Name: automated acoustic dispensing for the serial dilution of peptide agonists in potency determination assays
Uploaded: 2016-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays at JoVE.com

1. דילול סדרתי פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ assay: הנקס שנאגרו תמיסת מלח (HBSS) השלימו עם 25 HEPES מ&quot;מ, BSA 0.1% ו -0.5 מ&quot;מ 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מנפק מגיב בתפזורת להוסיף באופן שיטתי 5 μl של חיץ assay היטב בכל חמש 384 גם צלחות assay בנפח נמוכות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנה פנימית ליצירת תכנית מחלק לתוספת נפח 5 μl לכל גם צלחת 384-גם לפי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול מחלק צינורות קלטת חיץ assay נוזל הממשלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת assay בנפח נמוך 384 גם על נושאת צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ התחל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל כל דגימות פפטיד, ללא קשר לרכב אחסון, למאגר assay לייצר מלאי פפטיד 100x. הערה: פפטידים מחייב הקרנה ניתן לספק מלוח פוספט שנאגר (PBS) או sulfoxide דימתיל (DMSO) כפי שייראה לו (למשל, DMSO wחולה יש השפעה מזיקה על פפטידים עם שינויים משניים כגון PEGylation). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 25 μl מניות פפטיד 100x לעמודות 1-5 של microplate פוליפרופילן מוסמך אקוסטית 384 גם. צלחת זו מיועדת ל&#39;מקור צלחת &#39;. ודא צלחות מקור, אך לא צלחות יעד, הם תחתיים שטוחים להתאים לסיבולות אקוסטי ספציפית כפי שהוגדר על ידי היצרן של כלים אקוסטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 25 μl 100x מלא התייחסות אל בארות A23 ו A24 של א צלחת המקור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר חיץ assay 10 μl לעמודות 11-15 ו -30 חיץ assay μl לעמודות 21-22 א צלחת מקור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר חיץ assay 10 μl לעמודות 6-10 ועמודות 16-20 של microplate פוליפרופילן השני מוסמך אקוסטית 384 גם. צלחת זו מיועדת ל&#39;מקור צלחת ב &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> A ו- B צלחות מקור צנטריפוגה XG ב 300 דקות 1. כלול צלחת איזון ראויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש flui אקוסטימכשירי ד משולב לתוך מערכת רובוטית אוטומטית להכין שלושה רציפים 1: דילולים ביניים 100 (חיץ assay) של מניות פפטיד 100x מעמודה 1 במקור א הערה: תכנות דורש לעצב מחדש צלחת ותוכנת מנת תגובה (כפי שנמסר על ידי היצרן של מנפק נוזל אקוסטי) כדי לאפשר שלוש העברות אקוסטי בין מקור ומקור B (ראה איור 1 עבור פריסות צלחת). שלב 1.9 פרטים במיוחד השימוש של מכשירי נוזל המשמשים במעבדה זו בשליטת רובוטיות אוטומטית (ראה לוח חומרים): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות מקור טען וצלחות assay לתוך קטע רובוטיקה מלון צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב אוטומטי לעצב מחדש צלחת תוכנת עומס רובוטית ופרוטוקולי הרחבת תכנית מנת תגובה. לחץ על &#39;הפעלה&#39;. הערה: אוטומציה מורה מנפק נוזל אקוסטי להעביר 250 NL מעמודות 1-5 של מקור צלחת לעמודות 6-10 של מקור צלחת B, וכן acousti השניג מנפק נוזל מסוגל להתמודד עם כמויות נוזלים גדולות להשלים רווחים עם 15 μl חיץ assay לערבב. אוטומציה ואז מעבירה מקור צלחת ב &#39;צנטריפוגות משולבת צנטריפוגות ב XG 300 דקות 1 (צלחת איזון ראויה כלולה עבור כל צעדי צנטריפוגה). B צלחת מקור מוחזר מנפק נוזל אקוסטי להעברת 250 NL מעמודות 6-10 המקור צלחת B לעמודות 11-15 של צלחת המקור למילוי עם חיץ assay 15 μl לערבב. אוטומצית מקור העברות צלחת א &#39;עד צנטריפוגות צנטריפוגות משולבות XG ב 300 דקות 1. צלחת מקור ואז מוחזר מנפק נוזל אקוסטי להעברת 250 NL מעמודות 11-15 של צלחת המקור לתוך עמודות 16-20 של B צלחת המקור למילוי עם חיץ assay 15 μl לערבב. אוטומציה ואז מעבירה מקור צלחת ב &#39;צנטריפוגות משולבת צנטריפוגות ב XG 300 דקות 1. הערה: לבסוף פרוטוקול מנת התגובה מפנה מחלק אקוסטי להעבירהנפח הנדרש מכל אחד 4 בארות צלחת המקור בדילול סדרתי (בשני צלחת המקור ומקור צלחת B) לבנות עקום 11 נקודות מלאות בשני עותקי צלחות assay (טרום מלא חיץ assay 5 μl בשלב 1.2 לעיל ). העברות אוטומציה צלחת assay כדי צנטריפוגות משולב צנטריפוגות ב XG 300 דקות 1. </li></ol></li></ol> 2. תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחלה של אוגר סיני cryopreserved ההפשרה (CHO) התאים המבטאים את הקולטן ל- GLP-1 העכבר היעד במהירות באמבט 37 ºC מים resuspend במאגר assay 20 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה תא צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 XG בטמפרטורת החדר (RT). כלול איזון ראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend תא גלולה במאגר assay 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תא מניות 1: 1 בכחול Trypan ולקבוע צפיפות תאי קיימא באמצעות דלפק תא אוטומטי. תאים Resuspend במאגר assay ב 1.6 x 10 6 תאים לכל מ&quot;ל (שווה ערך ל 8,000 תאים לכל well של צלחות assay). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מנפק מגיב בתפזורת להוסיף 5 μl של ההשעיה תא היטב כל צלחות assay (המכיל פפטידים בדילול סדרתי חיץ assay 5 μl) ו לדגור על RT למשך 30 דקות. </li></ol> 3. Assay איתור HTRF cAMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו ערכת assay HTRF cAMP ל RT למשך 30 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כל מגיב HTRF (cryptate ו- D2) בנפרד בשעה 1:20 דילול במאגר תמוגה (ניסוח קניינית, המסופקים על ידי היצרן של assay זיהוי cAMP). הערה: זהירות: תמוגה חיץ מכיל פלואוריד אשלגן (KF) שהוא רעיל וכן teratogen 13. למידע אודות השלכה, צלחות assay המכילות KF צריכות להיות אטומות לאפר, וכל פסולת נוזלית חייבת להיות מדוללת ל &lt;1 מילימול / ליטר עם מים לפני הסילוק לתוך הכיור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מנפק מגיב בתפזורת להוסיף מגיב cryptate 5 μl לכל הבארות של צלחות assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מנפק מגיב בתפזורת להוסיף מגיב D2 5 μl כדי קולוםns 1-22 של צלחות assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד ידני פיפטה חיץ תמוגה 5 μl לתוך בארות A23-D24 של צלחות assay לתת ספציפיים שאינם מחייבים (NSB) בארות שליטה, ו -5 μl של מגיב D2 לתוך בארות E23-p24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחות assay דקות 1 ב 200 XG ב RT לערבב את הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחות assay למזער התאדות צילום הלבנה לדגור על RT במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד תהודת העברת אנרגית פלואורסצנטי (סריג) אות באמצעות עירור ב 320 ננומטר פליטה ב 620 ננומטר ו 665 ננומטר באמצעות קורא צלחת. </li></ol> ניתוח 4. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מתכוון NSB לחסר רקע מכל הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב% דלתא F מיחס 665 ננומטר / 620 ננומטר כדלקמן: יחס = (A 665nm / A 620nm) x 10 4 דלתא F = ((יחס לדוגמה - יחס NSB) / יחס NSB)) x 100 שם יחס NSB = בארות ללא מגיב D2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב activat%יון בין תאים ותאי unstimulated מגורה עם ליגנד GLP-1 המרבי כדלקמן: הפעלת% = (% דלתא Fsample -% תאים DeltaFunstimulated) / (% מגורה DeltaFGLP-1 תאים -% תאים unstimulated DeltaF) x 100 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח עקומות ריכוז תגובה באמצעות ניתוח לוגיסטי 4-פרמטר, וגרף כפי הפעלת% כפי שהוגדר על ידי התייחסות מלאה 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+Dispensing+Preserves+the+Potency+of+Therapeutic+Peptides+throughout+the+Entire+Drug+Discovery+Workflow.">Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).</li><li>Campbell, J. E., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology,+physiology,+and+mechanisms+of+incretin+hormone+action.">Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action.</a> Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).</li><li>Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+short+half-life+of+glucagon-like+peptide-1+in+plasma+does+not+reflect+its+long-lasting+beneficial+effects.">The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects.</a> Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).</li><li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient,+contact-free+volume+transfers+minimize+compound+loss+in+dose-response+experiments.">Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments.</a> J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li><li>Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispensing+Processes+Impact+Apparent+Biological+Activity+as+Determined+by+Computational+and+Statistical+Analyses.">Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses.</a> PLoS ONE. 8 (5), 62325 (2013).</li><li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+using+the+optimal+plasticware+and+glassware+in+studies+involving+peptides.">The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides.</a> Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).</li><li>McDonald, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+Contaminants+Leach+from+Disposable+Laboratory+Plasticware.">Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware.</a> Science. 322 (5903), 917 (2008).</li><li>Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonylphenol+ethoxylate+plastic+additives+inhibit+mitochondrial+respiratory+chain+complex+I.">Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I.</a> Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).</li><li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+That+Enable+Accurate+and+Precise+Nano-+to+Milliliter-Scale+Liquid+Dispensing+of+Aqueous+Reagents+Using+Acoustic+Droplet+Ejection.">Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).</li><li>Grant, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+accurate+compound+concentration+in+cell-based+screening:+validation+of+acoustic+droplet+ejection+technology.">Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology.</a> J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).</li><li>Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Innovative+Way+to+Create+Assay+Ready+Plates+for+Concentration+Response+Testing+Using+Acoustic+Technology.">An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology.</a> J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).</li><li>Butler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+site-specific+retargeting+jump-in+platform+cell+line+to+support+biologic+drug+discovery.">Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery.</a> J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).</li><li>Panchal, S., Verma, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+sodium+fluoride+in+maternal+and+offspring+rats+and+its+amelioration.">Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration.</a> Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).</li><li>Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+error+in+experimental+assays+using+the+bootstrap+principle:+understanding+discrepancies+between+assays+using+different+dispensing+technologies.">Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies.</a> J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).</li><li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient,+Contact-Free+Volume+Transfers+Minimize+Compound+Loss+in+Dose-Response+Experiments.">Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments.</a> J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li><li>Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+potential+of+high-throughput+drug+combination+assays+using+acoustic+dispensing.">Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).</li><li>Roberts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+and+challenges+of+direct+acoustic+dosing+into+cell-based+assays.">Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרוטוקול זה מתאר את היישום המוצלח של מחלק אקוסטי האוטומטי לדלל דגימות פפטיד סדרתי על פני טווח ריכוז של 3 x 10 6 הדורשים פחות מ -1 μl של מדגם. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא לשפר את איכות נתונים באמצעות מזעור ספיחת פפטיד plasticware באמצעות לחשיפה מצומצמת של דגימות למכלי ניס?...

של GLP-1R מהווה יעד תרופה קיימת לטיפול בסוכרת מסוג 2 2. אגוניסט פפטיד המקורי עבור קולטן זה, GLP-1, יש in vivo זמן מחצית חיים של 2-3 דק &#39;3. הכריכה של GLP-1 לתוצאות קולטן היעד מצמידים חלבון G שלה בייצור במורד הזרם של cAMP השליח השני באמצעות צימוד חלבון יליד ז &#39;ההפעלה של cyclase adenylyl. מדידה במחנה שנצבר מספקת assay חזק כדי לפקח הפעלת קולטן ו למסך אנלוגים GLP-1 פעילים עם מאפייני physicochemical מועדפים. כזה assay מחייב דילול סדרה של דגימות בדיקה לבנות תגובה עקומה ריכוז, וזה מסובך במיוחד בעת מסירת דגימות פפטיד. שגיאות פוטנציאליות מהכנת דילול סדרה מבוסס קצה תוארו בעבר 1,4,5. פפטידים יהיה לספוג plasticware, וכתוצאה מכך הערכות עצמה אמינות. ניתן למזער אובדן פפטיד באמצעות tהוא הכללת אלבומין בסרום שור (BSA) מאגרים ושימוש plasticware siliconized, עדיין חלבון מחייב נשאר בלתי צפויות. בפרט, וריאציה עקדת GLP-1 למיכלי ניסיוני תוארה 6. יש סיבוך נוסף סוכני ייצוב לזה המשמש plasticware מעבדה יכול לסנן מן טיפי צלחות microtiter לתוך מאגרי assay מימית ולהפריע חלבון פונקציה 7, 8. לכן, שיטות להקטין את חשיפת plasticware נחוצה כדי לשפר את מידת הדיוק של מדידות. מכשירי נוזלי אקוסטיות להתמקד צליל האקוסטי בתדירות גבוהה על פני השטח של מדגם נוזל, וכתוצאה מכך הוא הוצאתן של טיפות nanoliter מדויקות לתוך צלחת assay סמוכה 9. השימוש של פליטה אקוסטית הוא סטנדרטי בתעשיית התרופות לעריכת הקרנת ספריות תרכובת סינטטיות גדולות, ואת הטכנולוגיה תאומת טוב molecul הקטןes 10. למיטב ידיעתנו, אנחנו הקבוצה הראשונה לתאר מחלק אקוסטי לעריכת פפטידים רקומביננטי וסינטטיים ואנחנו בעבר דיווחנו על הדיוק המשופר בהשוואה לשיטות קצה מבוסס קונבנציונליות 1. מאמר זה מתאר את האינטגרציה של הכנת דילולים סדרתי וישיר פפטיד בהעברה אקוסטי ללא מגע על גבי מערכת רובוטיקה טיפול צלחת אוטומטי לחלוטין. מספר השיטות המקיפות העברת אקוסטי של דגימות תוארו בעבר 11. אנו מנצלים שיטת שני שלבים להכין ריכוזי מניות ביניים לדלל אנלוגים פפטיד סדר עבור הדור של עקומת מנה-תגובה המלאה. פפטידים מוכן מודגרת עם תאים המבטאים את עכבר היעד GLP-1R, ואנו משתמשים קרינת זמן נפתר הומוגנית זמין מסחרי (HTRF) assay למדוד הצטברות cAMP בתוך התאים האלה כמו הודעה של activ אגוניסט פפטידity. Assay הוא חזק מקובל בפורמט תפוקה גבוהה 384 גם ויישמנו באופן שיגרתי הוא בפיתוח assay הקרנת סמי פרויקטים 12.

<table><tbody><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>Prepared as a 0.5 M stock in DMSO</td></tr><tr><td>GLP-1 (7-36) amide</td><td>Bachem</td><td>H-6795</td><td>Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as &#039;100x reference control&#039;</td></tr><tr><td>Test peptides</td><td>Produced in-house at MedImmune</td><td></td><td>Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate</td></tr><tr><td>100x peptide stock</td><td>Produced in-house at MedImmune</td><td></td><td>Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Cedex XS Cell Analyzer</td><td>Innovatis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 384 well plates, low volume</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4514</td><td></td></tr><tr><td>Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate</td><td>Labcyte Inc.</td><td>P-05525</td><td></td></tr><tr><td>Echo Qualified Reservoir</td><td>Labcyte Inc.</td><td>ER-0055</td><td></td></tr><tr><td>Echo 550 Liquid Handler</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl</td></tr><tr><td>Echo 525 Liquid Handler</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>Droplet transfer volumes in increments of 25 nl</td></tr><tr><td>ACell Benchtop Automation&amp;nbsp;</td><td>HighRes Biosolutions</td><td>MC522</td><td></td></tr><tr><td>Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics</td><td>HighRes Biosolutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi Reagent Dispenser</td><td>ThermFisher Scientific</td><td>5840300</td><td>Referred to as &#039;bulk reagent dispenser&#039;</td></tr><tr><td>HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEJ</td><td></td></tr><tr><td>EnVision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

automated acoustic dispensing for the serial dilution of peptide agonists in potency determination assays

כמו גילוי תרופות מולקולה קטנה, בדיקות סקר לאיתור אגוניסטים פפטיד מחייב דילול סדרתי של פפטידים לייצר תגובה עקומות ריכוז. הקרנת פפטידים מעניקה שכבה נוספת של מורכבות כמו שיטות טיפול מדגם קונבנציונליות מבוסס קצה לחשוף פפטידים על שטח פנים גדול של plasticware, מתן הזדמנות מוגברת אובדן פפטיד באמצעות ספיחה. מניעת חשיפה מוגזמת plasticware מפחית אובדן פפטיד באמצעות דבקות פלסטיק ובכך מצמצם אי דיוקים חיזוי עוצמה, ואנו בעבר תיאר את היתרונות של אקוסטית ללא מגע מחלק להקרנה במבחנה תפוקה גבוהה של אגוניסטים פפטיד 1. כאן אנו דנים פתרון אוטומציה משולבים במלואם להכנת אקוסטי ללא מגע של דילולים סדרתי פפטיד צלחות microtiter ניצול בדוגמה של ההקרנה עבור אגוניסטים פפטיד על קולטן גלוקגון דמוי עכבר פפטיד-1 (GLP-1R). השיטות שלנו לאפשר גבוה-throughput מבוסס תאי מבחני למסך עבור אגוניסטים והם להרחבה בקלות לתמוך תפוקת מדגם גדלה, או כדי לאפשר למספר גדול יותר של עותקי צלחת assay (למשל, עבור פנל של קווים נוספים תא המטרה).

<html> אנו משתמשים באופן שגרתי בשיטה דו-צעד כדי לדלל פפטידים באמצעות העברה אקוסטית. עבור השלב הראשון, מנפק אקוסטי מיושר עם אוטומציה משמש ליצירת ארבעה דילולים ביניים פפטיד המניות על פני שני לוחות מקור (איור 1 א, ב). עבור השלב השני, אנו מש?...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays at JoVE.com

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

automated-acoustic-dispensing-for-serial-dilution-peptide-agonists

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.6K Views.  MedImmune. Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described. 

Video: Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a result of the direct detection of the mass-to-charge ratio of each target molecule. However, MS-based proteomics, like most other analytical techniques, has a bias towards measuring high-abundance analytes, so it is challenging to achieve detection limits of low ng/mL or pg/mL in complex samples, and this is the concentration range for many disease-relevant proteins in biofluids such as human plasma. To assist in the detection of low-abundance analytes, immuno-enrichment has been integrated into the assay to concentrate and purify the analyte before MS measurement, significantly improving assay sensitivity. In this work, the immuno- Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (iMALDI) technology is presented for the quantification of proteins and peptides in biofluids, based on immuno-enrichment on beads, followed by MALDI-MS measurement without prior elution. The anti-peptide antibodies are functionalized on magnetic beads, and incubated with samples. After washing, the beads are directly transferred onto a MALDI target plate, and the signals are measured by a MALDI-Time of Flight (MALDI-TOF) instrument after the matrix solution has been applied to the beads. The sample preparation procedure is simplified compared to other immuno-MS assays, and the MALDI measurement is fast. The whole sample preparation is automated with a liquid handling system, with improved assay reproducibility and higher throughput. In this article, the iMALDI assay is used for determining the peptide angiotensin I (Ang I) concentration in plasma, which is used clinically as readout of plasma renin activity for the screening of primary aldosteronism (PA).

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

A protocol for the protein quantification in complex biological fluids using automated immuno-MALDI (iMALDI) technology is presented.

פפטיד, חלבון כימות באמצעות כלים אוטומטיים חיסונית-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Chemistry

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Bioengineering

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach provides real-time cell monitoring with a device-dependent time resolution down to several tens of milliseconds and it is highly automated. However, when sample numbers get high (e.g., dose-response studies for various different ligands), the cost for the disposable electrode arrays as well as the available time resolution for sequential well-by-well recordings may become limiting. Therefore, we here present a serial agonist addition protocol which has the potential to significantly increase the output of label-free GPCR assays. Using the serial agonist addition protocol, a GPCR agonist is added sequentially in increasing concentrations to a single cell layer while continuously monitoring the sample&#39;s impedance (agonist mode). With this serial approach, it is now possible to establish a full dose-response curve for a GPCR agonist from just one single cell layer. The serial agonist addition protocol is applicable to different GPCR coupling types, Gq Gi/0 or Gs and it is compatible with recombinant and endogenous expression levels of the receptor under study. Receptor blocking by GPCR antagonists is assessable as well (antagonist mode).

This protocol demonstrates real-time recording of full dose-response relationships for agonist-induced GPCR activation from a single cell layer grown on a single microelectrode using label-free impedance measurements. The new dosing scheme significantly increases throughput without loss in time resolution.

פרוטוקול מינון סטפנסקי עבור תפוקה מוגברת ב-GPCR-מבוסס-תוויות חינם

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Immunology and Infection

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening (HTS) of random small molecule libraries against GPCRs is used by the pharmaceutical industry for target-specific drug discovery. In this study, an HTS was employed to identify novel small-molecule ligands of invertebrate-specific neuropeptide GPCRs as probes for physiological studies of vectors of deadly human and veterinary pathogens.
The invertebrate-specific kinin receptor was chosen as a target because it regulates many important physiological processes in invertebrates, including diuresis, feeding, and digestion. Furthermore, the pharmacology of many invertebrate GPCRs is poorly characterized or not characterized at all; therefore, the differential pharmacology of these groups of receptors with respect to the related GPCRs in other metazoans, especially humans, adds knowledge to the structure-activity relationships of GPCRs as a superfamily. An HTS assay was developed for cells in 384-well plates for the discovery of ligands of the kinin receptor from the cattle fever tick, or southern cattle tick, Rhipicephalus microplus. The tick kinin receptor was stably expressed in CHO-K1 cells.
The kinin receptor, when activated by endogenous kinin neuropeptides or other small molecule agonists, triggers Ca2+ release from calcium stores into the cytoplasm. This calcium fluorescence assay combined with a &#34;dual-addition&#34; approach can detect functional agonist and antagonist &#34;hit&#34; molecules in the same assay plate. Each assay was conducted using drug plates carrying an array of 320 random small molecules. A reliable Z&#39; factor of 0.7 was obtained, and three agonist and two antagonist hit molecules were identified when the HTS was at a 2 &#181;M final concentration. The calcium fluorescence assay reported here can be adapted to screen other GPCRs that activate the Ca2+ signaling cascade.

In this work, a high-throughput, intracellular calcium fluorescence assay for 384-well plates to screen small molecule libraries on recombinant G protein-coupled receptors (GPCRs) is described. The target, the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is expressed in CHO-K1 cells. This assay identifies agonists and antagonists using the same cells in one "dual-addition" assay.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

"Cell Surface Capture" Workflow for Label-Free Quantification of the Cell Surface Proteome

Over the past decade, mass spectrometry-based proteomics has enabled an in-depth characterization of biological systems across a broad array of applications. The cell surface proteome ("surfaceome") in human disease is of significant interest, as plasma membrane proteins are the primary target of most clinically approved therapeutics, as well as a key feature by which to diagnostically distinguish diseased cells from healthy tissues. However, focused characterization of membrane and surface proteins of the cell has remained challenging, primarily due to the complexity of cellular lysates, which mask proteins of interest by other high-abundance proteins. To overcome this technical barrier and accurately define the cell surface proteome of various cell types using mass spectrometry proteomics, it is necessary to enrich the cell lysate for cell surface proteins prior to analysis on the mass spectrometer. This paper presents a detailed workflow for labeling cell surface proteins from cancer cells, enriching these proteins out of the cell lysate, and subsequent sample preparation for mass spectrometry analysis.

Here, we describe a proteomics workflow for characterization of the cell surface proteome of various cell types. This workflow includes cell surface protein enrichment, subsequent sample preparation, analysis using an LC-MS/MS platform, and data processing with specialized software.

Over the past decade, mass spectrometry-based proteomics has enabled an in-depth characterization of biological systems across a broad array of ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. Atherosclerosis is also the leading cause of sudden death and myocardial infarction, instigated by unstable plaques that rupture and occlude the blood vessel without warning. Current imaging modalities cannot differentiate between stable and unstable plaques that rupture. Peptide amphiphiles micelles (PAMs) can overcome this drawback as they can be modified with a variety of targeting moieties that bind specifically to diseased tissue. Monocytes have been shown to be early markers of atherosclerosis, while large accumulation of monocytes is associated with plaques prone to rupture. Hence, nanoparticles that can target monocytes can be used to discriminate different stages of atherosclerosis. To that end, here, we describe a protocol for the preparation of monocyte-targeting PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs are self-assembled through synthesis under mild conditions to form nanoparticles of 15 nm in diameter with near neutral surface charge. In vitro, PAMs were found to be biocompatible and had a high binding affinity for monocytes. The methods described herein show promise for a wide range of applications in atherosclerosis as well as other inflammatory diseases.

This paper presents a method involving the synthesis and characterization of monocyte-targeting peptide amphiphile micelles and the corresponding assays to test for biocompatibility and ability of the micelle to bind to monocytes.

סינתזה של פילוח מונוציט פפטיד אמפיפיליות הקזאין עבור הדמיה של טרשת עורקים

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Biology

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...