This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

1. זני HSV וטיפול הערה: רקומביננטי הלא מתפשטת HSV-1 (קוס) gL86 ו HSV-2 (קוס) 333gJ - עם פעילות הכתב בטא galactosidase בשימוש נמסרו על ידי V. Twiari 36,37. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש וירוס מרב וחנות אחת ב -80 מעלות צלזיוס ב יחס של 1: 1 של המדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) עם 20% בסרום שור עוברי (FBS) ו חלב רזה עד שימוש. לפני האחסון הרבה ויראלי, לקבוע ריכוז הנגיף על ידי o -nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) ו 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-גל) assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע כדאי וירוס ריבוי של זיהום (משרד פנים) על ידי מכתים X-גל עבור כל מחזור assay הניסיון באמצעות assay כניסת כתב וירוס, כפי שתואר לעיל (איור 1) 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל וירוס (Opt-MEM) כדי הרצוי משרד הפנים. תקן monolayers (paraformaldehyde; 0.5 מ&quot;ל / טוב) לפני מכתים. מניחים שולטים כדאיות וירוס בתוך microti נפרדצלחת ter במקביל צלחות assay polymicrobial. </li></ol> 2. טיפול Cell הלה 299 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ב DMEM עם 4.5 g / L גלוקוז, 10% בסרום שור העובר חום מומת (FBS), גנטמיצין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו L- גלוטמין. תאי המעבר בנקודת המפגש 80% עם פתרון טריפסין (חומצה ethylenediaminetetraacetic, 0.53 M EDTA; 0.05% טריפסין; 5 מ&quot;ל / בקבוק). </li></ol> 3. ג טיפול אלביקנס הערה: ג אלביקנס להשיג ממקור קליני מעבדתי מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס Remmel חלב רזה 2x בינוני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות קפואה מנייה על Sabouraud דקסטרוז הבינוני (37 מעלות צלזיוס). לאחר 24 תת hr ב- C. אלביקנס על מדיום Fungisel (37 מעלות צלזיוס; 48 שעות) לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור צינור נבט (GT) צורות (איסוף מושבות נציג; FBS 3 מ&quot;ל; 3 שעות, 37 ° C; Abs 600, 0.3). לאחר דגירה, לשטוף GT (HBSS; 2x; 4,000 XG). להוסיף GT כדי לרחוץ חימם HBSS (37 &amp;# 176; C; 0.32 Abs 600). צורות GT צריכות להיות 99% של תאים נצפו כפי שנקבע על ידי ספירת hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך אמצעי שמרים (YF) השעיות המניות על ידי הרמת מושבות Fungisel נציג (HBSS, 3 מ&quot;ל; 0.32 Abs 600). ספירת צורות YF / ml מיקרוסקופית באמצעות hemocytometer. צורות YF צריכות להיות 99% של תאים נצפו כפי שנקבע על ידי ספירת hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את עבודת מניות פטרייתי (250 μl של GT או מניות YF ב 25 מיליליטר HBSS; 37 מעלות צלזיוס; 10 5 CFU / ml) </li></ol> 4. ס טיפול aureus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות S. aureus ATCC 25,923 (-80 ° C; Remmel לרחף 2x חלב). תרבות על אגר כבשים דם (5%; 37 מעלות צלזיוס; 24 שעות). פיק מושבות נציג ולהעביר מניטול מלחים בינוני בתוך 2 ימים עבור מניות (37 מעלות צלזיוס; 18 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך ס aureus ההשעיה המניות (3 מ&quot;ל HBSS; 1.32 Abs 600; 10 8 CFU / ml) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את עבודת S. מניית aureus (100 μlשל המניה ב 25 מ&quot;ל HBSS; 10 5 CFU / ml). </li></ol></li></ol> 5. קנדידה וס השעיות aureus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מעורב ג אלביקנס וס ההשעיה aureus (250 YF μl או מלאי GT ו 100 μl S. aureus המניה ב -25 מ&quot;ל HBSS). </li></ol> 6. polymicrobial Assay Biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seed 96 צלחות גם עם 200 μl של 2 x 10 5 תאים הלה / מ&quot;ל (רמת מפגש 85%). רוק צלחות (30 - 45 דקות, 37 ° C) לפני הדגירה (37 ° C; 5% CO 2 באינקובטור; 18 שעות). Monolayers Wash (1x; Opt-MEM) אז הזרע עם HSV (HSV-1 (קוס) gL86 או HSV-2 (קוס) 33 GJ - ב 100 μl Opt-MEM; משרד הפנים 50 ו -10). דגירה צלחות (3 שעות, 37 ° C; 5% CO 2). השתמש רק זן ויראלי אחד ליום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף monolayers נגוע (1x; בופר פוספט (PBS) עם Mg +2 ו Ca +2; 100 μl). החלף PBS עם HBSS חם עוזב 25 &amp; #181; l בכל טוב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף YF, GT ו / או ס aureus השעיות עובדים (100 μl; יעד יחס התא = 5: 1; n = 16). כפי שניתן לראות בטבלה 1 דגירה צלחות (סטטי; 30 דקות; 37 מעלות צלזיוס; 5% CO 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשאוב עמודה אחת בכל פעם מילוי מיד עם 300 μl PBS עם Mg +2 ו Ca +2. חזור על פעולה זו פעמים ואז להוסיף למאגר תמוגה assay הרדיו-immunoprecipitation (ריפה; מסנן מעקר: 200 μl של דילול 1:50). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות triturate את lysate תא הלה מכן למקם 50 μl על מלחי מניטול (MS) ו / או Fungisel (F) מדיה (איור 2). מורחים את lysate באמצעות מכופף מוט הזכוכית בזווית של 90 מעלות. דגירת הצלחות (18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס). באופן ידני לספור את מספר מושבות בכל צלחת. בקרה מורכבת ס aureus ו / או C. דבקות אלביקנס לתאים הלה-נגוע HSV. </li></ol> 7. בדיקות הדמיה &lt;/ P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל coverslip זכוכית עגול (12 מ&quot;מ; 50 מיליליטר אצטון בכוס 100 מיליליטר). יבש לעקר coverslips (Kimwipes; בצלחות פטרי זכוכית). מניח coverslips סטרילי היבש לתוך הבארות של צלחות גם 24 סטרילי עם מלקחיים מעוקרים להבת אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תאי הלה (1 מיליליטר; נפח 5x המשמש 96 צלחות גם) על הבארות של 24 צלחות היטב המכילות את coverslips הזכוכית העגול סטרילי השטף. מוסיפים את וירוס, חיידקים ופטריות בהתאם לתבנית (טבלה 2) בשעה 5x נפח המשמש 96 צלחות היטב, ואז דגירה תהליך כמתואר בשלבים 6.2.1 ל -6.4 לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה של דבר, לתקן את התאים במיקרוסקופ על ידי הצפת שקופיות עם מתנול, ולתת לו להתאדות. אחסן את הצלחות ב RT עד מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מיקרוסקופ שדה הבהיר (1,000x הגדלה מקורית סופית) למלא את הבארות המכילות coverslips קבוע מתנול עם מים ללא יונים. מיד לשאוב מים. כיסוי כל coverslip עם סגול קריסטל גרם. לשטוף coverslips ללא כתם שאינו כבול (מים ללא יונים). Coverslips יבש באתרם ואז לדבוק בהם עם סט קשה הרכבה בינונית לשקופית שכותרתו (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אובייקטיבי 100x; 1,000x מקורי הגדלה סופית) לשטוף coverslips ללא מתנול בעצם כמתואר בשלב 7.4. יבש coverslips בבארות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייבוש, להסיר את מכסה מחליק ומניחים אותם בשקופיות שכותרתו. לאחר מכן להוסיף כמות מספקת של 1:20 דילול של isothiocyanate והעמסת (FITC) מצומדות וירוס הרפס סימפלקס סוג 1 + 2 נוגדן GD כדי לכסות את coverslip (1 - 5 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת השקופיות בתא לחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר דגירה, לשטוף את coverslips ב 4 שינויים של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה של דבר, להחזיר את coverslip לשקופית שכותרתו. הכתם עם 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; קאמרית לחות; 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות). לאחר דגירה לשטוף את coverslips ב 4 צ&#39;אןGES של PBS, ואז להדביק לשקופית שכותרתו עם הרכבה בינונית סט קשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הרכבה בינונית לרפא למשך 24 שעות ב RT בחושך. בדוק את coverslips תחת המטרה שמן משני מיקרוסקופ שדה בהיר או מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנני הפסקת FITC ו DAPI. בדוק תמונות של 50 שדות לפחות (100 תאים לכל מינימום אורגניזם) עבור שיתוף לוקליזציה (איור 4). </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כרגע אין מידע נגיש יחסי הגומלין המורכבים שבין קבע לחברי חצי קבוע של Microbiome מארח החוצות תחומים טקסונומיות מרובות, כלומר, פרוקריוטים, האיקריוטים ויראלי. לכן פיתחנו רומן במערכת מודל במבחנה ללמוד ייזום ביופילם על ידי ש aureus ו- C. אלביקנס על HSV-1 א...

<html> Microbiome האדם כולל אורגניזמים מגוונים מממלכות טקסונומיות מרובות החולקות אזורים גיאוגרפיים בגוף. דבקות משטחי תא היא צעד חיוני ראשון היווצרות ביופילם, המהווה חלק של תהליך הקולוניזציה Microbiome. כלול Microbiome יכול להיות וירוסים שגורמים זיהומים כרוניים ומתמשכים. זיהום התא הכרוני על ידי וירוסים אלה יכול לגרום שינוי זמין קולטן משוער. 1,2 בנוסף, ערך בתא ידי פתוגנים התאיים גם יכול להשפיע נזילות הממברנה מארחת / הידרופוביות אשר בתורו עשוי לשנות מצורפת של חברי Microbiome אחרים, כוללים חיידקים ופטריות . על מנת להבין את האינטראקציה שהוא יכול להתרחש בין פתוגנים רבים אלה ושהשיתוף למקם באותה האזורים הגיאוגרפיים של המארח האנושי, עלינו להיות מסוגל ללמוד את האינטראקציה של פתוגנים המייצגים את הספקטרום של ממלכות טקסונומיות נוכחות פני השטח הריריים. t &quot;&gt; The Herpesviridae הם משפחה של חיידקים הנמצאים 100% של בני אדם כמו החברות הקבועות Microbiome 3,4. בנוסף הם יכולים גם להיות לשפוך הן בהתמדה בנוכחות והיעדר תסמינים. באופן ספציפי, הרפס סימפלקס וירוס-1 ו הרפס סימפלקס וירוס-2 (HSV-1 ו- HSV-2, בהתאמה) הן חברות קבועות Microbiome ב oronasopharynx ו בדרך המין. אצל אנשי חיסון מוסמך, הן HSV-1 ו- HSV-2 הגורם gingivostomatitis, כמו גם הרפס גניטלי 5-8. באתרים אלה, HSV גורמת זיהום לטנטי המאופיין 9 ויראלי אסימפטומטית מתמשך שפיכה. כניסה של HSV לתוצאות תאי שינויים בביטוי פני nectins, סולפט heparan, רפסודות שומנים ומגשר כניסה ההרפס / נימק גידול הקולטן לגורם (HVEM / TNFr) 10-25. אלה קולטנים מייצגים משותף פוטנציאלי עבור כמה חיידקים ופטריות, למשל S. aureus ו ג אלביקנס, אשר תוך פתוגנים אופורטוניסטיים,גם יכול להיות מאוחסן כחברי Microbiome הרירית של oronasopharynx 26,27. בתוך oronasopharynx ס aureus ו- C. אלביקנס לכבוש שני לאתרים ייחודיים של קולוניזציה. בשנת מארחים עם שיניים טבעיות, רירית הפה משותפת HSV-1 ו- C. אלביקנס, בעוד nares האף הקדמי תפוס על ידי S. aureus 28. עם זאת, למרות במבחנה הממצאים ס aureus דבקה תאי אפיתל פה, 29,30 ס aureus מבודד לעתים רחוקות מן הדגימות אוראליות כאשר רקמות בריאות קיימת 29,30. מעט מאוד ידוע לגבי נישות שיתוף-קולוניזציה בדרכי מין מעבר הממצאים הקליניים שס aureus קשורה דלקת נרתיק אירובי, מאופיין בדלקת איברי מין, פרשות ו dyspareunia, בעוד ג אלביקנס מייצרת רירית נגעים דומים לזה שנצפה בחלל פי 31-35. לכן, למרות אותם חברי microbi האוראלי באברי המיןשת ממלכות טקסונומיות צלבו מעט מאוד ידוע לגבי האינטראקציה שלהם כפי שהוא משפיע יכל ליזום היווצרות ביופילם דרך דבקות אל פני שטח התא המארח 5. פרוטוקול זה יושם באופן יעיל כדי לקבוע את ההשלכות התפקודיות של שיתוף-קולוניזציה / זיהום.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;C.albicans&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBL Sabouraud Dextrose</td><td>BD</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>Fungisel Agar</td><td>Dot Scientific</td><td>7205A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;S.aureus&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol Salt Agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>7143B</td><td></td></tr><tr><td>Sheep blood agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>221239</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hela cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM (Dubelcco&#039;s Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin 50 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>1397</td><td>50 &amp;micro;g/ml final concentration in the complete DMEM</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% final concentration in the complete DMEM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other medium and reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Thermo Scientific</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Pure X gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (Hanks&#039; Balanced Salt Solution)</td><td>Corning</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dot Scientific</td><td>30042-500</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis</td><td>Life Technologies</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>HSV 1&amp;amp;2, specific for gD</td><td>ViroStat</td><td>196</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D8417-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Gram Crystal Violet</td><td>Troy Biologicals</td><td>212527</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15</td><td>Dot Scientific</td><td>229693&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 150 x 15</td><td>Kord Valmark</td><td>2902</td><td></td></tr><tr><td>96-Well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>Culture tubes 100 x 13</td><td>Thomas Scientific</td><td>9187L61</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip circles, 12 mm</td><td>Deckglaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

determination of biofilm initiation on virus-infected cells by bacteria and fungi

המחקר של אינטראקציות polymicrobial ברחבי הממלכות טקסונומיות הכוללים פטריות, חיידקים ווירוסים לא נבדקו בעבר ביחס כיצד חברי ויראלי של Microbiome להשפיע אינטראקציות חיידק לאחר מכן עם תאים המארח הנגועים בנגיף אלה. השיתוף למגורים של וירוס עם חיידקים ופטריות קיימים בעיקר על המשטחים הריריים של חלל הפה בדרכי מין. תאים ריריים, במיוחד אלה עם זיהומים נגיפיים סמויים כרוניים או מתמשכים מתמשכים, עשויים להיות השפעה משמעותית על חברי Microbiome בעקבות שינויים במבנה נגיף מספר וסוג קולטנים לידי ביטוי. שינוי בארכיטקטורת קרום תא מארח יביא יכולת שינתה החברים הבאים של הפלורה הנורמלי פתוגנים אופורטוניסטים ליזום את הצעד הראשון ההיווצרות ביופילם, כלומר, הדבקות. מחקר זה מתאר שיטה כדי לכמת ובדיקה ויזואלית של האפקט של HSV על הייזום של biofilהיווצרות מ (דבק) של ס aureus ו- C. אלביקנס.

רמת החוסן של נתוני השגה מהמערכת המתוארות בדוח זה מוצגת af איור 2 38. באמצעות השימוש במערכת זו האפנון של אינטראקצית staphylococcal ופטריות עם תאים נגועים בנגיף והשפיע על כל הדבקות של אחרים יכול להיות תחום. סוגים של מחקרים אלה דורשים בדיקה מיקרו?...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi at JoVE.com

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

קביעת Biofilm ייזום על תאים נגועים בנגיף על ידי חיידקים ופטריות

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

determination-biofilm-initiation-on-virus-infected-cells-bacteria

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K Views.  Midwestern University. A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Video: Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Assay עבור הידבקות ואת הפלישה אגר ב cerevisiae ס

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Biology

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

כלים מיקרופלואידיים לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה התאית

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Bioengineering

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

<meta charset="utf8"></head><body>מדידת הנדידה והיווצרות הביופילם של חיידקים שונים

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

מדידת הנדידה והיווצרות הביופילם של חיידקים שונים

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

Candida albicans Biofilm Formation in an In Vivo Mouse Model

Source: Kuchar&#237;kov&#225;, S., et al.&#160; <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52239">Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the development of an in vivo mouse model to study the biofilm formation of Candida albicans in subcutaneous tissue. The experiment involves implanting Candida-infected devices in the animal&#39;s back region for biofilm development.

קנדידה אלביקנס היווצרות ביופילם במודל עכבר In Vivo

1. C. albicans Growth

	Twenty-four hours before the initiation of the animal experiment, prepare yeast extract peptone dextrose, YPD plates by adding 10 ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

In Vitro and In Vivo Models

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

Source: Guennoc, Cora Miquel, et al, <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54771">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

שיטה להכנת דגימות כדי לדמיין חיידקים יוצרי ביופילם על קורים פטרייתיים

1. Preparation of an In Vitro Biofilm of Bacteria on the Fungal Colony

	Centrifuge the bacterial culture at 5,000 x g for 3 min and suspend the pellet in ...

קביעת Biofilm ייזום על תאים נגועים בנגיף על ידי חיידקים ופטריות

Summary

Explore More Videos

Assay עבור הידבקות ואת הפלישה אגר ב cerevisiae ס

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

מתודולוגיות לימוד

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

כלים מיקרופלואידיים לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה התאית

מדידת הנדידה והיווצרות הביופילם של חיידקים שונים

מדידת הנדידה והיווצרות הביופילם של חיידקים שונים

קנדידה אלביקנס היווצרות ביופילם במודל עכבר In Vivo

שיטה להכנת דגימות כדי לדמיין חיידקים יוצרי ביופילם על קורים פטרייתיים