We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.

בעלי חיים: סוג Wild עכברים C57Bl / 6J bred באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג&#39;לס (UCLA). כל בעלי החיים היו בין 11 - בן 17 שבועות, וכלל זכר עכברות. כל העכברים היו שוכן קבוצה, שמור מחזור אור / חושך 12:12 עם כרצונך מזון ומים. כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות של UCLA והאגודה לחקר חזון הצהרת עיניים לשימוש של בעלי חי עיניים ו Vision Research. הערה: כל התרופות והסוכנים להזרקה הן ארצות הברית Pharmacopeia (USP) ציון. 1. הכנת כירורגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם זריקת intraperitoneal של 100 מ&quot;ג / קילו קטמין ו xylazine 8 מ&quot;ג / קילו תערובת מלוחה. נהל הרדמה עד לעומק כך העכבר אין קמצוץ בוהן או רפלקסים מגע קרניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על טמפרטורת הגוף על 37.0 מעלות צלזיוס עם כרית מים במחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתרחב תלמידים עם ד עין phenylephrine 2.5%ROPs לקצץ שפם כדי להקל להדמיה. שפם לספק קלט חושי משמעותי העכבר, ולכן, זיף זמירה צריך להסיר רק את החלק כי גישה חוסמת ברורה לעין, ולא בבסיס השערה. מניסיוננו, עכברים להראות התאוששות רגילה לאחר הליך זה. החל עין methylcellulose טיפות למניעת יובש ולמזער קטרקט חולף מושרה הרדמת 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מכשירים לפני ניתוח (כלומר, בבטאדין ואתנול או חרוזים חמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן והעמסה מדוללת (0.01% באמצעות מי מלח 0.9%) בסביבת סטרילית (כלומר, ארון בטיחות ביולוגי) אם להדמיה תבוצע (ראה סעיף 3 להלן). </li></ol> 2. הזרקת הכנת האתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין מזרק (למשל, 5 μl מזרק) עם נפח ההזרקה המתאים (למשל, 0.3 כדי 1.0 מיקרוליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העכבר כך העין פונה כלפי מעלה נראה בבירור dissecting מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות קמצוץ הלחמית הזמני עם מלקחיים קנס היטה. לעשות חתך היקפי של כ 90 מעלות באמצעות מספרי Vannas מעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.3 עם הקפסולה של שבבסיס שֶׁגֶם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכרות את רקמת החיבור שמסביב עם מלקחיים קנס היטה תוך סיבוב הגלובוס nasally. לפעול הזריקה כ 0.5 מ&quot;מ הזמני אל עצב הראייה. השתמש בזהירות רבה כדי למנוע שיבוש סינוס רטרו מסלולית. </li></ol> הזרקת 3. Sclerotomy ו subretinal הערה: מומלץ כי הזרקת והעמסת 0.01% ב 0.9% מלוחים לשמש כדי לסייע עם להדמיה תוך לימוד הליך זה. החלוקה הטופוגרפית של והעמסה אפשר לתעד בצורה יעילה עם הדמיה הפונדוס (ראה סעיף 4 להלן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך scleral קטן במקום הזרקה ידי גירוד עיינית בעדינות עם להב עיני 22.5 מעלות. שו חתך זהLD להיות גדול מספיק רק כדי לאפשר את קצה המחט לעבור דרך בלובן העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט מהשופעת 33 G (זוויתי 5 -. 10 ° לתוך sclerotomy עם שפוע פונה ובמקביל זוויתי לרשתית להזריק נפח רצוי (למשל, 0.3 ל 1.0 מיקרוליטר של 0.01% והעמיסו למטרות למידה). הערה: לשמור על סטריליות של המזרק על ידי ניקוי יסודי עם שטיפות רצופות של ממס מתאים DI מים לפני כל זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוחץ על המתג לאט (מעל ~ 3 שניות) מבלי להזיז את המחט עם הפעלת לחץ. הערה: כאשר המחט נמצאת במרחב subretinal, התנגדות קלה תורגש בעוד מדכא את הבוכנה. לא יהיה התנגדות מינימאלית אם מחט מפוצצת הרשתית, עמידות גבוהה אם המחט אינה חודרת בלובן העין או רשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו כמה שניות לפני הוצאת המחט כדי למזער backflow. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את העין עם בופר סטרילי ולהבטיח את h העיןכמו לסובב בחזרה למצב הרגיל שלו. </li></ol> הערכה 4. של הפרדות רשתית על ידי אוקטובר ו הפונדוס הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הדמיה אוקטובר מיד לאחר ההזרקה כדי להעריך את איכות הזריקה בשלב המתאים מצביע לאחר ההזרקה לפי הצורך להעריך מבנה הרשתית. הערה: דוגמאות לשימוש של אוקטובר במחקרים דומים תוארו בעבר 7,14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם וליישר את התמונה אוקטובר למקד באתר ההזרקה. הזריקה צריכה להיות קו אמצע ו -0.5 מ&quot;מ זמני אל ראש עצב הראייה. חזור לפי הצורך אם ההתנתקות היא מחוץ למסגרת או לא מרוכז בצורה אופטימלית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו היפרדות רשתית לצבוע באזור ההזרקה עם הדמיה הפונדוס en פנים 7,14. הערה: אם מערכת הדמית אוקטובר אינה זמינה, הזרקה של כמות קטנה של והעמסה עם וקטור לאימון תאפשר להדמיה עם כל מצלמת הפונדוס שמבצעת angio והעמיסgraphy באמצעות אותו אורכי גל עירור וחסימת מסננים. באזורי נקודות של קרינת Hyper יוצגו מתחת בכלי הדם ואת כלי הדם יהיו גבולות חדים וברורים ככל ששטחי subretinal הוא ממוקדים בצורה נכונה. הקצה של הבועה מן הזריקה יהיה מוגדר על ידי מעבר פיגמנטציית-יתר פלואורסצנטי הצבועה. מכשירים אחדים לספק יכולת זו העכבר; המכשור משמש כאן מתואר במקומות אחרים 14. </li></ol> טיפול 5. לאחר ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מעייל עבה של קרם עיניים אנטיביוטי משולש אל פני השטח של הקרנית של העין המוזרקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח עכברים בכלובים בודדים נקיים להתאוששות. אין לשלב עכברים שעברו ניתוח עד שהם החלימו לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג נשימה וטמפרטורה במהלך התאוששות הרדמה. צג חיות עד שהם יכולים לשמור על שכיבה sternal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניטור שלאחר הניתוח מתאים נוסףוטיפול, כולל הזרקה תת-עורית של carprofen (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) לניהול כאב לאחר ניתוח. </li></ol> 6. הערכה של תפקוד רשתית ידי Electroretinography (ERG) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מראש הזרקת ניתוח ERG ובזמנים המתאימים לאחר ההזרקה לפי הצורך להעריך תפקוד הרשתית. אם נעשתה הזריקה לחלל subretinal, הפרדות הרשתית צריכות לפתור תוך 72 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקות ERG תקן לאבחון תפקוד רשתית לפני ואחרי ההזרקה כפי שתואר לעיל 14,15. </li></ol></li></ol> שחזור 3D 7. וכימות נפח בועה הערה: Oct סריקות עם ניגודיות גבוהה המקיפה את הניתוק כולו בתוך המסגרת של נוף הם אופטימליות לשימוש. ImageJ / פיג&#39;י 17,18 ו Imaris שימשו, אך ניתן להשתמש בתוכנה אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הסריקה-ב של עניין, לייבא ImageJ / פיג&#39;י היבול (תמונה&gt; Crop) את החלק של SC אוקטוברלהיות המודל באמצעות כלי הבחירה המלבני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוונון ניגודיות (תמונה&gt; התאם&gt; הבהירות / ניגודיות) להתוות שום גבולות חסרים על ידי חיבור שני חלקים עם קו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר קו ישר עם כלי שורה (המשמרת מחזיקה) החובק את הרשתית לשכבת קולטי האור. מדוד (לנתח&gt; מדוד) אורך הקו כדי להשיג גודל של ניתוק מירבי צעד 7.8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבוא קצוץ מסגרות תוכנת 3D-השחזור (ראה טבלה של חומרים) באמצעות &quot;RGB לאפור&quot; תוסף ו MATLAB מהדר זמן ריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל voxel (תחת מאפייני תמונה) באמצעות פרמטרים כיול מן הסריקה אוקטובר (x, y, z). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוסף &quot;RGB כדי גריי&quot; (תחת מאפייני תמונה), עם שקלול שווה כל ערוץ, כדי ליצור ערוץ רביעי. מחק ערוצים האדום-ירוק-כחול המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הערוץ האפור באמצעות שינוי הניגודיות. Image Store. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;להוסיףEW שטח &quot;כפתור על כרטיסיית 3D-View, ולהתחיל בתהליך צעד 4 מודרך יוצר את פני השטח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפירוט פני השטח (שלב 1 מתוך 4). הערה: מניסיוננו 8.0 כדי 12.0 היה הטווח היעיל ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל כדור המרבי (תחת בחירת רקע) כדי מעט פחות מגודל הניתוק המרבי שנמדד 7.1.2. צור את השטח ולבטל היפוך ערוץ אפור (שלב 2 מתוך 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את סף לערך המקסימאלי כך את פני השטח של הרווחים השליליים מחוץ הרשתית ושל היחידה אינו באים במגע (שלב 3 מתוך 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הסוג מסנן למספר ווקסלים ולבודד את החלל השלילי באתר הניתוק לפי גודל. לסיים את פני השטח (שלב 4 מתוך 4). הערה: היקף שטח הניתוק ממוקם מתחת נפח בלשונית הסטטיסטיקה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Garoon, R. B., Stout, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+ocular+gene+therapy+and+advances+in+treatment+of+inherited+retinal+diseases+and+exudative+macular+degeneration.">Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration.</a> Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).</li><li>Pierce, E. A., Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Status+of+RPE65+Gene+Therapy+Trials:+Safety+and+Efficacy.">The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).</li><li>Tolmachova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+Rab+escort+protein+1+following+AAV2-mediated+gene+delivery+in+the+retina+of+choroideremia+mice+and+human+cells+ex+vivo.">Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo.</a> J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).</li><li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque.">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li><li>Ye, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+Biodistribution+Evaluation+in+Cynomolgus+Macaques+of+rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3,+a+Recombinant+AAV+Vector+for+Treatment+of+Achromatopsia.">Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Corneal+Subretinal+Injection+in+Mice+and+Its+Effect+on+the+Function+and+Morphology+of+the+Retina.">Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina.</a> PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).</li><li>Engelhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+retinal+pigment+epithelium+cells.">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells.</a> Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).</li><li>Lambert, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+AAV2.COMP-Ang1+suppresses+choroidal+neovascularization+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+a+murine+model+of+age-related+macular+degeneration.">Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration.</a> Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).</li><li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice.">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).</li><li>Nusinowitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+visual+function+in+the+rd12+mouse+model+of+Leber+Congenital+Amarousis+(LCA)+after+gene+replacement+therapy+to+restore+retinal+function.">Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function.</a> Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).</li><li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+human+retinal+progenitor+cells+under+Cyclosporin+A+treatment.">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment.</a> Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).</li><li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber's+congenital+amaurosis.">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li><li>Ridder, W. . 3. r. d., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+of+cataract+development+in+anesthetized+mice.">Causes of cataract development in anesthetized mice.</a> Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).</li><li>Ridder, W. H. 3. r. d., Nusinowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+visual+evoked+potential+in+the+mouse--origins+and+response+characteristics.">The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics.</a> Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).</li><li>Matynia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+are+the+primary+but+not+exclusive+circuit+for+light+aversion.">Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion.</a> Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li></ol>

None of the authors have any commercial disclosures.

זריקות subretinal הן את שיטת בחירה עבור המשלוח של וקטורים ויראליים גזע טיפול תאים שמקורם מניפולציה קולטני אור ואת הרשתית הוא במחקר בסיסי טיפול מרפאתי. בחולים, זריקות subretinal נעשים בדרך כלל עם sclerotomy הקדמי ליד פלאנה Pars, vitrectomy הליבה האחורי וחדירה של הרשתית על ידי מחט עם להדמיה ...

זריקות subretinal הן האמצעי העיקרי של אספקת סוכנים הסלולר ויראלי אל הרשתית של עכברים ללמוד והשפיע על קולטני אור ואת 1,2 שבבסיס הרשתית. רוב פרוטוקולי הזרקת subretinal בעכברים להשתמש transcorneal או קדמי זריקת transcleral לקו המשווה (איור 1). גישה זו יכולה לגרום נזק סביבתי הגלום הכולל שסחב ו ערפול כתוצאה של העדשה, שיבוש של שלמות, חדירה הזגוגית של הרשתית הנוירו ואיריס, דימום ברשתית, היפרדות רשתית משמעותי ובצקת subretinal קיימא 3-9. מניפולציות ניסוייות חייבות להתגבר על תופעות אלה על מנת להעריך את ההשפעות של התערבויות טיפוליות 3,7,10,11. מחקר זה מספק תיאור מפורט ואימות של שיטת הזרקה אחורית transcleral כי תמנע סיבוכים אלה, ממזער טראומה בעל שיעור הצלחה גבוה של מיקוד המשנהשטח הרשתית. זריקות מיקוד במרחב subretinal בעכברים הן בדרך כלל מאוד קשות לביצוע רוב החוקרים נתקלים בתדירות גבוהה של ניסיונות כושלים שבו הווקטור מועבר על מיקום לא נכון או שיש פגיעה ברשתית משמעותית, למשל היפרדות רשתית מלאה 6. מספר העיניים מחוץ ניתוח עקב סיבוכי הזרקת בדרך כלל אינו מדווח במחקרי עכבר, אבל הניסיון שלנו והן בדיון עם חוקרים אחרים, מספר זריקות נכשלו יכולה להיות גבוהים ככל 50% ולגוון תלוי הניסיון יכולות של החוקר שמבצע את הזריקות. ההצלחה של ההזרקה נבחנת בדרך כלל על ידי הדמיה הפונדוס ישירה ו / או טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (אוקטובר) 7,9. שיטה לשלוט בקלות עם שיעורי הצלחה גבוהים עבור זריקות subretinal בעכברים יכול לזרז ניסויים ולהפחית את העלות של מחקרים פרה של טרהatments למחלות רשתית כי הם הגורמים העיקריים לעיוורון בארצות הברית. האחורי, טכניקת הזרקת subretinal transcleral המתוארת כאן היא עיבוד פרוטוקולים קליניים פרה-קליניים 9,12. הערכות האבחנתיות פולשנית שבוצעו עכברים שהוזרקו להדגים ניזק עדין מאוד מקומי וחסרי עדשה בטוחה נוספת ברשתית ופגיעת רשתית. יתר על כן, עם קצת אימון יחסית, נסיין יכול להשיג את התוצאות הללו עם שיעור הצלחה גבוה (80 - 90% או יותר), ובכך להפחית את העלויות הכרוכות מחקרים כאלה. הליך זה יכול לשמש כדי לספק הסלולר, ויראלי, או התערבויות טיפוליות תרופתיות כדי קולטני אור ו / או רשתית במחקרים פרה-קליניים להעריך התערבויות ניסיוני בקלות.

<table><tbody><tr><td>Hamilton Model 62 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>87942</td><td>Syringe x 1</td></tr><tr><td>Hamilton Needle 33 G, 1.0&quot;, 20 DEG, point 3 (304 stainless steel)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Needles x 6</td></tr><tr><td>Vannas Curved Scissors</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>1347</td><td>5 mm Blade</td></tr><tr><td>22.5 Degree Microsurgery Knife</td><td>Wilson Ophthalmic Corp.</td><td>91204</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&amp;nbsp;</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-609-02</td><td>Ketamine</td></tr><tr><td>Anased</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NDC 61311-482-10</td><td>Xylazine</td></tr><tr><td>Fluorescein 10% AK-Fluor</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-253-10</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>0.9% Saline USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-50</td><td>0.9% NaCl</td></tr><tr><td>Antibiotic Ointment</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>Ophthalmic</td></tr><tr><td>Water Circulating Pump</td><td>Gaymar</td><td>TP-500 T/Pump&amp;nbsp;</td><td>P/N 07999-000</td></tr><tr><td>sd-OCT</td><td>Bioptigen</td><td>R-Series</td><td>Commercial</td></tr><tr><td>Fundus Camera</td><td>Phoenix Research Laboratories</td><td>MICRON III</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Type 3</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>5385-3SU</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Phenylephrine</td><td>Paragon BioTeck</td><td>NDC 42702-102-15</td><td>Ophthalmic</td></tr><tr><td>IMARIS8</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Version 8.1.2</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>V1.8.0_77</td></tr><tr><td>Hypromellose&amp;nbsp;2.5%</td><td>Goniovisc</td><td>AX0401</td><td>Methylcellulose</td></tr><tr><td>Eye Drops (Rinse)</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td></td><td>Saline Solution</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>Microscope</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Fostec</td><td>P/N 20520</td><td>Light source</td></tr></tbody></table>

an alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach

זריקות subretinal שימשו בהצלחה בשני בני אדם ומכרסמים לספק התערבויות טיפוליות של חלבונים, סוכנים ויראלי, ותאי לתא interphotoreceptor / subretinal כי יש חשיפה ישירה קולטני האור ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). זריקות subretinal של plasminogen וכן ניסויים פרה-קליניים וקליניים האחרונים הוכיחו בטיחות ו / או יעילות של מתן וקטורים ויראליים ותאי גזע ליחידים עם מחלת רשתית מתקדמת. מודלים עכבר של מחלת רשתית, במיוחד dystrophies רשתית תורשתי, חיוניים לבדיקת לטיפולים אלה. הליך ההזרקה הנפוץ ביותר במכרסמים הוא להשתמש transcorneal הקטן או חתכי transcleral עם גישה קדמית לרשתית. עם גישה זו, מחט הזריקה חודר הרשתית הנוירו לשבש את הרשתית הבסיסית ועל החדרת יכול בקלות ניק העדשה, גרימת עכירות העדשה וירידת ערך Imagi פולשניתng. גישה למרחב subretinal באמצעות transcleral, גישה אחורית תמנע בעיות אלה: המחט חוצה את בלובן העין כ 0.5 מ&quot;מ מן עצב הראייה, ללא חדירת רשתית ונמנעה לשבש את הזגוגית. נזק סביבתי מוגבל כי הקשורים מוקדי sclerotomy ואת ההשפעות של חולף, היפרדות רשתית הצפק. הפשטות של השיטה ממזער פגיעה עינית, מבטיחה שחיבור רשתית מהיר והתאוששות, ויש לו שיעור כישלון נמוך. הניזק המינימאלי רשתית הרשתית מאפשר הערכה ברורה של יעילויות התרופות ותופעות ישירות של הסוכנים הטיפוליים עצמם. כתב יד זה מתאר טכניקת ההזרקה subretinal הרומן, שניתן להשתמש בהם כדי למקד וקטורים ויראליים, סוכני תרופתי, תאי גזע או גזע מושרים (iPS) תאים למרחב subretinal בעכברים עם יעילות גבוהה, נזק מינימלי, והתאוששות מהירה.

אחורי גישת זריקות subretinal transcleral בוצעו ב -31 עיני בריאות מ -16 עכברים פראיים סוג עם זריקות של 0.3 μl (n = 18), 0.5 μl (n = 8) ו 1.0 מיקרוליטר (n = 5) של והעמסת 0.01%. עין אחת לא נכללה הזרקה בשל אטימות קרניות קיימות שמנעו ניתוח מבני ותפקודי. כל עין מוזרקת נכללת בדוח זה. אין היפר...

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach at JoVE.com

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal<i&gt; דרך</i&gt; בגישה אחורית Transcleral

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

an-alternative-validated-injection-method-for-accessing-subretinal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

13.1K Views.  University of California, Los Angeles. Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Video: An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Medicine

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

צעד אחר פרוטוקול שלב לכירורגיה subretinal בארנבונים

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית במודל פרימטים לא אנושי למחלות רשתית ניוונית

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. Subretinal transplantation of therapeutic donor cells into mouse recipients is challenging due to the limited surgical space allowed by the small volume of the mouse eye. We developed a trans-scleral surgical transplantation platform with direct transpupillary vision guidance to facilitate the subretinal delivery of exogenous cells in mouse recipients. The platform was tested using retinal cell suspensions and three-dimensional retinal sheets collected from rod-rich Rho::EGFP mice and cone-rich OPN1LW-EGFP;NRL-/- mice, respectively. Live/dead assay showed low cell mortality for both forms of donor cells. Retinal grafts were successfully delivered into the subretinal space of a mouse model of retinal degeneration, Rd1/NS, with minimum surgical complications as detected by multimodal confocal scanning laser ophthalmoscope (cSLO) imaging. Two months post-transplantation, histological staining demonstrated evidence of advanced maturation of the retinal grafts into &#39;adult&#39; rods and cones (by robust Rho::EGFP, S-opsin, and OPN1LW:EGFP expression, respectively) in the subretinal space. Here, we provide a surgical platform that can enable highly accurate subretinal delivery with a low rate of complications in mouse recipients. This technique offers precision and relative ease of skill acquisition. Furthermore, the technique could be used not only for studies of subretinal cell transplantation but also for other intraocular therapeutic studies including gene therapies.

This protocol presents a transpupillary vision-guided trans-scleral approach to safely and precisely deliver subretinal cellular grafts, with a low rate of surgical complications, in mouse recipients with or without retinal degeneration.

השתלה טרנס-סקלרלית מונחית אישונים של שתלים תת-רשתית במודל עכבר ניוון רשתית

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

מראה מחייה: טיפול בתאי גזע לניוון הרשתית

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

מחבר זרקור: קידום שיקום ראייה - טיפול מבוסס תאי גזע למחלות רשתית 

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

צעד אחר פרוטוקול שלב לכירורגיה subretinal בארנבונים

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית במודל פרימטים לא אנושי למחלות רשתית ניוונית

השתלה טרנס-סקלרלית מונחית אישונים של שתלים תת-רשתית במודל עכבר ניוון רשתית

העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10

העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10

העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10