This work was funded by the National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

1. הכנה להרכבת דיסקים אלגינט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% (w / v) פתרון אלגינט ב בופר פוספט של 1x Dulbecco ללא סידן כלורי הוסיף או מגנזיום כלוריד ומקום באמבט המים 37 מעלות צלזיוס. ריכוזים של פתרון אלגינט יכולים להשתנות, אבל 1 - 4% (w / v) פתרונות אלגינט מומלצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את הפתרון אלגינט ביחס של 1: 1 עם בסיס תקשורת תרבית תאים חם (למשל, בינוני הנשר השונה של Dulbecco.) עבור סוג התא הרצוי. ריכוז אלגינט הוא עכשיו מחצית הריכוז המקורי, כלומר., 2% (w / v). לעקר פתרון אלגינט / מדיה באמצעות מסנני מזרק 0.2 מיקרומטר ניילון סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אמבט של מימית סידן כלורי סטרילי 102 מ&quot;מ במים סטריליים עם פתרון מספיק כדי להטביע תבניות (~ 200 - 300 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את סטרילי &quot;היווצרות קריש העובש&quot; (6 מ&quot;מ קוטר x 3 מ&quot;מ בארות גליליות גבוהות בתוך 3 x 3 לוחית אלומיניום, ראה <strong&gt; איור 1) ו endplates (תחתונה: אחד 3 x 3 לוחית אלומיניום, למעלה: אחד 1.5 אינץ &#39;x 3 לוחית אלומיניום) ולהכין תבניות כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי נייר סינון עבה (נייר סינון נייר סופג) ואת קרום התא microsieve (10 מיקרומטר גודל נקבובי) את הגדלים של העליון endplates התחתונה ומניח אותם באמבטית סידן כלורי עד רווי, כ 1 דקות. אם תרצה, לעקר את נייר סינון העבה קרום microsieve באמצעות אור אולטרה סגול חיטוי או למשך 30 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה למחצית (חצי התחתונה) של מבנה העובש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הפריטים הבאים על גבי אחד אחר לפי הסדר הבא ו להחליק בעזרת מרית סטרילי: endplate גדול (3 אינץ &#39;x 3), נייר סינון עבה, ולאחר מכן קרום microsieve. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך ולחץ על עובש על ערימה של מגבות נייר כדי להבטיח הפסד של פתרון כלוריד סידן עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את &quot;עובש היווצרות קריש&quot; עם הבארות הגליליות על גבי גell microsieve קרום בעדינות להדק את התבנית יחד על שני הצדדים באמצעות קליפים קלסר על שמאל ובצד ימין. הקפד להשאיר מספיק מקום עבור endplate העליון (1.5 x 3) כדי לכסות את הבארות לחלוטין מאוחר יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה במחצית השנייה (חצי העליונה) של מבנה העובש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הפריטים הבאים על גבי אחד אחר לפי הסדר הבא ואת smoothen: endplate קטן, נייר סינון עבה, קרום microsieve. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך ולחץ המחצית של עובש על ערימה של מגבות נייר כדי להבטיח הפסד של פתרון כלוריד סידן עודף. אל תהדק המחצית של עובש באמצעות קליפים קלסר בשלב זה. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים מומלצים לפי הוראות יצרן. קציר התאים הרצויים להטבעה הידרוג אלגינט השכבתית. צפיפות התאים המומלצת היא 1 - 2 x 10 6 תאים / מיליליטר, אבל זה יכול להיות מגוון בהתאם ניסויים רצויים. הערה: בעת שימוש בשיטה זולהכנת שכבות עם תאים מסוגים שונים, הקפידו סוגי תאי תרבות שניהם במקביל עבור שכבות. בתאי גזע mesenchymal (MSCs) זורעים בצפיפות תא של 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ישמש כדוגמה בפרוטוקול הבא. מספר סלולרי ומספר דיסק וניתן לשנותם לניסויים לפי הצורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבוע עד שבועיים לפני הטבעה, תאי גזע זרע mesenchymal בצפיפות תא של 3,000 - 5,000 תאים / 2 ס&quot;מ ב 10 מ&quot;ל של התקשורת צמיחה הבזליים (בינוני הנשר שונה של Dulbecco, 10% בסרום שור עוברית, 2% L-Glutamine, 1 שאינם חיוניים% חומצות אמינו, 1% פניצילין / סטרפטומיצין) צלוחיות T-75. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר מדיה בזבזה כל 2 - 3 ימים ולהחליף עם 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה הבזליים עד שהתאים הם 80 - 90% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקצור תאים, להסיר התקשורת בילו, פיפטה 3 מ&quot;ל של בופר פוספט של 1x Dulbecco ללא סידן כלורי הוסיף או מגנזיום כלוריד כדי לשטוף תאים. הסר פתרון זה, פיפטה 3 מ&quot;ל של נסה 0.25%psin-EDTA על תאים הגדלים צלוחיות T-75, ו דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר התאים נוקף מפני השטח החסיד, להוסיף 6 - 9 מיליליטר של תקשורת צמיחה הבזליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MSCs צנטריפוגה ב 600 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב supernatant, מחדש להשעות ב 1 - 5 מ&quot;ל של התקשורת צמיחה הבזליים. ספירת התאים באמצעות hemocytometer באמצעות הוראות התקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר 1 x 10 6 תאים מן resuspension התא הכולל, צנטריפוגה באמצעות אותם התנאים, ואת לשאוב supernatant. </li></ol></li></ol> 2. כינונה של דיסקי אלגינט Seeded ניידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות את התא גלולה עם 1 מ&quot;ל של הפתרון אלגינט / מדיה סטרילי כדי להשיג צפיפות התאים של 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. תערובת התא-אלגינט תהיה מעונן homogenously במראה כאשר תאים מעורבבים כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 130 μl של התערובת אלגינט תא לשש 6 מ&quot;מ קוטר x בארות גבוהות 3 מ&quot;מ במחצית התחתונה של העובשלבנות dropwise, כדי לא ליצור בועות. המניסקוס קמור קל צריך להיות גלוי מעל הקצה של כל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להחליק את המחצית העליונה של מבנה העובש בעזרת מרית סטרילי והפוך אותו, כך קרום התא microsieve הוא על גבי הבארות. מניחים את התבנית לבנות על גבי בארות, והקפד לכסות את הבארות המכיל את התא תערובת אלגינט לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את מבנה עובש טעון, תוך כדי לחיצה כלפי מטה בחוזקה על מרכז, קלסר קליפ שני הצדדים הנותרים (העליון והתחתון) להדק את חצאי העליון והתחתון של המבנה עובש. הפתרונות-אלגינט התא צריך להיות השוכן בבטחה בארות בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את מבנה עובש מהודק באמבטיה כלוריד 102 מ&quot;מ סידן, ולוודא כי המבנה כולו הוא שקוע. מדגירים את מכסה המנוע תרבית תאים בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף של 90 דקות, להסיר את מבנה התבנית מן כלוריד סידן 102 מ&quot;מאמבטיה ומניח על ערימה של מגבות נייר בשכונת תרבית תאים. הסר את כל הארבעה מהדקים להפריד בין שני החצאים של מבנה העובש. הידרוג נוצר הבארות לא צריך שום בועות וצריך למלא את הבארות לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית, בזהירות להתחקות קצה בארות המכיל את הידרוג כדי לשחרר בזהירות טריז את הידרוג. לאחר הסרת הידרוג מן המבנה עובש, ושחרר את הידרוג ישירות לתוך אמבט של בופר פוספט של 1x Dulbecco עם כלוריד סידן מגנזיום כלוריד. מכסה את ג&#39;ל לחלוטין לשטוף פתרון כלוריד סידן העודף עבור 1 - 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הידרוג לתוך פתרון תקשורת צמיחה הבזליים בצלחת רצויה (למשל., 6 צלחות גם) המכסה את הידרוג לחלוטין. דגירה במשך שעה 1 לפחות בחממת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפני שתמשיך לשלב השכבות. הערה: הידרוג המכיל תאים יכול להישמרחממת תרבית תאים ללא הגבלה זמן בשלב זה עד שכבות של ג&#39;ל עם אוכלוסיית תא אחרת היא רצויה, ובלבד שינויי תקשורת הושלמו כל 2 - 3 ימים. </li></ol> 3. שכבות של דיסקים אלגינט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך חצי השעה האחרונה של דגירה 1 hr, לאסוף ולהכין תבניות סטרילית פתרון חישול הג&#39;לים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את &quot;עובש החיתוך&quot; על ידי הידוק עובש כי יש חצי בארות של הגובה של &quot;עובש היווצרות הקריש&quot; (6 מ&quot;מ קוטר x 1.5 בארות גבוהות מ&quot;מ בתוך 3 x 3 לוחית אלומיניום) אל endplate (3 x 3 ב לוחית אלומיניום) באמצעות קליפים קלסר על שמאל ובצד ימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את &quot;עובש החישול&quot; על ידי הידוק עובש כי הוא 3 מ&quot;מ גדול יותר בקוטר מאשר &quot;עובש היווצרות הקריש&quot; (9 מ&quot;מ קוטר x 3 מ&quot;מ בארות גבוהות בתוך 3 x 3 לוחית אלומיניום) אל endplate (3 x 3 ב לוחית אלומיניום) באמצעות קליפים קלסר על שמאל ובצד ימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון שלנתרן ציטרט 100 מ&quot;מ / 30 מ&quot;מ EDTA (מימית נתרן ציטרט, מימית מלח tetrasodium חומצה ethylenediaminetetraacetic) במים סטריליים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר ג&#39;לים של אוכלוסיות תאים רצויות (בדוגמא זו, שני דיסקים עם hMSCs) מהתקשורת בצלחת, והמקום לתוך בארות &quot;חיתוך עובש&quot;. ג&#39;ל כל צריך להתאים בנוחות לתוך הבארות עם מחצית ג&#39;ל בולטת מעל התבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל, לחתוך את הג&#39;ל על פני השטח של עובש (זה יקצץ הידרוג&#39;ל לשניים). תהפוך את החצי העליון של ג&#39;ל ולמקם אותו לתוך באר עובש פתוח. החצי של הג&#39;ל צריך גם להתאים בנוחות לתוך התבנית היטב, אבל עכשיו הוא ג&#39;לי חצי צריכים להיות בגובה של העובש עם המשטח הפנימי לחתוך גלוי. חזור עם ג&#39;ל שני. הערה: אזהרה: רק משטחי החתך הפנימיים יהוו דיסקים שכבתיים. שימוש המשטחים החיצוניים תגרום הפרדה חצאים. על פי החשד, מרקם מן הקרום microsieve מועברים על גבי משטח ג&#39;ל למנועהצלחה של תהליך החישול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסת קרום microsieve תא יבש על גבי בארות, ולוודא כי הממברנה microsieve נמצא בקשר עם כל חצאי ג&#39;ל להיות מרותק ומכסה אותם לגמרי. מניחים נייר פילטר עבה על גבי קרום microsieve, והקפד לכסות את הג&#39;לים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פתרון של נתרן ציטרט 100 מ&quot;מ / 30 מ&quot;מ EDTA (מימית נתרן ציטרט, מימית מלח tetrasodium חומצה Ethylenediaminetetraacetic) על נייר הסינון עבה עד שהוא רווי. כ 750 μl מספיק במשך ארבע בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ג &#39;לים 1 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להסיר את קרום התא microsieve ונייר מסנן עבה וזורק אותן. הסר את הסרטונים קלסר ופתח את התבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ג&#39;ל annealed, להעביר נתרן ציטרט אחד / חצי שטופלו EDTA של הידרוג&#39;ל אל &quot;עובש חישול&quot; מוכן עם המשטח החתוך כלפי מעלה. זה יהיה מחצית אחת const annealedruct. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית, להרים ולמקם וחצי-ג&#39;ל נתרן ציטרט השני / שטופלו EDTA (עשוי להכיל סוג תא אחר) על ג&#39;ל כבר &quot;עובש חישול&quot;, מרפרף-ג&#39;ל במחצית השנייה זה כך את פני השטח חתך נמצא במגע עם פני שטח החתך של ג&#39;ל כבר &quot;עובש החישול&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו בעדינות על שני ג&#39;לים בעזרת מרית כדי להסיר בועות כלשהו בין שני הג&#39;לים. כמו כן, למקם את הג&#39;לים לפי הצורך לוודא כי הם ישירות על גבי זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם בעדינות את &quot;עובש חישול&quot; לצלול אותו באמבט כלוריד סידן 102 מ&quot;מ במשך 30 דקות. אין לכסות את הבארות עם endplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 30 דקות, להסיר את &quot;עובש חישול&quot; והנח אותו על מגבות נייר. הסר את הסרטונים קלסר ולהפריד את התבנית מן endplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית, לאסוף את הג&#39;לים annealed ומניחים אותם לתוך בופר פוספט של 1x Dulbecco עם כלוריד סידן מאמבטיה כלוריד agnesium לשטוף את הג&#39;לים. בהמשך לכך, להעביר הידרוג מרותק אל תקשורת תרבית תאים בצלחת רצויה (למשל., 6-גם צלחת) לתרבות. </li></ol>

<ol>
	<li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Basic+Science+of+Articular+Cartilage.">The Basic Science of Articular Cartilage.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li><li>Neidlinger-Wilke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+loading+of+the+intervertebral+disc:+from+the+macroscopic+to+the+cellular+level.">Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level.</a> Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).</li><li>Klein, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+stratified+articular+cartilage+from+chondrocyte+subpopulations.">Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations.</a> Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).</li><li>Han, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+Grafts+for+Articular+Cartilage+Defects.">Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects.</a> Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).</li><li>Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+chondrocytes+seeded+in+a+layered+agarose+hydrogel+create+engineered+cartilage+with+depth-dependent+cellular+and+mechanical+inhomogeneity.">Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity.</a> Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).</li><li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+layered+agarose+approach+to+fabricate+depth-dependent+inhomogeneity+in+chondrocyte-seeded+constructs.">A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs.</a> J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).</li><li>Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+articular+cartilage+with+spatially-varying+matrix+composition+and+mechanical+properties+from+a+single+stem+cell+population+using+a+multi-layered+hydrogel.">Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel.</a> Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).</li><li>Leone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+multilayered+composite+hydrogel+as+osteochondral+substitute.">Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).</li><li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels.">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Vigf&#250;sd&#242;ttir, &. #. 1. 9. 3. ;. T., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pericellular+Matrix+in+Mesenchymal+Stem+Cell+Deformation+during+Chondrogenic+Differentiation.">Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).</li><li>Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+layered+chondrocyte-seeded+alginate+hydrogel+scaffolds.">Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).</li><li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures.">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).</li><li>Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Fabrication+of+Anatomical+Bioreactor+Systems+Containing+Alginate+Scaffolds+for+Cartilage+Tissue+Engineering.">Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering.</a> Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Three-Dimensional+Alginate+Gels.">Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels.</a> Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).</li><li>Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+an+aggregated+alginate+construct+in+a+tubular+perfusion+system.">Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system.</a> Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת תקליטורי הידרוג&#39;ל אלגינט שכבתיים ללימוד שיתוף תרבויות של אוכלוסיות תאים מרובות, כגון אלה ברקמות שכבתיות פיסיולוגי, למשל, סחוס. מבנים שכבתיים, כגון פלטפורמת התרבות המתוארת, יכולים לשמש כדי לבחון את יחסי הגומלין בין שתי אוכלוסיות ...

לטעון דחיסת נושאות ברקמות כגון סחוס במפרק או לדיסקים מורכבות אזורי רקמות הטרוגנית כי הם קריטיים עבור שניהם הפונקציה ביומכנית ו-התמר mechano המתאים בתוך הרקמה. לא רק ארגון הסלולר לתפקד ברור באזורים שונים, אך המטריצות התאיות (ECM) הן מגוונים גם בהרכב וארגון. לדוגמא, סחוס במפרק מורכב משלושה אזורים עיקריים עם מורפולוגיה תאים שונה, פונקציה מכאנית, ECM. הבדלים בעופרת ECM שלהם דיפרנציאלי אחריות נושאי העומס; השכבה השטחית מעורבת בעיקר לצורך מתן המענה המתיח לטעון, בעוד האזורים באמצע והעמוקים אחראים בעיקר בתגובת הדחיסה 1. בדומה לכך, הדיסק הבין חולייתי, pulposus גרעין דמוי ג&#39;ל מוקף סיסטיק שבשבת annulus והתאים בתוך שני אלה תחומים ברורים לחוות סוגים שונים של גירויים biophysical2. בסוגים אלה של רקמות, תאים ואת המטריצות התאיות בתוך שכבות הרקמה לתקשר אחד עם השני כמו הרקמה עוברת ומגיבה כוחות מכאניים. חזרה על מבנים רקמות הטרוגנית כזה עדיין מהווה אתגר בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, ואת הבנתנו המשמעות הביולוגית שלהם מוגבל. יש צורך culturing פלטפורמות לניתוח רקמות מרובדת כמו גם שיתוף תרבויות של אוכלוסיות שונות של תאים בתוך מבנה אחד. בהנדסת רקמות סחוס במפרק, פיגום פחות שכבתי מבנים נבנו על ידי רתימת היכולת של כונדרוציטים אזורים להפקיד ECM המגוונת לחקות את השכבות השונות של רקמה זו 3,4. עם זאת, בונת הידרוג&#39;ל שכבתית לספק הזדמנות לחקור את האינטראקציה של סוגים שונים של אוכלוסיות תאים חסרות היכולת ליצור רקמות חזקות באופן עצמאי. לדוגמה, פופ שונהulations של בתאי גזע mesenchymal יכול להיות שיתוף תרבותי בתוך מבנים שכבתיים. פיגומים שכבתיים כאלה שמשו בשני chondrocytes ומבדל בתאי גזע mesenchymal עבור הנדסת רקמות משופרת 5. לא רק יכולים אוכלוסיות תאים שונות להיות שיתוף תרבותי בשכבות הידרוג&#39;ל דומות, אבל סוג תא בודד יכול גם להיות מתורבת בתוך שכבות כי נפלו קורבן למניפולציות יש קשיחות משתנית או תוכן ביוכימיים לעורר תגובות שונות מתאי 6,7. הידרוג ביולוגי שונה רב שנוצל שכבת אוכלוסיות תאים עבור הנדסת רקמות סחוס כגון אלה באמצעות פוליאתילן גליקול או בסיסים ויניל אלכוהול פולי 7-9. עם זאת, הידרוג אלגינט אחד biomaterials הפשוטה שממנו ניתן ליצור פיגומים שכבתיים ללימוד אוכלוסיות תאי הטרוגנית שיתוף התרבות. בעוד הידרוג agarose גם נוצר בקלות, הידרוג אלגינט יש ערך המוסף של שמאפשר קלolation של תאים מן המבנה 3-D לניתוח של תאים בודדים, כמו תוארה בעבר 10. במחקרים קודמים, הידרוג אלגינט דו-שכבתי נוצר בסדינים דקים מגיליונות אלה, סעיפים היו פרוסים (למשל., באמצעות אגרוף ביופסיה) עבור יישומים מסוימים כגון ניתוח התוכן ביוכימיים או נכסי גזירת interfacial 11,12. שיטה נוספת להרכבת גליונות אלגינט דק תוארה עם פוטנציאל ריבוד לתוך שכבות מרובות, אך עדיין ידרוש שינוי אל הידרוג&#39;ל לשימוש לבדיקות מכניות 13. כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת reproducibly דו-שכבתי דיסקים הידרוג&#39;ל אלגינט לשימוש באוכלוסיות שונות-culturing שיתוף של תאים. פלטפורמת דיסק אלגינט זה הוא בעל מספר יתרונות. בראש ובראשונה, את הצורה לשחזור וגודל קטן הוא מסיע עבור גירוי מכני של תאים משובצים ללא צורך בביופסיה puNCH ​​או שינוי פיזי אחר אל הידרוג&#39;ל עבור יישומים רבים. בנוסף, כדאיויות תא נותרות גבוהות במהלך תהליך השכבות, ולאחר היווצרות קריש הפרדה ברורה של שתי אוכלוסיות התאים בתוך הג&#39;ל גלויה ללא באזור חופפים ראשוני.

<table><tbody><tr><td>Alginic Acid sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1112</td><td>Solution made in wt% using DPBS (-/-)</td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (-/-)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (+/+)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11965</td><td>Example. Use desired medium type</td></tr><tr><td>Syringe Filters (0.02 &amp;#956;m Nylon)</td><td>FisherBrand</td><td>0979C</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP510</td><td>Prepare solution in sterile water</td></tr><tr><td>Criterion Blotter Filter Paper</td><td>Biorad</td><td>1704085</td><td>Cut to size of endplates for mold formation</td></tr><tr><td>Cell Microsieve Membrane (10 &amp;#956;m pore size)</td><td>Biodesign Inc of New York</td><td>N10R</td><td>Cut to size of endplates for mold formation</td></tr><tr><td>Sodium citrate dihydrate</td><td>FisherScience</td><td>S93364</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>FisherBioreagent</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>26140</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15140</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids (100x)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11140050</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr></tbody></table>

layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

איור 1 מתאר את היווצרות שכבות של הידרוג אלגינט. הושלם דו-שכבתי ג&#39;לים להפגין הפרדה ראשונית מלאה של אוכלוסיות תאים כפי שמוצג באיור 2. כדאיויות תא של אדם בתאי גזע mesenchymal) מוטבעות בתוך הידרוג אלה שכבתיות נותרת גבוהות להשוות את הידרוג ב...

Watch this Scientific Journal Video about Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations at JoVE.com

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

בונה אלגינט Layered: פלטפורמה עבור Co-תרבות של אוכלוסיות תאים הטרוגניות

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

layered-alginate-constructs-platform-for-co-culture-heterogeneous

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K Views.  University of Maryland. Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct. 

Video: Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Developmental Biology

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

דור של אלגינט microspheres עבור יישומים ביו

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Medicine

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

בנייה של גיליונות מודולרי Hydrogel לאדריכלות סלולרית 3D המוקטן מאקרו micropatterned

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

תרבית תאים זגוגית אלסטי Porated Hydrogels כמו קרום המרתף ביונים עבור כפול

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

תלת ממד תרבות אלגינט חרוז של תאי אדנומה יותרת המוח האנושי

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

ליבה/פגז הדפסה פיגומים קפלים להנדסת רקמות של מבנים צינורי

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication of soft tissue constructs. However, granular gel formulations have been restricted to a limited number of biomaterials that allow for the cost-effective generation of large amounts of hydrogel microparticles. Therefore, granular gel support media have generally lacked the cell-adhesive and cell-instructive functions found in the native extracellular matrix (ECM).
To address this, a methodology has been developed for the generation of self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites. SHAPE composites consist of a granular phase (microgels) and a continuous phase (viscous ECM solution) that, together, allow for both programmable high-fidelity printing and an adjustable biofunctional extracellular environment. This work describes how the developed methodology can be utilized for the precise biofabrication of human neural constructs.
First, alginate microparticles, which serve as the granular component in the SHAPE composites, are fabricated and combined with a collagen-based continuous component. Then, human neural stem cells are printed inside the support material, followed by the annealing of the support. The printed constructs can be maintained for weeks to allow the differentiation of the printed cells into neurons. Simultaneously, the collagen continuous phase allows for axonal outgrowth and the interconnection of regions. Finally, this works provides information on how to perform live-cell fluorescence imaging and immunocytochemistry to characterize the 3D-printed human neural constructs.

This work describes a protocol for the freeform embedded 3D printing of neural stem cells inside self-healing annealable particle-extracellular matrix composites. The protocol enables the programmable patterning of interconnected human neural tissue constructs with high fidelity.

תמיכה מרוכבת במטריצה חוץ-תאית מיקרוג'ל להדפסה תלת-ממדית משובצת של מבנים עצביים אנושיים

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...