li><li>Sakellariou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+electrical+stimulation+promotes+development+in+mice+of+mature+human+muscle+from+immortalized+human+myoblasts.">Neuromuscular electrical stimulation promotes development in mice of mature human muscle from immortalized human myoblasts.</a> Skelet Muscle. 6 (1), 4 (2015).</li><li>Collins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+function,+self-renewal,+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche.">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+xenograft+as+a+new+preclinical+model+for+muscle+disorders.">Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders.</a> Hum Mol Genet. 23 (12), 3180-3188 (2014).</li><li>Juhas, M., Engelmayr, G. C., Fontanella, A. N., Palmer, G. M., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+engineered+muscle+with+capacity+for+vascular+integration+and+functional+maturation+in+vivo.">Biomimetic engineered muscle with capacity for vascular integration and functional maturation in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5508-5513 (2014).</li><li>Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering+application+of+injectable+gelatin+hydrogel+with+in+situ+visible-light-activated+gelation+capability+in+both+air+and+aqueous+solution.">Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution.</a> Tissue Eng Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).</li><li>Latil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+stem+cells+adopt+a+dormant+cell+state+post+mortem+and+retain+regenerative+capacity.">Skeletal muscle stem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity.</a> Nat Commun. 3, 903 (2012).</li><li>Maykel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD-scidIl2rg+(tm1Wjl)+and+NOD-Rag1+(null)+Il2rg+(tm1Wjl)+:+a+model+for+stromal+cell-tumor+cell+interaction+for+human+colon+cancer.">NOD-scidIl2rg (tm1Wjl) and NOD-Rag1 (null) Il2rg (tm1Wjl) : a model for stromal cell-tumor cell interaction for human colon cancer.</a> Dig Dis Sci. 59 (6), 1169-1179 (2014).</li><li>Casar, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+are+increased+during+skeletal+muscle+regeneration:+requirement+of+syndecan-3+for+successful+fiber+formation.">Heparan sulfate proteoglycans are increased during skeletal muscle regeneration: requirement of syndecan-3 for successful fiber formation.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 1), 73-84 (2004).</li><li>Hardy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Study+of+Injury+Models+for+Studying+Muscle+Regeneration+in+Mice.">Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).</li><li>Roberts, P., McGeachie, J. K., Grounds, M. D., Smith, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+duration+of+myogenic+precursor+cell+replication+in+transplants+of+intact+skeletal+muscles:+an+autoradiographic+study+in+mice.">Initiation and duration of myogenic precursor cell replication in transplants of intact skeletal muscles: an autoradiographic study in mice.</a> Anat Rec. 224 (1), 1-6 (1989).</li><li>Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+muscle+injury,+repair,+and+regeneration.">Mechanisms of muscle injury, repair, and regeneration.</a> Compr Physiol. 1 (4), 2029-2062 (2011).</li></ol>

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט הטכניקה ניסיוני הרומן המכונה MIME, שפותחו במעבדה שלנו, כדי השתל רקמת השריר התורם לתוך רקמת השריר המארח. זהו עיבוד של שריר פתוח הרכבה טכניקה כבר הוכיח כיעיל בקידום התורם-תאית myogenesis ב-10,179,שרירים המארח.
המטרה של MIME היא לא לאפשר engraftment של רקמת שריר התורם עצמו לתוך השריר המארח (כיום אין אנו יודעים אם מצב זה מתרחש), אלא לספק מקור של התורם SCs יכול לתרום myogenesis בשריר המארח תחת תנאים המעודדים m uscle התחדשות. תקוותנו היא כי לאחר MIME אופטימיזציה של נבדק במחקרים בסיסיים, פרה, זה יכולה לספק תובנות מדריך קליני טיפולים שמטרתם הגדלת שריר התחדשות בשרירי השלד שעברו אובדן שרירים myogenic.
ישנן שאלות רבות אשר טרם ענה לגבי איך MIME יכול להיות מתורגם טיפול קליני, לדוגמה: כיצד נוכל לשלוט האיכות של רקמה? איך נוכל לשלוט הדחייה החיסונית של התורם רקמות ותאים? הרקמה מנוקה לאחר מתן תאים myogenesis או מותיר מאחור שהותירה צלקת? משפיע סוג סיבי השריר התורם ו/או מארח את התורם-תאית myogenesis? אילו שרירים כמעט יכולים להפיק תועלת MIME? אנחנו כעת מתרחבים המחקרים שלנו כדי להעריך אם MIME הוא בטוח ויעיל, לזהות טיפולי משלים זה יכול להגדיל את התורם, נגזר myogenesis, וענה רבות מהשאלות, המפורטים לעיל.
לאחר השלמת הבדיקות שלנו של עכבר השתלת allogeneic עם פנטומימה, הצעד הבא הוא לבצע MIME האדם-כדי-עכבר עם רקמה אנושית cadaveric כדי להעריך את הפוטנציאל myogenic של רקמת השריר cadaveric. אנו צופים כי ניסויים אלה תוביל קו חדש של מחקר בסיסי והתרגום, שכרוך רקמת השריר מתורמים, הרשומים ביוזמות כגון התוכנית מעזבונו הגוף לחינוך, התוכנית מתנת החיים עבור תרומת איברים .
נציג הנתונים שהוצגו בכתב יד זה מציע כי ב 14 ימים לאחר MIME, ישנם מספר myofibers קיימא או חוסר GFP יש רמות נמוכות של GFP. הפרשנות שלנו של נתונים אלה היא כי תאים הלוויין GFP-תורם תרמו myogenesis בשריר המארח. ביצענו ניסוי זה לקראת ההשתלה של רקמה אנושית cadaveric לתוך שריר בעכבר המחשב המארח. כדי להדגים באופן חד משמעי כי התאים בלוויין התורם לתרום myogenesis בשריר מארח בעקבות MIME, זה יהיה שימושי כדי להשתיל רקמה שמבטא כתב פלורסנט, אשר ניתן בקלות להבדיל בין GFP (למשל, אדום חלבון פלואורסצנטי לבטא רקמה מושתל לתוך GFP + מארח שריר).
טכניקה זו מוגבל בעיקר עקב אופיה של ה-SCs נוכח הרקמה. אם ה-SCs ברקמה התורם קיימא, שהטכניקה סביר להקל על myogenesis התורם-תאית, בעוד אם הם לא להתקיים, myogenesis לא יכול להתרחש. עם זאת, היות SCs גמישים מאוד קיימא עבור בערך שבועיים פוסט-מורטם, סביר מאוד כי למטרות ניסוי, רקמה זה הוא מושתל בתוך דקות ספורות לאחר הקציר יקל על התורם-תאית myogenesis13 . בנוסף, כפי הנאמר לעיל, זה אפשרי כי מאז לרקמת שריר שלם (המכיל SCs, בוגרת סיבי השריר, כמו גם שרירים תושב fibroblasts) מוטבע לתוך השריר המארח, פיברוזיס יכול להתרחש. אולם, הנחה זו צריך להיבדק מדעית. הספרות על נזק שרירים הנובעים התכווצויות השתחררות, cryoinjury ו- myotoxins ניסיוני, מרמז כי תאים חיסוניים (בעיקר macrophages) מסוגלים ביעילות ניקוי פסולת הסלולר מסיבי פגום, שיפוץ מטריצה חוץ-תאית18. לכן, זה אפשרי כי לאחר ההזרקה2 MIME ו- BaCl, כל עוד התאים החיסוניים של המארח יש גישה התורם המתנוונת סיבי השריר, הם יוכלו לנקות פסולת, משאיר מאחור רק התורם SCs. לבסוף, מידת myogenesis התורם, נגזר היא תלויה כמות רקמת השריר התורם שמוטבעת בתוך השריר המארח. על מנת תא שריר המארח יש לאכלס מחדש לחלוטין על ידי התורם-תא-derived myofibers, זה ידרוש שיטה כמו X - או גאמא-הקרנה ablate מארח שריר SCs, מחייבים הליכים MIME חוזרות ונשנות.
זה הוכח, כי בניתוח חשיפת שריר המארח, תפירת פיסת רקמה לתוך השריר המארח יכול להקל התורם-תאית myogenesis9,10,17. גישה כירורגית פתוחה זו שימש בעבר כדי לעקוב אחר ההתקדמות של myogenesis וכדי ליצור עכבר מודלים של מחלות שריר אנושי. ההיבט החדשני של הטכניקה MIME הוא זה היא פולשנית, אינה כרוכה בניתוח חשיפת השריר המארח. זה מפחית את הסיכון של זיהום iatrogenic את מידת אי הנוחות של הפונדקאי, לכן הפיכתה יותר ריאלי לביצוע MIME שוב ושוב על השריר המארח אותו במידת הצורך.
אנו צופים כי הטכניקה MIME עשוי להיות עידון מתאימים את הגישה כירורגי פתוח נוהגים כיום להשתיל רקמת השריר התורם לתוך עכבר המחשב המארח. זה יכול לזרז את הדור של העכבר humanized דגמים, על ידי שתילת הכוח האנושי ביופסיה בשריר בעכבר המחשב המארח. בנוסף, על סמך הראשוניים שלנו של עכבר הרכבה, אנו צופים כי MIME יהיה אפקטיבי להשגת התורם-תאית myogenesis מרקמה אנושית cadaveric כל עוד תורם SCs הם קיימא. לבסוף, עם בדיקות נוספות, אימות, אנו מקווים כי הטכניקה MIME יעזור לפתח טיפולים חדשים כדי להקל על התורם-תאית myogenesis אצל בני אדם במחלות שריר.
ההצלחה של טכניקת MIME הוא ביקורתי תלויים בדיוק הטבעה הרקמה בתוך תא fascial (epimysium) של השריר מארח. רק אם הרקמה ממוקם בתוך תא השריר מארח, הוא לא מסוגל לספק SCs לשריר המארח באופן מדויק. אם הרקמה התורם ממוקם מחוץ לשריר המארח, לא ברור מה יהיה גורלה. במודל ניסיוני שלנו עבור MIME, אנו משתמשים לשריר TA בתור השריר המארח, שכן הוא בולט ומוקם באופן שטחי בהיבט anterolateral של הרגל. הגודל, הכיוון והמיקום האנטומי של שריר TA, מקל לאשר כי הרקמה הוכנסה כהלכה בתוך השריר מארח ת א לאחר MIME. בנייר זה, שאנו מספקים ראיות זה הרקמה מחדשעיקריות מוטבע בתוך המארח שריר ת א ב- MIME שלאחר 3 ימים, וזה שם הוא תורם-תאית myogenesis בשריר מארח ב- פוסט-MIME 14 ימים.

בריא שרירי השלד, למרות שלאחר mitotic, בעל יכולת ההתחדשות מעולה בשל נוכחותם של תושב רקמת תאים myogenic המכונה תאים הלוויין (SCs)1,2; שנסקרה3,4. עם זאת, בתנאים פתולוגי הנגרם על ידי dystrophies שרירים, טראומה או הזדקנות מואצת, התחדשות השרירים עלול לא לשמור על קשר עם שריר התמוטטות, ומתרחשת לפיכך, סיבי השריר מתקדמת5. למרות שיטות יעילות פותחו כדי לבודד SCs מן השריר ולהרחיב אותם בתרבות כדי לייצר מספר גדול של myoblasts (ובהמשך myotubes), יש ניסיונות לייצר מספרים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של סיבי שריר שריר מארח הניב הצלחה מינימלית רק6. כמו עם סוגי תאים רבים אחרים, כאשר myoblasts מוזרקים לבד לתוך רקמות הפונדקאי, רוב התאים לא engraft7,8. אנחנו הראו כי גירוי עצבי חשמלי (NMES) מקלה על התורם-תא-נגזר myogenesis בשריר העכבר חשוכת-התחדשות מארח זה הוזרק עם האדם myoblasts8. אחרים הראו כי בניתוח הרכבה שריר ביופסיה או סיבי שריר בודד עם SCs המצורפת, להקל myogenesis מתון גם בלי NMES, רומז כי השתלת שכל סיבי השריר עם SCs עשוי להיות יתרון יותר מאשר השתלת תאים myogenic לבד9,10. מאז התורם או רקמת השריר המהונדס הושתל לשריר מארח מפיקה תוצאות טובות יותר מאשר משתילים תאים לבד, זה אפשרי רקמות או מבנים דמויי רקמה עשוי לספק רמזים מכריע עבור התורם-תא engraftment; תפיסה אשר הופך יותר ויותר ניכר טיפול בתאי מחקרים שכללו11,10,סוגי תאים שונים12.
נתונים עדכניים מראים כי SCs המתקבל בני יותר מ 2 שבועות אחרי המוות לייצר myotubes תרבות13. ולכן בכוונתנו להעריך אם ההשתלה של שריר רקמות שנקטפו פוסט-מורטם לתוך גוף חי תהפוך אובדן סיבי השריר. פיתחנו הרומן טכניקה הנקראת MIME כדי להשתיל רקמת השריר התורם לתוך רקמת שריר השלד של גוף חי על מנת לקדם את התורם-תא-נגזר myogenesis. MIME כרוך עובר מחט כירורגית דרך השריר המארח כדי ליצור מסלול המחט; לציור מקטע קטן של התורם רקמת שריר דרך במסלול המחט; עוזב את הרקמות של התורם מוטבע בתוך השריר מארח; לסגור את החורים מחט עם דבק רקמות. לאחר תרגול הטכניקה בעכברים לאללה למד בניסויים אחרים, אנחנו עכשיו ביצעתי MIME בעכברים לחיות כי הם immunodeficient ו ubiquitously express של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), ולאחר מעקב ב- 3 עד 14 ימים שלאחר באמצעות MIME. ב- MIME שלאחר 3 ימים, אנו אשר תורם עכבר (GFP-) EDL שריר מושתל לתוך עכבר המחשב המארח שריר (GFP +) ת א, נשאר בתוך השריר המארח. ב- פוסט-MIME 14 ימים, לאחר BaCl2 myotoxin פציעה כדי לגרום נזק, myogenesis, נאשר כי כ 5%, 26%, 26% ו- 43% של הסיבים מארח אחד TA שריר להראות לא מארח את התרומה, התרומה מארח מינימלי, המארח מתון התרומה ולאחר מקסימלי לארח את התרומה, בהתאמה. התגרענות המרכזית (סמן של בליה והתחדשות עוקבות) נתפסת כ- 95% של סיבי השריר ת א לאחר ההזרקה MIME ו- myotoxin.
נלמד השרירים ת א 14 ימים לאחר MIME + BaCl2 כי נקודת זמן זו לוכדת בשלב ביניים של התחדשות, כאשר רוב הסיבים regenerated נמצאים מרכזי nucleated. אנחנו לומדים GFP + עכברים כפונדקאים עבור MIME, כך כאשר אנו בסופו של דבר השתלת שריר cadaveric אנושי לתוך המארח עכברים, נוכל להבחין בקלות בין סיבי השריר של המארח ומקור התורם. אנחנו להשתמש בעכבר אדי שרירים כמו רקמה ניסיוני, מאז יחיד סיבי השריר הזה הראו פוטנציאל myogenic גדול יותר שרירי ת א9. השריר אדי הוא גם סינרגטי את השריר ת א ובעל הרכב סיבים מסוג דומה. הראשוניים שלנו מראים כי MIME הוא לסייע התורם-תא-נגזר myogenesis בשריר המארח.

<table><tbody><tr><td>NSG-GFP mice</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td><td>Stock #021937</td><td>Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein</td></tr><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)&amp;nbsp;</td><td>Stock #000664</td><td>Control donor mice</td></tr><tr><td>Tabletop isoflurane vaporizer&amp;nbsp;</td><td>VetEquip (Livermore, CA)</td><td>Item #901801</td><td>Inhaled anesthesia system</td></tr><tr><td>Magic depilatory crea</td><td>Softsheen Carson (New York, NY)</td><td>N/A</td><td>Razorless hair removal cream</td></tr><tr><td>4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures</td><td>Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD)</td><td>SUT106631</td><td>Guiding sutures for donor tissue</td></tr><tr><td>VetBond veterinary tissue adhesive</td><td>3M (Maplewood, MN)</td><td>Catalog #1469Sb</td><td>Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure</td></tr><tr><td>Barium chloride&amp;nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company (Arlington, TX)</td><td>Product #R0854000-500A 854-16&amp;nbsp;</td><td>Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration</td></tr><tr><td>Deltaphase isothermal gel heating pad&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific (Braintree, MA)</td><td>&amp;nbsp;Item #39DP</td><td>Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia</td></tr><tr><td>HM525NX cryostat&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher (Waltham, MA)</td><td>Catalog #HM525NX&amp;nbsp;</td><td>Cryostat to make frozen sections of muscle</td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Medium</td><td>Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA)</td><td>Catalog Number: H-1000</td><td>Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples</td></tr><tr><td>Rabbit anti Desmin Antibody</td><td>Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA)</td><td>RB9014P</td><td>Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling</td></tr><tr><td>Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody</td><td>ThermoFisher (Waltham, MA)</td><td>Catalog#: A-21069</td><td>Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&amp;nbsp;</td><td>Seracare (Milford, MA)</td><td>Catalog #5930-0006 or 71-03-01</td><td>Reagent for fluorescent labeling of nuclei</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1 microscope</td><td>Carl Zeiss (Peabody, MA)&amp;nbsp;</td><td>Product #Axio Scope.A1</td><td>Light and fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Photoshop CS4</td><td>Adobe Systems (San Jose, CA)</td><td>Photoshop CS4</td><td>Imaging Software for perform image tiling</td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td><td>Image J for Windows 64-bit Operating System</td><td>Imaging Software for quantitative fluorescence analysis</td></tr></tbody></table>

minimally invasive muscle embedding (mime) - a novel experimental technique to facilitate donor-cell-mediated myogenesis

שרירי השלד בעל יכולת ההתחדשות בשל רקמת תושב, יצירת סיבי שריר (myogenic) תאים הלוויין (SCs), אשר יכול ליצור סיבי שריר חדשים בתנאים הנכונים. למרות SCs ובביצים רקמת השריר ותרבותית במבחנה, התאים myoblast וכתוצאה מכך אינם יעילים מאוד בקידום myogenesis כאשר מושתלים לתוך השריר המארח. בניתוח חשיפת השריר מארח ואת הרכבה מקטעי רקמת השריר תורם או על סיבי השריר מבודד עם SCs שלהם על גבי המחשב המארח שריר, מקדם myogenesis טוב יותר בהשוואה השתלת myoblast. פיתחנו שיטה הרומן הזה שנקרא מינימלית פולשנית שריר הטבעת (MIME). MIME כרוך עובר מחט כירורגית דרך השריר המארח, ציור חתיכה של התורם רקמת השריר דרך במסלול מחט, ואז עוזב רקמה מוטבע בתוך השריר מארח כך רשאית לפעול כמקור SCs עבור שריר המארח. כאן נתאר בפירוט השלבים המעורבים בביצוע MIME במודל עכבר immunodeficient המבטאת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של כל התאים שלו. כשל חיסוני העכבר מארח מפחיתה את הסיכון של המערכת החיסונית דחיית הרקמה, ומאפשרת ביטוי GFP זיהוי קל של סיבי השריר המארח (GFP +) ותורם-תא-derived סיבי שריר (נולד ב- GFP). הנתונים הטייס שלנו מראים כי MIME יכול לשמש כדי להשתיל השריר של פושט האצבעות הארוך (EDL) מן העכבר התורם לתוך השריר השוקתי הקדמי (TA) של עכבר מחשב מארח. הנתונים שלנו מציע גם כאשר myotoxin (בריום כלוריד, BaCl2) מוזרק לתוך השריר המארח לאחר MIME, שיש הוכחות של תורם-תא-נגזר myogenesis בשריר המארח, עם 5%, 26%, 26% 43% של הסיבים מארח אחד ת א שריר מציג אין מארח את התרומה התרומה מארח מינימלי, התרומה מארח מתון, התרומה מארח מקסימלי, בהתאמה.

ב- MIME שלאחר 3 ימים, התורם אדי זה הוא מושתל מאת MIME נכלל בתוך תא השריר ת א מארח (איור 2A–C). כצפוי, חתכי רוחב של שריר TA של התורם עכברים, למד תחת קרינה פלואורסצנטית אופטיקה, אינם מראים פלורסצנטיות ירוק כי הם לא מבטא GFP (איור דו-ממדי). לעומת זאת, חתכי רוחב של שריר TA של עכברים המארח לא מושתלים עם רקמה, הצג פלורסצנטיות ירוק אחיד סיבי השריר של ת א, כפי הסיבים אקספרס GFP (2E איור). חתכי רוחב של השרירים באמצעות MIME. מושתל רקמת השריר תורם, יש קו התיחום בין סיבי השריר המארח (GFP +) לבין התורם סיבי שריר (נולד ב- GFP). התמונות חדות שלב של השדות חזותי באיור איור דו-ממדי–F מוצגים באיור 2E'–נ' מציע כי אכן ישנם סיבי השריר נוכח באזורים איפה שיש אין GFP האות.
פוסט-MIME 14 ימים, הזרקת2 BaCl, על ידי לימוד טורי בין המקטעים של שריר TA שנותרו ללא תווית או מסומנות עם נוגדנים desmin (איור 3), אנו לומדים כי האות GFP מתבטא בכך כל סיבי השריר ב שריר שאינו מטופל של עכברים המארח, אך לא את השריר שטופלו MIME (desmin אדום תיוג מגלה קיימא סיבי שריר). בשריר מארח TA מטופלים עם הזרקת2 MIME, BaCl, myogenesis התורם-תא-derived ניכרת מן הנוכחות של סיבי שריר desmin(+) רבים המציגים אין אות GFP לזיהוי (איור 3C–D, 3 C' –D'). סיבי השריר chimeric הנובעות הפיוז'ן סביר של התאים myogenic המארח ו התורם ניתן להבחין נמוכה רמות מתונות של זריחה GFP הוצגו על ידי סיבים אלו. סיבי chimeric רבים מופיעים על פני קוטר כל שריר ת א רומז כי התורם SCs מסוגלים מעביר כמה מאות מיקרונים בתוך epimysium של השריר המארח. כימות של GFP + סיבים מוצג באיור 3E. איור 4 מציג בהגדלה תמונות של טורי חתכי רוחב כל שריר ת א2 מטופלים MIME + BaCl.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig1.jpg"> 
איור 1 . השלבים הכרוכים מינימלית פולשנית שריר הטבעת (MIME). MIME מתבצע בהרדמה כללית. זה כרוך הצבת ~ 10 מ"ג של התורם שריר (התורם עכבר EDL) בתמיסה צלצול קשירת התפרים המנחה לקצוות שלה (א). מחט בקוטר 18 עבר דרך לציר הארוך של שריר המארח (B) , הרקמה נשאבים דרך במסלול המחט (C). הרקמה שמאל שמוטבע לשריר המארח (D), התפרים המנחה נחתכים, החורים המחט חתומות עם דבק רקמות (E). הפצעים המחט אטום מצוינים עם החצים (נ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig2.jpg"> 
איור 2 . מחקרים של שריר ת א 3 ימים לאחר MIME. שריר מארח שנאספו 3 ימים לאחר MIME; סימנים של מזרקים הערה במחשב מארח TA (חיצים; A-B). נתונים נוספים מאשרים כי העכבר התורם מוטבע אדי היא שהסתתר בתוך תא השריר TA (בג). קרינה פלואורסצנטית תמונות של שריר TA חתכי רוחב הצג אין קרינה פלואורסצנטית ירוק בשריר ת א (ד)של פראי-סוג קרינה פלואורסצנטית ירוק בהיר בשריר NSG-GFP TA (E), הפרדה בין המארח לבין התורם שריר בשריר TA NSG-GFP ב 3 ימים פוסט-באמצעות MIME (נ). התמונות חדות שלב של השדות visual D-F מוצגות באיור D'-F', בהתאמה. הקו האדום פאנלים F ו- F' מציגה את קו התיחום בין הרקמה מארח ושל התורמים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig3.jpg"> 
איור 3 . מחקרים של שריר ת א 14 ימים לאחר MIME. הנתונים שנאספו 14 ימים שלאחר MIME מוצגים. האות האדום הוא מ תיוג immunofluorescent של desmin (סיגנל חיובי desmin מציין כי myofibers הם קיימא), האות כחול הוא מדאפי (כתמי גרעינים), האות ירוק הוא מ- GFP. שליטה TA שריר (נכון hindlimb) שנקטפו העכבר המארח, כצפוי, myofibers כמעט כל הם חיוביים עבור desmin, רומז כי myofibers אלה הם קיימא (A; אדום). בנוסף, בהתבסס על דאפי מכתים, זה ברור זה myonuclei של כמעט כל myofibers ממוקמים באופן עקיף, כצפוי בשריר בריא (A; סימן כחול). טורי מקטעים של שריר שליטה TA מראים כי כמעט כל סיבי השריר בצבע ירוק בהיר, רומז כי הם חיוביים עבור ה-GFP. MIME + BaCl2 -מטופלים TA שרירים (hindlimb השמאלי), תורם-תאית myogenesis ניכרת מן הנוכחות של סיבי שריר desmin(+) רבים המציגים אין קרינה פלואורסצנטית GFP לזיהוי (C-D, C'-D'). Desmin(+) סיבי שריר נמוך בינוני GFP קרינה פלואורסצנטית (סיבי שריר chimeric) נמצאים לאורך הקוטר של השריר TA כולו, רומז כי MIME מספק התורם SCs יכול להעביר בתוך epimysium של השריר TA, לקדם התורם-תא-נגזר myogenesis. א '-D' ההגדלה גבוהה תמונות של האזורים בתוך הקופסאות הכחולות A - ממד. כימות של סיבי GFP(+) וסיבים מרכזי nucleated מוצגים ב- E. גודל ברים = 100 מיקרומטר (A-D) ו- 50 מיקרומטר (א '-יח '). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" s alt="Figure 4" class="xfigimg"></img alt="Figure 4" class="xfigimg" s>rc="/files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg" / > 
איור 4 . עדות לנזק נרחב והתחדשות 14 ימים לאחר ההזרקה2 MIME ו- BaCl. בהגדלה, טורי חתכי רוחב כל שריר ת א2 מטופלים MIME + BaCl מוצגים. הנתונים מראים כי רבים סיבי השריר, אשר הם בינוני או חזק GFP + יש במיקום מרכזי גרעינים (א-ב; אדום האות א' הוא מ- desmin, כחול אות א' של דאפי, אות ירוק ב' מ- GFP). נתונים אלו מראים כי ניוון והתחדשות לאחר הזרקת2 BaCl אינו משפיע על הביטוי GFP. בהקשר זה, הנוכחות של סיבי השריר מרכזי nucleated בשריר ת א2 מטופלים MIME + BaCl, עם ביטוי GFP-קטן-לא, מרמז כי סיבים אלו הם כנראה תוצאה של myogenesis (או התחדשות) עם תרומה משמעותית מ GFP - תאים myogenic. תצפיות אלה יכולים לאמת יותר בתמונות בהגדלה של שדות נבחרים (C-F; C, D, ו- E ו- F, בהתאמה, חופפות אזורים של חתכי רוחב טורי; קודי הצבע של התמונה גבולות מציינות המיקום של אזורים אלה ב- A ו- B). גודל ברים = 100 מיקרומטר (A-B) ו- 50 מיקרומטר (C-F). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis at JoVE.com

Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

אנו מתארים טכניקה ניסיוני הרומן נקרא מינימלית פולשנית שריר הטבעת (MIME), אשר מבוססת על ראיות כי רקמת שריר השלד מכיל תאים myogenic קיימא יכול להקל על התורם-תאית myogenesis כאשר מושתל לתוך שריר המארח.

שריר פולשנית הטבעה (MIME) - טכניקה ניסיוני הרומן כדי להקל על Myogenesis התורם-תאית

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new ...

minimally-invasive-muscle-embedding-mime-novel-experimental-technique

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME) - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

7.7K Views.  Wayne State University. אנו מתארים טכניקה ניסיוני הרומן נקרא מינימלית פולשנית שריר הטבעת (MIME), אשר מבוססת על ראיות כי רקמת שריר השלד מכיל תאים myogenic קיימא יכול להקל על התורם-תאית myogenesis כאשר מושתל לתוך שריר המארח.

Video: Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

במבחנת הבידול של בוגרות Myofibers עבור הדמיה חיה

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Developmental Biology

Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle degeneration1, 2. In patients, the ability of resident muscle satellite cells (SCs) to regenerate damaged myofibers becomes increasingly inefficient4. Therefore, transplantation of muscle progenitor cells (MPCs)/myoblasts from healthy subjects is a promising therapeutic approach to DMD. A major limitation to the use of stem cell therapy, however, is a lack of reliable imaging technologies for long-term monitoring of implanted cells, and for evaluating its effectiveness. Here, we describe a non-invasive, real-time approach to evaluate the success of myoblast transplantation. This method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes (firefly luciferase [fluc], monomeric red fluorescent protein [mrfp] and sr39 thymidine kinase [sr39tk]) whose expression can be imaged with different imaging modalities9, 10. A variety of imaging modalities, including positron emission tomography (PET), single-photon emission computed tomography (SPECT), magnetic resonance imaging (MRI), optical imaging, and high frequency 3D-ultrasound are now available, each with unique advantages and limitations11. Bioluminescence imaging (BLI) studies, for example, have the advantage of being relatively low cost and high-throughput. It is for this reason that, in this study, we make use of the firefly luciferase (fluc) reporter gene sequence contained within the fusion gene and bioluminescence imaging (BLI) for the short-term localization of viable C2C12 myoblasts following implantation into a mouse model of DMD (muscular dystrophy on the X chromosome [mdx] mouse)12-14. Importantly, BLI provides us with a means to examine the kinetics of labeled MPCs post-implantation, and will be useful to track cells repeatedly over time and following migration. Our reporter gene approach further allows us to merge multiple imaging modalities in a single living subject; given the tomographic nature, fine spatial resolution and ability to scale up to larger animals and humans10,11, PET will form the basis of future work that we suggest may facilitate rapid translation of methods developed in cells to preclinical models and to clinical applications.

A non-invasive means to evaluate the success of myoblast transplantation is described. The method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes whose expression can be imaged with different imaging modalities. Here, we make use of a fluc reporter gene sequence to target cells via bioluminescence imaging.

מולקולרית והדמיה ליעד בתאים שריר מושתלים

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

ביצוע שריר השלד האנושי Xenografts בעכברים חיסוני

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biology

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Dosage-Adjusted Resistance Training in Mice with a Reduced Risk of Muscle Damage

Progressive resistance training (PRT), which involves performing muscle contractions against progressively greater external loads, can increase muscle mass and strength in healthy individuals and in patient populations. There is a need for precision rehabilitation tools to test the safety and effectiveness of PRT to maintain and/or restore muscle mass and strength in preclinical studies on small and large animal models. The PRT methodology and device described in this article can be used to perform dosage-adjusted resistance training (DART). The DART device can be used as a standalone dynamometer to objectively assess the concentric contractile torque generated by the ankle dorsiflexors in mice or can be added to a pre-existing isokinetic dynamometry system. The DART device can be fabricated with a standard 3D printer based on the instructions and open-source 3D print files provided in this work. The article also describes the workflow for a study to compare contraction-induced muscle damage caused by a single bout of DART to muscle damage caused by a comparable bout of isometric contractions (ISOM) in a mouse model of limb-girdle muscular dystrophy type 2B/R2 (BLAJ mice). The data from eight BLAJ mice (four animals for each condition) suggest that less than 10% of the tibialis anterior (TA) muscle was damaged from a single bout of DART or ISOM, with DART being less damaging than ISOM.

The present protocol describes a unique technique called dosage-adjusted resistance training (DART), which can be incorporated into precision rehabilitation studies performed in small animals, such as mice.

אימוני התנגדות מותאמים למינון בעכברים עם סיכון מופחת לפגיעה בשרירים

Progressive resistance training (PRT), which involves performing muscle contractions against progressively greater external loads, can increase muscle ...