אנו מודים לפרופ &#39;ג&#39; פרי ווסטנייס, אוניברסיטת בריטיש קולומביה, על זרע להביע RFP-TUB6 ו סוקר אנונימי עבור תיקונים מועיל. אנו אסירי תודה לפרופ &#39;יו דיקינסון על כך שהזהיר אותנו להשתמש בסרט תאית כתמיכה מכנית ולג&#39;ון בייקר לצילום. עבודה זו נתמכה על ידי מחקר BBSRC מעניק BB / G013993 / 1 ו- BB / D004055 / 1 ל- IM, וכן פרס BBSRC הדרכה דוקטורנט מלגות קלרנדון CK

1. יצירת החדר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות חותך זכוכית, לחתוך 3 מ&quot;מ רצועות רחב מקצה שקופית מיקרוסקופ 1 מ&quot;מ עבה. באמצעות דבק סופר cyanoacrylate או קלטת דו צדדית, דבק אלה רצועות זכוכית כ 45 מ&quot;מ בנפרד על פני רוחב של שקופית מיקרוסקופ השני ( איור 1 א ). שקופית אחת לכל חדר נדרש, בתוספת שקופיות נוספות לשפוך לוחות אגר (שקופית אחת תניב 2-3 אגר לוחות). שקפים ניתן לעשות בה שימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין רצועות הזכוכית, אופנה אטם של גובה זהה מתוך גומי חדיר פול (dimethylsiloxane) מסטיק. מניחים כדור של מסטיק פולי (dimethylsiloxane) על השקופית ( איור 1B ), רטוב שקופית השני עם כמות קטנה של אתנול מוחלט 100%, ולשטח את הכדור (dimethylsiloxane) מסטיק הכדור עם השקופית השנייה עד שהוא הגיע לגובה של רצועות זכוכית ( איור 1 ג ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, לקצץ עודף פולי (שקלThylsiloxane) מסטיק עם להב סכין גילוח חוזר שטוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת חותך מתאים או סכין גילוח הרטבו באתנול מוחלט, להסיר את החלק הפנימי של מסטיק פולי (dimethylsiloxane) כדי ליצור את חלל כי יהיה מאוחר יותר להחזיק את השתיל ואת לוח אגר ( איור 1D ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לקצץ את הג &#39;ל עם להב גילוח ליצור אטם עם עובי דופן הסופי של כ 2 מ&quot;מ ( איור 1E ). חדירות של גזים דרך מחסום פולי (dimethylsilaxane) הוא עצמאי של עובי מעל 50 מיקרומטר 11 . </li></ol> 2. יצירת אגר- solidified לוח של צמיחה בינונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על שקופית מיקרוסקופית עם שתי רצועות זכוכית, במקום coverslip (22 מ&quot;מ x 50 מ&quot;מ) כך שהוא נשען על שתי רצועות זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה נמס חצי כוח Murashige ו Skoog בינוני צמיחה המכיל 1% w / סוכרוז v ו 1.5% w / v אגר (½ MS) לתוך החלל וכתוצאה מכךמתחת coverslip עד האחרון הוא מלא לגמרי (כ 1 נפח נפח מלא) ולהשאיר עד אגר מוגדר (כ 5 דקות). הערה: תרכובות פרמקולוגיות ניתן לנהל באמצעות לוח אגר על ידי הוספת ריכוזים מתאימים למדיום נוזלי לפני הלוח הוא שפך. זה נבדק בהצלחה עבור dexamethasone 12 , isoxaben, 2,6-dichlorobenzonitrile (DCB), אוריזלין, ו latrunculin B. </li></ol> 3 . מסיים את ההגדרה הקאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איזון האוויר PFD על ידי רעד נפח קטן של PFD בצינור 7 . הוסף כמות קטנה (כ 200 μL) של אוויר PFD equilibrated אל הבאר של אטם ג &#39;ל, אבל לא למלא את החדר לחלוטין. זה PFD יסייע למנוע את השמנה של בועות אוויר מתחת ללוח אגר כפי שהוא ממוקם לתוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslip מן לוח אגר (בשלב 2.2 לעיל) ולהשתמש סכין גילוח לחתוך חלק של דהגודל וצורה. ואז למקם אותו לתוך הבאר של אטם ג&#39;ל ( איור 1F ). צריך להיות פער של 2-4 מ&quot;מ על אטם מסביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את החדר לחלוטין עם אוויר equilibrated PFD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד או יותר שתלי thaliana A. (עד 3 שתילים עבור הדמיה מעל 2-3 ימים) על גבי לוח אגר עם cotyledons ו hypocotyl תלוי מעל הקצה, צף PFD ( איור 1G ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג שתילים, לעקר זרעים עם אתנול 70%, צמח על בינוני MS בינוני ½ בתוספת סוכרוז 1% ו אגר 0.8%, stratify עבור 2-4 ימים ב 4 ° C, ולגדול על לוחות בכיוון אנכי ב 22 ° C ב 16 שעה בהיר / 8 שעות משטר כהה. לקבלת הדמיה שורשים לרוחב, לגדל צמחים 7-10 ימים לפני העברת לתאי הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לסגור את החדר, להחיל coverslip מתאימים את אופטיקה של המטרה, בעדינות לחיצה על זה עם קצה של שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עד coverslipנשענת על שתי רצועות זכוכית ( איור 1H ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאבטח את coverslip עם רצועות של 1.25 ס&quot;מ micropore רחב חיתוך סרט קלטת בחצי אורך חכם על כל קצה אם רוצים ( איור 1I ). אפשר הדגימה להסתפק כ 30 דקות לפני ההדמיה. זה ממזער את תנועת הדגימה במהלך ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הדמיה עם מיקרוסקופ זקוף כדי לשמור על מצע מבוקר לצמיחה. השתמש 20X / 0.7NA או 63X / 1.2NA מטרות CS2. </li></ol>

<ol>
	<li>Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+imaging+chamber+for+viewing+living+plant+cells+and+tissues+at+high+resolution+for+extended+periods.">An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods.</a> Plant Meth. 11, 22 (2015).</li><li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science.">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li><li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high+throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).</li><li>Baranenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+oxygen+and+carbon+dioxide+in+water.">Solubility of oxygen and carbon dioxide in water.</a> Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).</li><li>Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Cellular+Dynamics+in+Growing+Arabidopsis+Roots+with+Light+Sheet+Microscopy.">Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy.</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll.">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).</li><li>Littlejohn, G. R., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+imaging+Arabidopsis+leaves+using+perfluorodecalin+as+an+infiltrative+imaging+medium.">A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Littlejohn, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update:+improvements+in+imaging+perfluorocarbon-mounted+plant+leaves+with+implications+for+studies+of+plant+pathology,+physiology,+development+and+cell+biology.">An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology.</a> Front Plant Sci. 5, 140 (2014).</li><li>Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+oxygen+in+liquid+perfluorocarbons.">Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons.</a> Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).</li><li>Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluid+Fluorocarbons+to+Study+Freezing+in+Plant+Tissues.">Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues.</a> Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).</li><li>Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+thickness+dependence+of+polydimethylsiloxane+(PDMS)+membranes.">Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes.</a> J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).</li><li>Kirchhelle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Specification+of+Geometric+Edges+by+a+Plant+Rab+GTPase+Is+an+Essential+Cell-Patterning+Principle+During+Organogenesis+in+Arabidopsis.">The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis.</a> Dev Cell. 36, 386-400 (2016).</li><li>Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+division+and+elongation+underlying+the+developmental+acceleration+of+root+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).</li><li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+combinatorial+analysis+of+membrane+compartments+in+intact+plants+with+a+multicolor+marker+set.">Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set.</a> Plant J. 59, 169-178 (2009).</li><li>Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CLASP-modulated+cell+edge+barrier+mechanism+drives+cell-wide+cortical+microtubule+organization+in+Arabidopsis.">A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis.</a> Nat Commun. 2, 430 (2011).</li><li>Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototropism+and+Gravitropism+in+Lateral+Roots+of+Arabidopsis.">Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis.</a> Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).</li><li>Gendreau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+basis+of+hypocotyl+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).</li><li>von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+of+Plant+Roots+Growing+on+the+Surface+of+a+Gel.">Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel.</a> J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה המוצגת כאן היא אסטרטגיה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה הדמיה confocal של פיתוח שורשים לרוחב עבור שניים עד שלושה ימים. בתקופות של עד 48 שעות, לא נצפו תופעות לוואי של מערכת ההדמיה על התפתחות שורש לרוחב. לאחר 48 שעות, הצמיחה השורשית הממוצעת החלה להאט, אם כי תת-קבוצה משמעותית של השורשים (37%) המשיכה לצמוח בקצב דומה לצמיחת השורש הממוצעת בצלחות. לכן, באמצעות הדמיה מספר גדול מספיק של שורשים, שורשים אשר הצמיחה איטית לאחר 48 שעות ניתן להרחיק. בדיקות סיסטמטיות של תאי ההדמיה לא בוצעו לתקופות ארוכות יותר מ -72 שעות, אך מומלץ להשתמש באסטרטגיות חלופיות אם יש צורך בתקופות הדמיה מורחבות. תאי הדמיה עשויים להישאר על הבמה מיקרוסקופ ברציפות, אם בתנאי הסביבה מתאימים מסופקים, או מוסר למתקן הצמיחה ומדי פעם חזר למיקרוסקופ. זה מאפשר חדרים רבים להיות צילמו במקביל/ P&gt; אחד היתרונות של החדרים המתוארים כאן הוא כי שורשים לרוחב קבועים במצבם והוא יכול להיות צילמו באמצעות ברזולוציה גבוהה עדשות טבילה במים. יציבות מרחבית ביקורתית תלוי ריכוז אגר בשימוש לוח אגר תמיכה. בתחילה נבדקו ריכוזים שונים של אגר 0.8% ל אגר של 2%, ומצאו כי ריכוזים גבוהים בטווח זה קבועים בשורשים קבועים בחלל, אך שורש הצמיחה הואט מהר יותר וחלק מהשורשים הראו סימני לחץ מכני, כולל התארכות תא מופחתת. לעומת זאת, ריכוזי אגר נמוכים לא סיפקו את התמיכה והשורשים הנדרשים ב- x, y ו- z במהלך ההדמיה. אופטימלית 1.5% אגר לוח מתקן את המיקום של הדגימה ללא תופעות מכניות שליליות. בתנאים אלה, לאחר ההתיישבות ב 30 דקות הראשונות או כך, שורשים יציבים על פני שעות רבות, המאפשר רכישת נתונים לילה. במהלך רכישת נתוני 4D, טווחי ערימת z היו בדרך כלל במחוררים על ידי 5-10 מיקרומטר נוסף אבל זה היה בעיקר כדי להתאים לצמיחה מחוץ לגובה של שורשים לרוחב ולא z- להיסחף או לנענע. למרות ריכוז אגר סטנדרטי מספק התנגדות מסוימת נגד חדירה, שורשים gravitropically גדל בסופו של דבר לחדור את אגר. עם זאת, באמצעות שינוי קטין של החדר הדמיה, שורש הצמיחה יכולה להישמר מקביל coverslip, המאפשר שורשים לרוחב מבוגר השורשים העיקריים להיות צילמו. יתר על כן, חדר הדמיה בסיסי יכול בקלות להיות מותאם אישית עבור hypocotyls. Hypocotyls הם יותר חופשי צף במערכת זו כך Z- ציר סוגר לרכישת התמונה הוגדלה בדרך כלל על 20 מיקרומטר. במחקר זה, מיקרוסקופ זקוף שימש בכל רחבי, אשר אפשרה את מאפייני המצע להיות נשלט. תא הדמיה יכול להיות מותאם לתצורות מיקרוסקופ הפוכה אבל ההשפעה תלוי זמן של coverslip נוקשה על מיירט איברים יהיה צורך להעריך. </p&gt; Littlejohn ועמיתיו יש לציין כי PFD עצמו אינו בקלות להמיס מולקולות ביולוגיות, כלומר זה לא ניתן להשתמש עבור ישירות עבור משלוח של תרכובות פרמקולוגיות 7 . בעיה זו היה להתגבר על ידי אספקת תרכובות כאלה דרך לוח של המדידה הצמיחה מוצק שבו מוטלת אגר. בעוד מערכות זלוף יישארו השיטה של ​​בחירה עבור לשטוף- out ניסויים, תא הדמיה שימש בהצלחה עבור ניהול של dexamethasone 12 ותרכובות אחרות. הערה אחת, בעוד מאמר זה היה בהכנה פון Wagenheim ועמיתיו 18 תיאר חדר הדמיה פיתוח שורש לרוחב באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון.

כדי לחקור את התהליכים הסלולר והתת-קרקעיים המונחים ביסוד פיתוח הצומח, יש ביקוש גובר לפתרונות הדמיה לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה. האתגר העיקרי בניסויים הדמיה כזו היא שמירה על תנאים פיזיולוגיים כולל חילופי גזי מספיק בתוספת אספקת מים וחומרים מזינים 1 , 2 , 3 . כדי לנצל את היעדים עם פתחים מספריים גבוהים עבור רזולוציה אופטית אופטימלית, דגימות צריך להיות ממוקם בקירבה מקבילה בכיוון מקביל coverslip. התנועה x, y, ו- z כיוונים צריך אידיאלי להיות מינימלי במהלך הדמיה. בעוד שתילים הם רכוב לעתים קרובות במים או תמיסה מימית עבור הדמיה לטווח קצר, מים יש קיבולת נמוכה עבור המסת CO2 ו O 2 (1.54 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו 0.04 מ&quot;ג / מ&quot;ל, בהתאמה ב 20 ° C, 0.1 מגפ&quot;ס) 4 , מה שהופךזה לא מתאים עבור זמן ארוך לשגות ניסויים. מערכות זלוף כי לשמור על רמות קבועות של חמצן וחומרים מזינים הם פתרון אחד לבעיה זו פותחו עבור מיקרוסקופיה לייזר סריקה confocal (CLSM) 1 , 2 , 3 ו מיקרוסקופ גיליון אור (LSM) 5 . מערכות כמו RootChip 2 ו RootArray 3 תוכננו במיוחד עבור זמן לשגות הדמיה של השורשים המתפתחים לערב נביטה זרעים במודל מותאם אישית לבנות רב הדגימה. סידורים אלה מבטיחים הפרעה מכנית מינימלית ומעוצבים לניתוח מקבילי של שתילים מרובים, אך אינם מותאמים להדמיה של מבנים תת-תאיים. קאלדר ועמיתיו עיצבו תא מורכבת יותר זלוף מבוסס הדמיה אופטימיזציה עבור הדמיה של מבנים subcellular שבו הדגימה מוחזקת בעמדה על ידי רשתכדי לאפשר את השימוש של עדשות טבילה הגדלה גבוהה 1 . הציג כאן פתרון חלופי, פשוט לבעיה זו אשר אינו מבוסס על מערכות זלוף, אך מנצל perfluorodecalin (PFD), perfluorocarbon כי זכה לאחרונה הפופולריות כמדיום גובר עבור הדמיה ארבידופסיס 6 , 7 , 8 . ביישומים כאלה, קיבולת גבוהה של PFD עבור המסת CO 2 ו O 2 (1.9 גרם / מ&quot;ל ​​עבור O 2 ב PFD לעומת 0.04 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במים) 9 , מאפשר החלפת גזי ידי הרקמה שקוע. יתר על כן, PFD הוא לא פלואורסצנטי ומדד השבירה שלו (1.313) הוא דומה לזה של מים (1.333) והוא קרוב יותר לזה של cytosol (~ 1.4) מאשר אוויר (1.000) 6 . Fluluorocarbons דווחו יש השפעה מינימלית פיזיולוגית על מגוון רחב של צמחים צמח לאבעיות 6 , עם זרעי צנון נובטים בקלות כאשר שקוע PFD ומציג צמיחה נורמלית ופיתוח לפחות שני ימים מלאים, כאשר מסופק עם מים 10 . תצפיות דומות נעשו עבור נביטה של זרעי ארבידופסיס . בהתבסס על גירוי ראמאן פיזור ישיר לתמונה הפצה של PFD ב רקמות ארבידופסיס עלה לאחר חדירת, ליטג&#39;ון ועמיתיו למסקנה כי PFD סביר להניח לא נלקח על ידי תאים חיים 8 . PFD בעבר שימש בעיקר כדי התמונה רקמות אוויר, שבו זה מגדיל באופן משמעותי את עומק הדמיה כפי שהוא בקלות חדירת מרחבי האוויר עקב מתח נמוך שלה משטח 6 . הנה, PFD הוא אימץ עבור הדמיה confocal לטווח ארוך של פיתוח שורשים לרוחב. בתצורה זו, שתילים אחד או יותר ממוקמות על לוח של בינונית צמיחה מוצק עם אגר ו שקוע PFD. PFD מאפשר gחילופי אדים בתא הדמיה, מניעת anoxia. PFD הוא נדיף מאוד ולכן הוא נשמר על ידי אטם של מסטיק פולי (dimethylsiloxane), כי יש גם חדירות גז גבוהה (1.5 x 10 -12 pmol מ -1 -1 s -1 אבא -1 עבור CO 2 ) 11 . חומרים מזינים ומים מסופקות על ידי לוח של solidified בינוני עם אגר. במקביל, זה לוח אגר בעדינות לוחץ את השורש נגד coverslip, ובכך לתקן את המיקום היחסי שלה בחדר הדמיה ומאפשר את השימוש ברזולוציה גבוהה עדשות טבילה במים. יתר על כן, לוח אגר ניתן להשתמש כדי לנהל מגוון של טיפולים תרופתי, כולל dexamethasone, oryzalin, ו isoxaben. תאי הדמיה ניתן להרכיב במספרים גדולים מן שקופיות מיקרוסקופ סטנדרטי באמצעות ציוד מינימלי. תאי ההדמיה פותחו ואופיינו ללימוד התפתחות שורש לרוחב, אך ניתנים להתאמה לדמיית איברים אחרים, כגון שורש ראשוני,היפוקוטילים.

<table><tbody><tr><td>Perfluorodecalin</td><td>F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK</td><td>FLUTEC PP6</td><td></td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxane) gum&amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA</td><td>Item # 132700</td><td>Carolina Observation Gel</td></tr><tr><td>Cavity Microscope Slides</td><td>VWR International Ltd, Lutterworth,&amp;nbsp;UK</td><td>10118-600</td><td>Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Loctite</td><td>604753</td><td>Any &#039;super-glue&#039; suitable for glass will probably suffice</td></tr><tr><td>Cellulosic cellophane membrane</td><td>AA Packaging Limited, Preston, UK</td><td></td><td>325P cellulose film; 80 mm disc</td></tr></tbody></table>

a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development

כמה היבטים של פיתוח צמחים, כגון מורפוגנזה שורש לרוחב, להתרחש על פני זמן של כמה ימים. כדי לחקור את התהליכים הבסיסיים התאים הסלולר, זמן ברזולוציה גבוהה לשגות אסטרטגיות מיקרוסקופיה כי לשמר תנאים פיזיולוגיים נדרשים. רקמות הצמח חייב להיות מזין נאותה אספקת מים עם חילופי גזי מתמשכת אבל, כאשר שקוע משותק תחת coverslip, הם רגישים במיוחד anoxia. אסטרטגיה אחת אשר הועסק בהצלחה היא השימוש במערכת זלוף כדי לשמור על אספקה ​​מתמדת של חמצן וחומרים מזינים. עם זאת, הסדרים כאלה יכול להיות מסובך, מסורבל, ודורשים ציוד מיוחד. מוצג כאן היא אסטרטגיה חלופית עבור מערכת הדמיה פשוטה באמצעות perfluorodecalin כמו מדיום טבילה. מערכת זו היא קלה להתקנה, דורש ציוד מינימלי, והוא רכוב בקלות על הבמה מיקרוסקופ, המאפשר מספר חדרי הדמיה להיות מוגדר הדמיה שווהאלל. במערכת זו, שיעורי הצמיחה שורש לרוחב הם נבדלים משיעורי צמיחה בתנאים סטנדרטיים על צלחות אגר במשך היומיים הראשונים, וצמיחה שורש לרוחב ממשיך בשיעורים מופחתים לפחות עוד יום. רקמות הצמח מסופקים עם חומרים מזינים דרך אגר לוח זה יכול לשמש גם כדי לנהל מגוון של תרכובות פרמקולוגיות. המערכת הוקמה כדי לפקח על התפתחות שורש לרוחב, אבל הוא להתאמה בקלות התמונה איברים צמח אחרים כגון hypocotyls השורשים העיקריים.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development at JoVE.com

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

מוצג כאן היא טכניקה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה confocal זמן לשגות הדמיה של פיתוח שורש היפוקוטיל עד 3 ימים באמצעות מטרות צמצם גבוהה מספריים ו perfluorodecalin כמו מדיום טבילה.

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

a-simple-chamber-for-long-term-confocal-imaging-root-hypocotyl

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Views.  University of Oxford.  מוצג כאן היא טכניקה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה confocal זמן לשגות הדמיה של פיתוח שורש היפוקוטיל עד 3 ימים באמצעות מטרות צמצם גבוהה מספריים ו perfluorodecalin כמו מדיום טבילה. 

Video: A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

זמן לשגות דימות פלואורסצנטי של צמיחה רוט ארבידופסיס עם מניפולציה מהירה של הסביבה רוט שימוש RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Bioengineering

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop cultivars against environmental stresses. An experimental protocol is presented for RGB and hyperspectral imaging of root systems. The approach uses rhizoboxes where plants grow in natural soil over a longer time to observe fully developed root systems. Experimental settings are exemplified for assessing rhizobox plants under water stress and studying the role of roots. An RGB imaging setup is described for cheap and quick quantification of root development over time. Hyperspectral imaging improves root segmentation from the soil background compared to RGB color based thresholding. The particular strength of hyperspectral imaging is the acquisition of chemometric information on the root-soil system for functional understanding. This is demonstrated with high resolution water content mapping. Spectral imaging however is more complex in image acquisition, processing and analysis compared to the RGB approach. A combination of both methods can optimize a comprehensive assessment of the root system. Application examples integrating root and aboveground traits are given for the context of plant phenotyping and plant physiological research. Further improvement of root imaging can be obtained by optimizing RGB image quality with better illumination using different light sources and by extension of image analysis methods to infer on root zone properties from spectral data.

An experimental protocol is presented for assessment of soil grown plant root systems with RGB and hyperspectral imaging. Combination of RGB image time series with chemometric information from hyperspectral scans optimizes insights into plant root dynamics.

RGB והדמיה ספקטרלי שורש הצמח Phenotyping ומחקר פיזיולוגיים: הגדרת הניסוי והדמיה פרוטוקולים

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

Environment

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Neuroscience

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

פיתוח Microfluidic ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בחללים קטנים מאוד

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Biology

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בצמחים ארבידופסיס

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור של שורשי הצמח גדל על פני השטח של ג&#39;ל

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video