Name: genome-wide determination of mammalian replication timing by dna content measurement
Uploaded: 2017-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement at JoVE.com

אנו מודים אוריה ורד לסיוע ביצירת דמויות. עבודה בקבוצה היא נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (567/10 מס מענק) ואת המועצה האירופית למחקר החל גרנט (# 281,306).

הערה: TOR יכול להימדד רק לגדול, תאים לא מסונכרנים. ההליך צריך להתחיל עם לפחות 1 - 2 x 10 6 מהירי תאים גדלים, אשר בדרך כלל יגרמו ~ 1 x 10 5 תאים בשלב S (צעד הגבלת השיעור). מומלץ לנהל כל ניסוי באמצעות שניים או שלושה משכפל. התהליך כולו של CNR-תור ניתן להשלים בתוך שבוע - ימים אמורים להיות מוקדשים לכל השלבים עד כנת ספרייה, יום או ימים נדרשים עבור סידור ויום נוסף הוא הכרחי עבור ניתוח נתונים הראשוני. 1. איסוף של תאים מן התרבות הערה: הפרוטוקול נכתב עבור התאים הגדלים בתרבית 10 צלחות ס&quot;מ (המכיל כ 2 - 5 x 10 6 תאים), אך ניתן להתאימו בקלות לפלטפורמות אחרות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים שגודלו השעיה, המשך קיבעון (סעיף 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים חסידים, לשאוב ולשטוף את plמ&quot;ל PBS אכל עם 3 ללא Ca 2 + ו Mg 2+. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PBS ו דגירה התאים למשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 1-EDTA טריפסין מסחרי מ&quot;ל עד תאים לנתק. הערה: משך הטיפול טריפסין צריך להיות מותאם לכל סוג תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 התקשורת והתרבות מ&quot;ל לנטרל את טריפסין ולאסוף תאים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל או צינור קלקר 5 מ&quot;ל. שמור על הקרח. </li></ol> קיבוע 2. הערה: עבור חלק זה, כל השלבים צריכים להיעשות על 4 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולשטוף תאים פעמיים עם 1 מ&quot;ל קר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 250 μL (סה&quot;כ) PBS קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד vortexing את הצינור בעדינות, לאט להוסיף dropwise 800 μL של -20 ° C אתנול 100%. זה מוביל לריכוז אתנול סופי של 70 - 80%. הערה: אתנול טוהר גבוה מומלץ בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים על קרח FOr 30 דקות. הערה: בשעה תאים בשלב זה יכול להישמר במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס או במשך כמה חודשים ב -20 ° C. </li></ol> 3. PI מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 500 עבור 10 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant בזהירות לשטוף תאים פעמיים עם 1 מ&quot;ל קר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ו resuspend כל המדגם עם תערובת הבאים: 1 מ&quot;ל PBS, 5 μL 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​RNaseA, 50 μL 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​יודיד propidium (PI; לערבב הבקבוק לפני השימוש). התאם ריכוז עד ~ 2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל). הערה: יש להרחיק מהישג אור - PI הוא רגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון דרך 35 מיקרומטר רשת לצינור קלקר 5 מ&quot;ל, וקרוב עם Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על RT בחושך, במשך 15 - 30 דקות. הערה: תאים מוכנים כעת לניתוח FACS. במידת הצורך, ניתן לאחסן את התאים מוכתם עבור 24 שעות לפחות ב 4 ° C בחושך. </li></ol> מיין 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מיין באמצעות מכונת FACS. לָנוּדואר הלייזר 561 ננומטר להבדיל תאים בהתבסס על עוצמת PI שלהם. לייזרים אחרים לקראת מקסימום עירור 535 ננומטר כמו 488 ננומטר או 532 ניתן להשתמש בהתאם לתצורת מכשיר FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תוצאות אופטימליות, השתמש הזרבובית הקטנה מומלצת בגודל התאים הספציפי (לרוב תאי 85 מיקרומטר). תיעדוף מצבים טוהר מעל התשואה. השתמש זרימה איטית יציבה, בדרך כלל עד 300-500 אירועים / s, עם לחץ נדן של 45 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות gating, להפלות תאים מתים ופסולת subcellular (FCS נמוך וגבוה SSC) על ידי התוויית FCS vs SSC. מן התאים קיימא להפלות כפילויות על ידי התוויית SSC-רוחב (W) לעומת SSC-גובה (H) ואחריו FSC-W לעומת העלילה FSC-H ועל ידי נרדף למלק W vs PI-H (כפילויות יהיה אותו ערך H אבל W-ערך גדול). עבור תאים בודדים קיימא לצייר היסטוגרמה של עוצמת PI-שטח (א) המייצגת את תוכן ה- DNA של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מיין לשלבים G1 ו- S, כפי שמוצג באיור 1. Gating עבור S צריך להיות רחב להפריע לשלבים G1 ו G2, בעוד gating G1 צריך להיות צר וככל מ S ככל האפשר. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55157/55157fig1.jpg" /> נחישות באיור 1. שלב מחזור התא מבוסס על עוצמת PI. היסטוגרמה המציגה את התפלגות תוכן DNA התאי (נמדד על ידי PI-Area) של האוכלוסייה פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF). תוכן DNA משמש כדי למיין את האוכלוסייה לשתי תאי G1 תת אוכלוסיות i) (תוכן 2N DNA) ו- II) תאים בשלב S (2N - 4N תוכן DNA), באמצעות האזורים המסומנים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55157/55157fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> הערה: מטרת האוסף של תאי G1 היא לתת דין וחשבון על הטיות היעילות הרצף בין אזורים גנומית השונים. אפליקציה חלופיתמקק הוא להשתמש בתאי נעצר G1 מאותו סוג התא. גישה זו נותנת תוצאות נקיות (כי יקטין זיהום שלב S) אבל זה עשוי להציג הטיות נובעות הבדלים גנטיים בין התאים נעצרו התאים נמדדים. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין בתנאים קרים ולאסוף תאים ממוינים לתוך 1.5 / 2 צינורות מ&quot;ל. שמור צינורות על קרח בעקבות המין. הערה: כדי לשפר את התאוששות DNA, עדיף להשתמש צינורות מחייב נמוכים או להשתמש צינורות מצופים 4 - 5% BSA 1 - 3 שעות ב 4 ° C 18. </li></ol> 5. ה- DNA טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה (G1 ו- S) לטהר DNA באמצעות ערכת טיהור DNA. הערה: בעת שימוש בערכה המסחרית, elute עם 400 μL חיץ elution לתוך צינור 2 מיליליטר עבור תשואה גבוהה, כפי שהומלץ על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק ריכוז ה- DNA באמצעות fluorometer. הערה: החל מ 100,000 בתאי יונקים שגבתה FACS, אחד צריך לקבל ~ 1 מיקרוגרם של ה- DNA. אt זה DNA בשלב יכול להישמר במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס או ב -20 ° C לאחסון ארוך. </li></ol> 6. Sonication <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר DNA לתוך צינור 1.7 מיליליטר התואם את המעמד המגנטי המשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתרכז DNA באמצעות חרוזים 2x SPRI פי הוראות היצרן, תוך שימוש לעמוד מגנטי, ו elute במאגר elution 50 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA Shear עם ultrasonicator ממוקד לגודל שיא היעד ממוצע של 250 נ&quot;ב. השתמש בהגדרות הבאות עבור דגימת DNA 50 μL: 50 W, גורם Duty 20%, 200 מחזורים פרץ, 20 ° C, 120 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הגודל של ה- DNA טעון על ידי אלקטרופורזה. התפלגות הגודל המומלצת היא 200 - 700 נ&quot;ב עם שיא ב ~ 250 נ&quot;ב. הערה: בשעה DNA בשלב זה יכול להישמר במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס או ב -20 ° C לאחסון ארוך. </li></ol> כנת הספרייה 7., סידור הערה: הכנת ערכות ספרייה רבות ושונהפלטפורמות רצף ent אמורות לעבוד, זהה לאלו המשמשים אותנו ואת שהוזכרו בסעיף החומרים. בפועל בעבר, מפות TOR נוצרו בשיטה דומה מאוד עם פלטפורמות microarray 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ספריות באמצעות כל ערכת כנת הספרייה מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הכנה הספרייה, בחר גודל באמצעות חרוזים מגנטיים עבור 300 - 800 נ&quot;ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכנת ספריות, למדוד ריכוז ה- DNA באמצעות fluorometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את גודל ה- DNA באמצעות אלקטרופורזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע רצף על כל פלטפורמה. הערה: רצף לפחות 10 M קוראים לדגימה מומלצת. עומק זה שווה לקרוא בערך כל 300 נ&quot;ב (עבור ~ 3 הגנום גודל Gb), והוא מספיק למדידות TOR ברזולוציה של 50 - 100 kb. הגדלת העומק יגרום לירידת גודל החלון ובכך תאפשר הגדלת רזולוציה בודאות גבוהה. רצף סוף לזווג אין צורך בבפרוטוקול זה משום שמידע כיסוי רק נאסף. זה, לעומת זאת, עשוי לעזור בפתרון המיקום של קורא המכילים רצפים חוזרים. </li></ol> ניתוח 8. הערה: ניתוח נתונים מבוסס על השיטה על ידי אל א קורן et. 19. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתונים רצפו מפת הגנום התואם באמצעות bowtie2 או כל aligner קריאה קצרה אמינה. הגדר בגודל משתנה, חלונות כרומוזומליות שווה-כיסוי כמגזרים מכוסה על ידי 200 קורא בשבריר G1 ולספור שלב S קורא באותה חלונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את יחס S / G1 לכל חלון. זה אמור ליצור מפה עם תנודות גדולות יחס S / G1 לאורך הגנום (איור 3). שליטה טובה על האמינות של מדידות TOR היא להשוות את המפה הזאת ליחס G1 / G1 (משתי מדידות נפרדות של G1) שאמורה להיות להחמיא הרבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הנתונים ל -0 מתכוון 1 SD על ידי הפחתת כל נalue הערך הממוצע של כל החלונות (למעט כרומוזום X) ו בחלוקת תוצאות לפי סטיית התקן של ה- G1 S / של כל החלונות. הדבר נעשה על מנת להמיר ציוני z ולאפשר השוואה בין ניסויים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל אזורי הפער הרשומים על ידי דפדפן הגנום UCSC וכן כל שבר פער בין נותרים המכילים פחות מ -15 חלונות נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק מה את השאריות עם שגם החלקה מעוקבת דרך csaps פונקצית Matlab עם פרמטר 10 - 16 ו לשרבב בנקודות סט כל 100 kb. הערה: פרמטרים של החלקה אינטרפולציה צריך להיות מותאם בהתאם לעומק של הנתונים. שיטות ופונקציות החלקה מתאימות אחרות קיימות וניתן להשתמש בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חזותי המאשר את האמינות של כל לשכפל, למזג את כל הקורא ולחשב פרופיל ברזולוציה עמוק על ידי ביצוע אותו התהליך שתואר לעיל על נתונים אלה. </li></ol>

<ol>
	<li>Farkash-Amar, S., Simon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+replication+program+in+mammals.">Genome-wide analysis of the replication program in mammals.</a> Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).</li><li>Yaffe, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+DNA+replication+timing+reveals+conserved+large-scale+chromosomal+architecture.">Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture.</a> PLoS Genet. 6 (7), e1001011 (2010).</li><li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+replication+domains+during+embryonic+stem+cell+differentiation.">Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS Biol. 6 (10), (2008).</li><li>Rivera-Mulia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+replication+timing+and+gene+expression+during+lineage+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).</li><li>Ryba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+developmental+control+of+replication-timing+domains+in+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia.">Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).</li><li>Farkash-Amar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+organization+of+replication+time+zones+of+the+mouse+genome.">Global organization of replication time zones of the mouse genome.</a> Genome Res. 18 (10), 1562-1570 (2008).</li><li>Koren, A., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+replication+of+the+inactive+X+chromosome.">Random replication of the inactive X chromosome.</a> Genome Res. 24 (1), 64-69 (2014).</li><li>Mukhopadhyay, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+genome-wide+profiling+in+human+primary+erythroblasts+reveal+replication+program+organization.">Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization.</a> PLoS Genet. 10 (5), e1004319 (2014).</li><li>McNairn, A. J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenomic+replication:+linking+epigenetics+to+DNA+replication.">Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication.</a> Bioessays. 25 (7), 647-656 (2003).</li><li>Sima, J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+correlations:+replication+timing+and+mutational+landscapes+during+cancer+and+genome+evolution.">Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution.</a> Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).</li><li>Kenigsberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mutation+spectrum+in+genomic+late+replication+domains+shapes+mammalian+GC+content.">The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content.</a> Nucleic Acids Res. 44 (9), 4222-4232 (2016).</li><li>Woo, Y. H., Li, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+timing+and+selection+shape+the+landscape+of+nucleotide+variation+in+cancer+genomes.">DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes.</a> Nat Commun. 3, 1004 (2012).</li><li>Liu, L., De, S., Michor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+timing+and+higher-order+nuclear+organization+determine+single-nucleotide+substitution+patterns+in+cancer+genomes.">DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes.</a> Nat Commun. 4, 1502 (2013).</li><li>Goren, A., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicating+by+the+clock.">Replicating by the clock.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 25-32 (2003).</li><li>Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+DNA+replication+time+zones+by+fluorescence+in+situ+hybridization.">Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization.</a> EMBO J. 11 (3), 1217-1225 (1992).</li><li>Smith, L., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+replicating+timing+combined+with+fluorescent+in+situ+hybridization.">Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. (70), e4400 (2012).</li><li>Simon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asynchronous+replication+of+imprinted+genes+is+established+in+the+gametes+and+maintained+during+development.">Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development.</a> Nature. 401 (6756), 929-932 (1999).</li><li>Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coating+agents+for+cell+recovery.">Coating agents for cell recovery.</a> Google Patents. , (1993).</li><li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+relationship+of+DNA+replication+timing+to+different+forms+of+human+mutation+and+variation.">Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation.</a> Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).</li><li>Rhind, N., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+timing.">DNA replication timing.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).</li><li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+human+DNA+replication+timing.">Genetic variation in human DNA replication timing.</a> Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

CNR-תור יכול להתבצע באופן עקרוני על כל אוכלוסיית תאים מתרבים האיקריוטים כי ניתן לחלק ידי FACS ל S ושלבי G1 (נבדק על ידי Rhind נ וגילברט DM 20). השיטה המתוארת כאן הותאמה בתאי יונקים עם גודל הגנום של ~ 3 Gb כגון אדם ועכבר. שינויים קטנים בפרוטוקול CNR-התור (בהכנת תא ועומק רצ?...

שכפול הדנ&quot;א יונקים קיים רגולציה הדוקה כדי להבטיח את השכפול המדויק של כל כרומוזום בדיוק פעם אחת במהלך מחזור התא. שכפול מתרחש על פי צו פיקוח הדוק - מספר אזורים גנומית גדולים (~ Mb) לשכפל בתחילת שלב S (מוקדם משכפלי תחומים) ואילו אזורים גנומית אחרים לשכפל מאוחר יותר באמצע או בשלב מאוחר (באמצע המשכפלים מאוחר תחומים) 1. רוב הגנום משכפל בעת ובעונה אחת בכל הרקמות (דומיינים TOR מכוננים), ואילו 30% - 50% של הגנום, משנה TOR שלה בין רקמות 2, במהלך התמיינות 3, 4, ובמידה פחותה גם במהלך הטרנספורמציה סרטן 5 . יתר על כן, אזורים הגנומי מסוימים לשכפל אסינכרוני 6, 7, 8, כלומר יש הבדלב TOR בין שני אללים. TOR בקורלציה עם תכונות רבות גנומי epigenomic כולל רמות שעתוק, תוכן GC, המדינה הכרומטין, צפיפות הגן, וכו &#39;1, 9. TOR קשורה גם קצב מוטציות וסוגים 10, 11 ולכן לא מפתיע, הפרעות של התכנית שהכפולה קשורות לסרטן 12, 13. הקשר הסיבתי בין TOR ומבנה הכרומטין אינו מובן עדיין. יתכן כי הכרומטין פתוח הופך לפשוט שכפול מוקדם. עם זאת, מודל אלטרנטיבי עולה כי הכרומטין הוא כינס במהלך שכפול ואת הרגולטורים הכרומטין שונים שנכחו את ההתחלה ואת הסוף של עופרת S שלב דיפרנציאלי אריזה של אזורים מעתיק מוקדמים ומאוחרים 1, 14 </sup&gt;. הראינו לאחרונה כי TOR מעצבת את התוכן GC על ידי המשפיע על סוג של מוטציות המתרחשות באזורים גנומי שונים 11. קרינת הכלאה באתרו (FISH) היא השיטה העיקרית למדידת TOR ב לוקוסי פרט. הדבר מתבצע פשוט על ידי ספירת אחוז התאים בשלב S כי תערוכת אותות דג בודדים לעומת אחוז הכפילויות עבור נתון אלל 15, 16. שיטה חלופית, מורכב הדופק תיוג DNA עם BrdU, מיון תאים על פי תוכן DNA שלהם לנקודות זמן מרובים לאורך S, immunoprecipitating DNA המכיל BrdU, ובדיקת שפע של DNA זירז עם qPCR 17. ניתן להשיג מיפוי הגנום TOR על ידי שתי שיטות. השיטה הראשונה היא גרסה הגנומי של שיטה המבוססת BrdU-IP שתואר לעיל, שבו כימות של סכוםDNA של זירז בכל שבריר נעשה בו זמנית עבור הגנום כולו באמצעות הכלאה כדי microarrays או רצף עמוק. השיטה השנייה, CNR-תור, מבוססת על מדידת מספר עותק של כל אזור גנומי של תאים בשלב S ו נרמול ידי תוכן DNA בתאים G1. בשיטה זו, תאים מסודרים על ידי FACS אל הלא מעתיק (שלב G1) משכפלים (שלב S) קבוצות (איור 1). תאים ב- G1 יש את אותו מספר עותק בכל האזורים הגנומי ובכך תוכן DNA שלהם צריך להיות זהה. מצד השני, מספר עותק דנ&quot;א S תלוי TOR, מאז אזורים מעתיקים מוקדם עברו שכפולים ברוב התאים ולכן תוכן DNA שלהם מוכפל, ואילו האזורים מעתיקים מאוחר לא משוכפלים עדיין ברוב התאים ולכן תוכן DNA שלהם יהיה להיות דומה לזה של תאי G1. מכאן S יחס G1 של תוכן DNA מעיד על TOR. כמות ה- DNA לכל איזור גנומי נמדדה באמצעות הכלאהmicroarrays או רצף עמוק 2, 8. יתרונותיה של שיטת CNR-התור יידונו גם. מאמר זה מתאר את שיטת CNR-תור למיפוי הגנום TOR כמתואר באיור 2. הנייר דן את הפרטים הקטנים של התהליך כולו מגביית תאים עד הניתוח הבסיסי של התוצאות ויצירת מפות גנומי TOR. הפרוטוקול המתואר במאמר זה שבוצע בהצלחה על סוגי תאים שונים הגדלים בתרבית. שיפורים עתידיים של פרוטוקול זה יכול להוביל את המיפוי של TOR in vivo ו סוגי תאים נדירים.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap&amp;nbsp;</td><td>BD-Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Gadot</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-A 10 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>Propidiom iodide 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL DNA LoBind Eppendorf tubes&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL MaxyClear tube&amp;nbsp;</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>magnetic beads - Agencourt AMPure XP&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>M-series&amp;nbsp; -530092</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6 x 16 mm</td><td>Covaris</td><td>520096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis 2200 Tape station system</td><td>Agilent</td><td>D1000 ScreenTape</td><td></td></tr><tr><td>Seqeuncing - Illumina NextSeq system</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1001</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy kit for DNA purification</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>PureProteom Magnetic Stand</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU/FITC</td><td>DAKO</td><td>F7210</td><td></td></tr><tr><td>FACS sorter</td><td>BD</td><td>FACSARIA III</td><td></td></tr><tr><td>FACS software</td><td>BD</td><td>FACSDiva v 8.0.1</td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide determination of mammalian replication timing by dna content measurement

שכפול של הגנום מתרחש בשלב S של מחזור התא בתהליך פיקוח הדוק שיבטיח את הנאמנות של שכפול ה- DNA. אזור גנומי כל משוכפל בכל פעם ברורה בשלב S דרך ההפעלה בו הזמנית של מקורות מרובים של שכפול. זמן של שכפול (TOR) עולה בקנה אחד עם תכונות רבות גנומי אפיגנטיים והיא צמודה קצב מוטציות וסרטן. להבין את לעיני הגנומי של התכנית שכפול, בבריאות ובחולי הוא מטרה בעתיד גדולה ואתגר. מאמר זה מתאר בפרוטרוט את &quot;יחס מספר עותק של S / G1 למיפוי זמן הגנומי של שכפול&quot; השיטה (להלן בשם: CNR-תור), גישה פשוטה כדי למפות את הגנום רחב טור של בתאי יונקים. השיטה מבוססת על ההבדלים מספר עותק בין תאים בשלב S ותאי בשלב G1. שיטת CNR-התור מתבצעת 6 שלבים: 1. הכנת תאים מכתים עם יודיד propidium (PI); 2. סורG1 טינג ו- S תאי שלב באמצעות תא מופעל קרינת מיון (FACS); טיהור DNA 3.; 4. Sonication; 5. הכנת הספרייה וסדר; ו 6. ניתוח bioinformatic. שיטת CNR-התור היא גישה מהירה וקלה כי תוצאות מפות שכפולות מפורטות.

מפת TOR טיפוסית מוצגת באיור 3 עבור פיברובלסטים עובריים בעכבר (MEFs). נתון זה ממחיש את תהליך הניתוח שכן הוא מראה גם את הנקודות, אשר יחס S / G1 המנורמל עבור חלונות בודדים (שלב 8.3), כמו גם את הקו נובע החלקה מהעוקבת אינטרפולציה (שלב 8.5). <p class="jove_content" fo:keep...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement at JoVE.com

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

genome-wide-determination-mammalian-replication-timing-dna-content

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

8.4K Views.  Hebrew University of Jerusalem. We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Video: Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biology

<meta charset="utf8"></head><body>אלקטרופורזה ג'ל דו-ממדית לניתוח שכפול DNA ואירועי עיכוב מזלג

Electrophoretic Analysis of Replication Through Structure-Prone DNA Repeats Within the SV40-Based Human Episome

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This protocol describes how to analyze replication fork progression through structure-prone, expandable DNA repeats within the simian virus 40 (SV40)-based episome in human cells. In brief, upon plasmid transfection into human cells, replication intermediates are isolated by the modified Hirt protocol and treated with the DpnI restriction enzyme to remove non-replicated DNA. Intermediates are then digested by appropriate restriction enzymes to place the repeat of interest within the origin-distal half of a 3-5 kb-long DNA fragment. The replication intermediates are separated into two perpendicular dimensions, first by size and then by shape. Following Southern blot hybridization, this approach allows researchers to observe fork stalling at various structure-forming repeats on the descending half of the replication Y-arc. Furthermore, this positioning of the stall site allows the visualization of various outcomes of repeat-mediated fork stalling, such as fork reversal, the advent of a converging fork, and recombinational fork restart.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: אפיון שכפול DNA של חזרות פתוגניות כדי לחשוף מנגנונים של שכפול מזלג עיכוב והתפשטות

Here, we outline the procedure for analyzing replication progression through pathogenic, structure-prone repeats using 2-dimensional gel electrophoresis.

ניתוח אלקטרופורטי של שכפול באמצעות DNA נוטה למבנה חוזר בתוך אפיזום אנושי מבוסס SV40

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Proximity Ligation Assay to Study Oncogene-Derived Transcription-Replication Conflicts

Both DNA replication and RNA transcription utilize genomic DNA as their template, necessitating spatial and temporal separation of these processes. Conflicts between the replication and transcription machinery, termed transcription-replication conflicts (TRCs), pose a considerable risk to genome stability, a critical factor in cancer development. While several factors regulating these collisions have been identified, pinpointing primary causes remains difficult due to limited tools for direct visualization and clear interpretation. In this study, we directly visualize TRCs using a proximity ligation assay (PLA), leveraging antibodies specific to PCNA and phosphorylated CTD of RNA polymerase II. This approach allows precise measurement of TRCs between replication and transcription processes mediated by RNA polymerase II. The method is further enhanced through DNA primers conjugated covalently to these antibodies, coupled with PCR amplification using fluorescent probes, providing a highly sensitive and specific means of detecting endogenous TRCs. Fluorescence microscopy enables the visualization of these conflicts, offering a powerful tool to study genome instability mechanisms associated with cancer. This technique addresses the gap in direct TRC visualization, allowing for a more comprehensive analysis and understanding of the underlying processes driving genome instability in cells.

Here, we present a sensitive and specific method to detect oncogene-induced transcription-replication conflicts (TRCs) using the proximity ligation assay (PLA). This approach leverages specific antibodies targeting PCNA and phospho-CTD RNAPII, enabling the assessment of TRC prevalence between RNA polymerase II transcription and DNA replication machinery.

בדיקת קשירת קרבה לחקר קונפליקטים של שעתוק-שכפול שמקורם באונקוגן

Both DNA replication and RNA transcription utilize genomic DNA as their template, necessitating spatial and temporal separation of these processes. ...

Cancer Research

<meta charset="utf8"></head><body>התרת DNA בתיווך CMG שנצפתה על ידי צמיחת דרכי ssDNA-RPA

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: חשיפת הדינמיקה של שכפול דנ"א אאוקריוטי באמצעות הדמיה של מולקולה אחת

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

חזותי יחיד מולקולת הדנ"א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

ניתוח אלקטרופורטי של שכפול באמצעות DNA נוטה למבנה חוזר בתוך אפיזום אנושי מבוסס SV40

ניתוח אלקטרופורטי של שכפול באמצעות DNA נוטה למבנה חוזר בתוך אפיזום אנושי מבוסס SV40

ניתוח אלקטרופורטי של שכפול באמצעות DNA נוטה למבנה חוזר בתוך אפיזום אנושי מבוסס SV40

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

בדיקת קשירת קרבה לחקר קונפליקטים של שעתוק-שכפול שמקורם באונקוגן

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG