Name: isolation and culture of primary endothelial cells from canine arteries and veins
Uploaded: 2016-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins at JoVE.com

The authors would like to acknowledge Hans de Graaf and Tomas Veenendaal for their technical assistance in culturing the ECs.

אתיקת הצהרה: כלי דם השתמשו במחקר זה נבצרו כחומר עודף המתקבל גוויות כלבים טריות (n = 4) מכלבים בריאים מורדמים למחקר קשור אחרת (מדיניות האוניברסיטה 3R). כלי הדם סוטה (shunts portosystemic התוך extrahepatic, n = 1 כל אחד) נבצרו שלאחר המוות לאחר הסכמה מדעת של בעלי מכלבים בפני מרפאת אוניברסיטת עבור חיות של אוניברסיטת אוטרכט. 1. ניתוק והתרבות של תאים האנדותל לכלבים ראשיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מעיל 6-גם צלחות עם 2 מ&quot;ל / גם 0.5% w / v ג&#39;לטין ולהשאיר למשך 2 שעות באינקובטור עם אווירה humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. סור פתרון ג&#39;לטין עודף לפני זריעת התאים הראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקיה מחיידקים, להסיר את כלי הדם (ים) של עניין (למשל, אב עורקים, וריד נבוב, נבוב פורטה) מתוך (איור 1 א) פגר כלב טרי. לשמור על האנטומיה של מערכת כליעל ידי הצבת מלקחיים ישרים בשני הקצוות של כלי השיט של עניין. הימנע מניפולציה מיותרת של הרקמה עם מלקחיים כדי למנוע נזק לתאי אנדותל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הכלי המהודק בשני הקצוות עם מספרי כירורגיות ומסיר את הגופה. תחבורה תמיסת המלח המאוזן של האנק (HBSS) על קרח. הערה: כלי באורך של כ -5 סנטימטר היא מועדף עבור הליך זה, אבל אלה המודדים 1 סנטימטר גם יספקו מספיק תאים לתרבות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את כלי הדם כדי בצלחת פטרי המלאה HBSS קר כקרח. בעזרת מספרי כירורגיות, להסיר את כל רקמת שומן חסיד מהחלק החיצוני של הספינה, שמירה על הכלי עצמו ללא פגע (איור 1 ב). ודא הכלי נראה בבירור בכל העת כאשר חיתוך: מסיט הצידה את הרקמה שמסביב עם מהדק או מלקחיים עבור תצוגה אופטימלית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את כל הסניפים של כלי השיט עם ליגטורה (למשל, polyglactin 3-0) ובהמשך להסיר אותםעם מספריים כירורגיות או אזמל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להזין סוף כלי עם מלקחי יתוש מעוקלים הלסטד, מהדק את קצה המלקחיים בקצה השני של הספינה ולאחר מכן לחזור בו, היפוך הכלי לאט עד שהוא לגמרי מבפנים החוצה (איור 1 ג-ז). מבחוץ עכשיו מורכב של שכבת תא האנדותל. אם כל קושי הוא נתקל על היפוך הכלי, לצלול HBSS שוב כדי להפחית את החיכוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים התפרים הארנק מיתרים בשני קצותיו של כלי השיט כדי לסגור אותו לחלוטין כדי למנוע חשיפה של כל רקמת כלי הדם הלא-אנדותל לנוהל העיכול (1H איור). השתמש הקצוות ליגטורה לתפעל את הכלי ההפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עיכול והתרבות מתבצע מאוחר יותר, cryopreserve הספינה ההפוכה לפני פרוטוקול העיכול (שלב 1.7). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הכלי ההפוך בתוך cryovial ולמלא עם תרבית תאי הקפאה בינונית. להקפיא עד -80 ° C באמצעות שיתוף הקפאהntainer. חנות ב -80 ° C אם כלי ישמשו בתוך שבוע. עבור אחסון לטווח ארוך, במקום cryovials ב -180 מעלות צלזיוס. בעת ביצוע הבידוד EC, להפשיר את cryovials במהירות באמבט מים (37 מעלות צלזיוס) ומכניסים מיד HBSS קר כקרח. המשך כמצוין 1.7. הערה: קח בחשבון כי התשואה הכוללת של ECS לאחר הבידוד תהיה נמוכה כתוצאה מאובדן כדאיות במהלך תהליך ההקפאה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הכלי לצינור 50 מ&quot;ל ולשטוף אותו פעמים HBSS להסיר אריתרוציטים (או בינוני הקפאה שיורית במקרה של הפשרה) (איור 1 ט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את כלי בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל עם פתרון מסוג 30 מ&quot;ל collagenase השנייה (0.15 U / ml) ו dispase (0.15 U / ml) בתאי האנדותל לכלבים צמיחה בינוני (CECGM) במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס עם לסירוגין עדין תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכלי מצינור צנטריפוגות השעית התא במשך 5 דקות ב 250 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה תא CECGMnd ההשעיה תא מ&quot;ל זרע 2 לכל טוב (1 - 3 בארות בהתאם לגודל כלי). התרבות התאים ב 37 ° C באווירה humidified עם 5% CO 2 באוויר ולשנות את המדיום תרבות פעמיים בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר התאים כאשר confluency של 70 - 80% הוא הגיע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם HBSS מחומם מראש כדי להסיר תאים מתים או שאינם מחוברים. הוסף 200 μl אנזים רקומביננטי תא דיסוציאציה (1x) זה טוב ומניח בחזרה בחממה במשך 5 דקות או עד שכל התאים מנותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את התאים לצינור 15 מ&quot;ל ולעצור trypsinization ידי הוספת 10 מ&quot;ל של התקשורת בתרבות (CEGM) כולל 10% עוברית עגל בסרום (FCS). צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 250 x. המשך התרבות צלחת או בקבוק מראש מצופה ג&#39;לטין. </li></ol></li></ol> אפיון 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאי אנדותל התרבות כלבים אבי העורקים (CnAOECs) ולהשוות את המורפולוגיה של שורות תאים ראשוניים מסחרי פעמיים בשבוע עם מיקרוסקופ. הערה: Tהוא אופייני גדל דפוס של ECS בטלאים יכול להיות הכי טוב שנצפה כאשר confluency של&gt; 70% הוא הגיע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות CnAOECs ב CECGM על ג&#39;לטין 0.5% w / v מצופה מראש בבקבוק T75. תאי מעבר פעם בשבוע כאשר confluency הוא 70 - 80%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת passaging, לשטוף את התאים פעם עם HBSS מחומם מראש ולהוסיף 1 מ&quot;ל אנזים התא דיסוציאציה רקומביננטי (1x). מניח את הבקבוק בחזרה בחממה במשך 5 דקות או עד שכל התאים מנותקים. להשבית טריפסין על ידי הוספת בינוני תרבות 10 מ&quot;ל (CEGM) כולל 10% FCS. צנטריפוגה ההשעיה תא במשך 5 דקות ב 250 XG, וזורקים supernatant ו resuspend התאים במדיום תרבות 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו aliquot 10 μl של ההשעיה תא לדלל 1: 1 עם 0.4% trypan כחול. ספירת התאים באמצעות דלפק תא אוטומטי, צלחת החוצה 4.0 x 10 5 תאי קיימא בבקבוק T75 חדש. הוסף 10 מ&quot;ל של מחומם מראש CECGM אל הבקבוק ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified עם 5% CO 2. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד RNA מפסוק 1 של CaPECs התרבותי CnAOECs. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף לפחות 1 x 10 3 תאים כמו גלולה, להוסיף 20 μl של מגיב הכנת המדגם (SPR) ו דגירה של 1 דק &#39;כדי lyse התאים. לאחר דגירה, בזהירות לאסוף את lysate התא המכיל RNA ולאחסן הכולל ב -70 ° C.. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת mRNA כדי cDNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA (למשל, iScript) בהתאם להוראות היצרן. cDNA חנות ב 4 ° C עד שבוע, או ב -20 ° C לטווח ארוך עד מוכן לבצע את qPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ביטוי גנים של CD31 סמן אנדותל לאשר ממוצא תא האנדותל. בצע התקנה ניסיונית וכימות באמצעות הנחיות תמצית MIQE 10. לנורמליזציה, למדוד ביטוי של גנים התייחסות GAPDH, RPS19, ו B2MG 11. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול של פי 10 של cDNA שהושגו מים חינם nuclease. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכיןדילול של פי 4 ממדגם cDNA ונקוו עבור הקו הרגיל ולהשתמש מים חינם nuclease כביקורת הלא תבנית. לדלל את הדגימות חמש פעמים להגיע דילול כולל של פי 50 לתגובות qPCR. פיפטה 10 תגובות μl בשני עותקים בפורמט 384 גם באמצעות 4 cDNA μl ו -6 μl של fluorophore מעורבב עם 20 pmol של הפוך פריימר קדימה (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התוכנית עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עבור הפעלת פולימראז תקי, ואחריו 39 מחזורים של 10 שניות על 95 מעלות צלזיוס למשך denaturation, ו -30 שניות ב Tm עבור חישול התארכות. ה- TM עבור כל קבוצה פריימר מוצג בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע המסת עקומת המנתח הבאה כל ריצה כדי להבטיח מוצר אחד בלבד מוגברת. לנרמל את רמות הביטוי של דגימות באמצעות הכמות היחסית הממוצעת של גנים התייחסות, ולחשב את ΔCt אם יעילות התגובה היא בין 95% ו -105%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך פונקציונלי EC עם angiassay ogenesis. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של מטריקס היטב בכל שקופית אנגיוגנזה טרום מקורר להתפשט עם קצה פיפטה כדי לכסות את פני השטח של הבאר. שמור את תאי מטריקס על הקרח ולהימנע כניסתה של בועות אוויר לתוך הג&#39;ל. לחזק את הג&#39;ל על ידי הצבת את השקופית בצלחת פטרי עם מגבות נייר ספוגה מים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.0 x 10 4 עיקרי ECS ב 50 μl בינוני צמיחה האנדותל לכל טוב. דגירת השקופיות עבור 6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 6 שעות לצלם עם הגדלה 20X, והקפד לכלול הבאר כולו בתמונה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Failure+Models:+Traditional+and+Novel+Therapy.">Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy.</a> Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).</li><li>van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+liver+shunts+in+dogs+elucidate+pathways+regulating+embryonic+development+and+clinical+disorders+of+the+portal+vein.">Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein.</a> Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).</li><li>Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+phosphorylation+of+the+mTORC2/Akt/4E-BP1+pathway+in+newly+derived+canine+hemangiosarcoma+cell+lines.">Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines.</a> BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).</li><li>Boilson, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circulating+progenitor+cells+in+left+ventricular+dysfunction.">Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction.</a> Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).</li><li>Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinolysis+and+proliferative+endarteritis:+two+related+processes+in+chronic+infections?+The+model+of+the+blood-borne+pathogen+Dirofilaria+immitis.">Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis.</a> PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).</li><li>Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+radicals+mediate+endothelial+cell+damage+by+complement-stimulated+granulocytes.+An+in+vitro+model+of+immune+vascular+damage.">Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage.</a> J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).</li><li>Aranguren, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+a+novel+transcription+factor+code+determining+the+human+arterial-specific+endothelial+cell+signature.">Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature.</a> Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).</li><li>van Balkom, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+require+miR-214+to+secrete+exosomes+that+suppress+senescence+and+induce+angiogenesis+in+human+and+mouse+endothelial+cells.">Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells.</a> Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).</li><li>Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+(HUVEC).">Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).</a> J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIQE+precis:+Practical+implementation+of+minimum+standard+guidelines+for+fluorescence-based+quantitative+real-time+PCR+experiments.">MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments.</a> BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).</li><li>Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+canine+reference+genes+for+accurate+quantification+of+gene+expression.">Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression.</a> Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).</li><li>Heishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-214+and+MicroRNA-126+Are+Potential+Biomarkers+for+Malignant+Endothelial+Proliferative+Diseases.">MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases.</a> Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).</li><li>Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+characterisation+of+canine+mitral+valve+interstitial+and+endothelial+cells.">Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells.</a> Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).</li><li>van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canine+congenital+portosystemic+shunts:+disconnections+dissected.">Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected.</a> The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).</li><li>Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+(VEGF)+levels+in+the+blood+serum+of+dogs+with+malignant+neoplasms+of+the+oral+cavity.">Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity.</a> Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+study+of+hydralazine,+a+potential+anti-angiogenic+agent.">In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent.</a> Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

במחקרי ההתמקדות כלבית ECS הקו העיקרי CnAOEC משמש מודל השושלות האנדותל של הכלב 3, 12, 13. במחקרים בבני אדם, תרבות HUVEC עדיין נחשבה תקן הזהב. ברור, התמקדות רק על ECS נגזרה חבל טבור היא הגבלת משרד במחקר לב וכלי דם. יש לתאי אנדותל דפוס ביטוי גנים ספציפיים קביעת מפרט arteriovenous. על מנ...

כלבים משמשים כמודל חיה גדול למחקר מחלות לב וכלי דם וכן עלול לסבול מולדת (גנטי) מומים בכלי דם 1, 2. כדי לחקור מחלות אלה שורות תאים מסחריות אנדותל משמשות לעתים קרובות כדי להעריך תא האנדותל פונקציונלי (EC). לכלבים יש קו תא האנדותל מסחרי אחד זמין (CnAOEC), נגזר האאורטה כלבים. שורת תאים זה משמשת בעיקר במחקרים כשליטה נורמלית ECS 3-5. במחקר לב וכלי דם אדם שורות תאי אנדותל הנפוץ ביותר הם אדם טבורי הווריד לתאי אנדותל (HUVECs) ותאי האנדותל עורקים אדם טבורים (HUAECs) נגזרים ורידים ועורקים כבל אדם טבור, בהתאמה. HUVECs שמש כתקן זהב במחקר וסקולרית מאז 1980 6. הם נחשבים מערכת המודל הקלסית ללמוד תפקוד האנדותל והתאמת מחלה. תאי האנדותל מבודדים כלי דם שונים להשתנות appearancדואר ופונקציונליות בשל רקע גנטי וחשיפה במיקרו-סביבה של 7. בנוסף, HUVECs ו HUAECs נגזרות חבל הטבור, מבנה כלי הדם התפתחותי שעלול לא לחקות באופן מלא כלי דם בוגרים ביחס לתנאי הם נחשפים ותגובה למחלות. לפיכך, תרגום תוצאות שנמצאו HUVECs ו HUAECs למחלות לב וכלי דם בכלל אינו מספק. כאשר לומד הסתגלות והתנהגות של ECS המבוגרת, ECS העיקרי מהספינה של ריבית צריך לשמש גישה ישירה יותר. כדי לבודד תאים אלה, מספר שיטות דווחו. שיטה שתואר נרחב, אשר משמש גם HUVECs, מוחקת את הספינה עם פתרון עיכול אנזימטי 8. זה לעתים קרובות תוצאות זיהום עם הלא-ECS כגון תאי שריר חלק פיברובלסטים 9. שיטה נוספת בשימוש תדיר לבידוד היא עיכול אנזימטי של רקמת כלי הטחונה ואחריו fluorescence-תא מיון מופעל (FACS) מבוסס על אשכול סמן תא האנדותל של בידול (CD) 31 7, 8. FACS מיון תרבית תאים עוקבות דורש כמויות גדולות יחסית של תאים, ולכן הוא לא מתאים הבידוד של האנדותל מכלי דם קטנים. לפיכך, אנו שמטרתה לפתח שיטה חזקה חדשה לבידוד אוכלוסיית תא האנדותל טהורה מכלי דם כלבים שונים עם טוהר גבוה. כדי לבדוק את יעילות שיטת הבידוד החדשה, אנחנו מבודדים וקבלנו תא האנדותל הראשי כלב טהור (CaPEC) תרבויות מן עורקי כלבים שונים ורידים, גדולים וקטנים כאחד. שיטה זו גם מאפשרת התרבות של תאי אנדותל שמקורם חולה ו / או כלי סוטה כגון shunts portosystemic תוך או חוץ-כבדית מולד, מחלה נפוצה אצל כלבים 2. השיטה מאפשרת הבידוד של תאים מסוגים רלוונטיים נוספים של אותו הכלי כמו תאי שריר חלק בכלי דם מאחר שרוב הכולים נשאר intלפעול במהלך ההליך.

<table><tbody><tr><td>Collagenase type II</td><td>Life Technologies</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>Canine Endothelial Cells Growth Medium&amp;nbsp;</td><td>Cell Applications</td><td>Cn211-500</td><td></td></tr><tr><td>CnAOECs</td><td>Cell Applications</td><td>Cn304-05</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>SPR</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8898</td><td></td></tr><tr><td>iScript synthesis kit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green super mix</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>Recovery Cell Freezing Medium</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12648-010</td><td>Keep on ice prior to use</td></tr><tr><td>Freezing container, Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum)</td><td>B. Braun Medical</td><td>BC555R</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito forceps&amp;nbsp;</td><td>B. Braun Medical</td><td>FB440R</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito forceps curved</td><td>B. Braun Medical</td><td>FB441R</td><td></td></tr><tr><td>polyglactin 3-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP311H</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Automated counting chamber</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Counting Slides, Dual Chamber</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>BD356231</td><td>Slowly thaw on ice</td></tr><tr><td>&amp;micro;-Slide Angiogenesis</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Growth Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuot Kit&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of primary endothelial cells from canine arteries and veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

כלי דם שונים היו נתונים בהצלחת פרוטוקול הבידוד המתואר (תרשים 2). אפשר היה לנתח והפוך אבי העורקים, הווריד הנבוב, פורטה הנבוב, ואת העורקים הכליליים מכלבים בריאים (כל כלי מכל כלב, n = 4). עם אותה ECS הגישה בודדה שני shunts portosystemic המולד (extrahepatic ו intrahepatic, n ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins at JoVE.com

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל ראשיים מן העורקים וורידים לכלבים

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

isolation-culture-primary-endothelial-cells-from-canine-arteries

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

11.2K Views.  Utrecht University. Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Video: Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Biology

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Immunology and Infection

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the reduced long-term patency compared to arterial conduits. The abrupt increase of hemodynamic stress associated with the graft arterialization results in vascular damage, especially the endothelium, that may influence the low patency of the saphenous vein graft (SVG). Here, we describe the isolation, characterization, and expansion of human saphenous vein endothelial cells (hSVECs). Cells isolated by collagenase digestion display the typical cobblestone morphology and express endothelial cell markers CD31 and VE-cadherin. To assess the mechanical stress influence, protocols were used in this study to investigate the two main physical stimuli, shear stress and stretch, on arterialized SVGs. hSVECs are cultured in a parallel plate flow chamber to produce shear stress, showing alignment in the direction of the flow and increased expression of KLF2, KLF4, and NOS3. hSVECs can also be cultured in a silicon membrane that allows controlled cellular stretch mimicking venous (low) and arterial (high) stretch. Endothelial cells' F-actin pattern and nitric oxide (NO) secretion are modulated accordingly by the arterial stretch. In summary, we present a detailed method to isolate hSVECs to study the influence of hemodynamic mechanical stress on an endothelial phenotype.

We describe a protocol to isolate and culture human saphenous vein endothelial cells (hSVECs). We also provide detailed methods to produce shear stress and stretch to study mechanical stress in hSVECs.

בידוד תאי אנדותל של וריד ספנוס אנושי וחשיפה לרמות מבוקרות של לחץ גזירה ומתיחה

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone regulation, barrier functions, and angiogenesis. Endothelial cell dysfunction is a hallmark predictor and major driver for the progression of severe cardiovascular diseases, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. The ability to isolate and perform analyses on endothelial cells from various vascular beds in their native form will give insight into the processes of cardiovascular disease. This protocol presents the procedure for the dissection of mouse subcutaneous and mesenteric adipose tissues, followed by isolation of their respective arterial vasculature. The isolated arteries are then digested using a specific cocktail of digestive enzymes focused on liberating functionally viable endothelial cells. The digested tissue is assessed by flow cytometry analysis using CD31+/CD45&#8722; cells as markers for positive endothelial cell identification. Cells can be sorted for immediate downstream functional assays or used to generate primary cell lines. The technique of isolating and digesting arteries from different vascular beds will provide options for researchers to evaluate freshly isolated vascular cells&#160;from arteries of interest and allow them to perform a wide range of functional tests on specific cell types.

This protocol details a method for the dissection of mouse adipose depots and the isolation and digestion of respective arteries to liberate and then identify the endothelial cell population. Freshly isolated cells used in downstream applications will advance the understanding of vascular cell biology and the mechanisms of vascular dysfunction.

בידוד וזיהוי של תאי אנדותל וסקולריים ממחסני שומן נפרדים ליישומים במורד הזרם

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

Source: H&#248;rlyck, S. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/61253" target="_blank">Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

בידוד ותרבית של פריציטים ראשוניים במוח: הליך לבידוד ותרבית פריציטים מנימי מוח בקר ללא זיהום בתאי אנדותל

Source: H&#248;rlyck, S. et al. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.&#160;J. Vis. Exp. ...