העבודה בכתב יד זה נתמכה על ידי כספים מחוג לאונקולוגיה הקרינה וצייד מכון הסרטן והמכון הלאומי לבריאות מענק (R01-CA188520) לSB. אני מודה דניאל ג&#39;ונסון וסטיבן בנט במעבדה שלי עבור הוכחה בפרוטוקול ומסביר את היתרונות שלה. אני אסיר תודה לד&quot;ר מאהש Chandrasekharan (צייד מכון הסרטן) להערות ביקורתיות על כתב היד.

1. immunoprecipitation הכרומטין (שבב) הבאים תיוג BrdU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי NIH3T3 תרבות בנוכחות או DMSO או מעכבי HDAC1,2 סלקטיבי כפי שתואר לעיל 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות טיפול במעכבים סלקטיביים DMSO או HDAC1,2, להוסיף BrdU לתאים בתרבית רקמת מכסה המנוע סטרילי. דגירה 2 x 10 6 NIH3T3 תאים מצופים ב 10 מיליליטר תקשורת NIH3T3 עם 20 מיקרומטר ריכוז סופי של bromodeoxyuridine (BrdU) במשך 60 דקות בתרבית רקמת חממה סטרילית 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבוני Crosslink תאיים ל- DNA על ידי הוספת פורמלדהיד ישירות לתקשורת והתרבות בריכוז סופי של 1%. דגירה 2 x 10 6 תאי NIH3T3 עם פורמלדהיד ב RT במשך 10 דקות על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את הקישור הצולב על ידי התוספת של גליצין לריכוז סופי של 125 מ&quot;מ. לדגור על RT במשך 5 דקות על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה ולאסוף תאים בPBS בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. cel ספיןLS 956 בXG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. שטוף את התא גלולה פעמיים עם PBS קר כקרח. הסר PBS מהצינור. אחסן את התא גלולה צולבים ללא PBS (supernatant) ב -80 ° C עד שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את lysate מהתא גלולה crosslinked על ידי הוספת חיץ FA140 500 μl (50 מ&quot;מ של HEPES KOH 7.5 pH, 140 מ&quot;מ של NaCl, 1 מ&quot;מ של EDTA (pH 8.0), 1% Triton-X-100 ושל 0.1% deoxycholate נתרן) בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגזירה הכרומטין ידי sonicating דוגמאות חמש פעמים ב -35% כוח ועם דופק 15 שניות, 0.9 שניות ובהגדרה 0.1 שניות מ. שמור את הצינורות על קרח לאחר כל סיבוב של sonication כדי למנוע חימום של הדגימות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הגז על ג&#39;ל DNA כיעילות הגז תנוע בין sonicators שונה. כדי לבדוק sonication, הפוך crosslink ידי הוספת NaCl בריכוז של 0.16 M ולבצע צעדים 1.17.1. - 1.22. הפעלת eluted 10 DNA μl על ג&#39;ל agarose 1.5% כדי לבדוק אם הגז הואבין 300-700 נקודות בסיס בעוצמה ממוצעת על 500 נקודות בסיס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות sonication, דגימות צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 17949 XG ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לצינור חדש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הערכת חלבון באמצעות ערכת assay החלבון המסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. השתמש בכמות שווה של lysate לשבב של שליטה ודגימות ניסוי. בדרך כלל, להשתמש 1 מ&quot;ג של lysate הכולל לכל תגובת שבב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרחיף 50% מ- agarose חלבון באמצעות חיץ FA140 המכיל מעכבי פרוטאז קוקטייל. להוסיף 1/10 נפח של מעכבי פרוטאז הקוקטייל. חשב את הנפח של חרוזים צורך מבוסס על מספר הדגימות בסך הכל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים-agarose חלבון לשטוף עם חיץ FA140 פעמיים כדי להסיר את חיץ האחסון ולהוסיף נפח שווה לחיץ FA140 לחרוזים לעשות slurry 50%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר חלבונים שאינם במיוחד לאגד את חרוזים, להוסיף 50 μl של תרחיף 50% מ- agarose חלבון ובcubate הדגימות ב 4 ° C עם רוטציה הסוף-על-קצה קבוע במיקסר מתקן צלייה למשך 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הדגימות ב956 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך דקה. לאסוף את supernatant ולבצע immunoprecipitation על ידי הוספה או נוגדן H4K16ac 8 μl או 5 μl (5 מיקרוגרם) של 1 מ&quot;ג / מיליליטר נוגדן SMARCA5 לsupernatant. דגירה על 4 מעלות CO / N עם סיבוב קצה על קצה קבוע במיקסר מתקן צלייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוסכים 1/10 בתמצית לשליטה &#39;קלט&#39; ולהגדיר אותו כצד ב -20 ° C. הקלט צריך להיות הפוך צולבים יחד עם דגימות ה- IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכמות שווה של IgG ארנב (5 μl של 1 מ&quot;ג / מיליליטר) כמדגם immunoprecipitation ביקורת השלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להוסיף 50 μl של 50% תרחיף-agarose חלבון לתמצית דגירה עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה חרוזים agarose ידי צנטריפוגה ב956 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C, להסיר את supernatant וwa זהירותsh חרוזים עם המאגרים ברצף הבאים. בהכנות חיץ, להוסיף מעכבי פרוטאז ממש לפני השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מלח נמוך מורכבת הצפת לשטוף חיסונית (FA140; ריכוז סופי של 50 מ&quot;מ של HEPES KOH pH 7.5, 140 מ&quot;מ של NaCl, 1 מ&quot;מ של EDTA (pH 8.0), 1% Triton-X-100 ושל 0.1% deoxycholate נתרן) ל 5 דקות במעלות צלזיוס 4 עם סיבוב קצה על קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מלח גבוה קומפלקס הצפת לשטוף חיסונית (FA500; ריכוז סופי של 50 מ&quot;מ של HEPES KOH pH 7.5, 500 מ&quot;מ של NaCl, 1 מ&quot;מ של EDTA (pH 8.0), 1% Triton-X-100 ושל 0.1% deoxycholate נתרן) ל 5 דקות במעלות צלזיוס 4 עם סיבוב קצה על קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם LiCl מורכב הצפת לשטוף חיסונית (ריכוז סופי של 10 מ&quot;מ של טריס-Cl pH 8.0, 250 מ&quot;מ של LiCl, 0.5% ו -0.5% NP40 deoxycholate נתרן) במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס עם רוטציה הסוף-על-קצה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות שטיפות כפי שתואר לעיל, להוסיף 200 פתרון elution μl (ריכוז סופי של SDS 1% ויקרבונט 100 מ&quot;מ נתרן) וincubatדואר ב RT במשך 15 דקות עם סיבוב קצה על קצה על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הדגימות ב956 XG ב RT ולהעביר את eluate לצינור 1.5 מיליליטר חדש. חזור על שלב 1.15 עם פתרון elution 200 μl נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 μl של eluate, להוסיף NaCl לריכוז של 0.16 M ומערבבים היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף, להוסיף פתרון elution 400 μl 10 קלט μl שלהפריש (שלב 1.11) ולהוסיף NaCl לריכוז של 0.16 M להפוך דגימות קלט crosslink גם כן. הפוך crosslink הדגימות ידי דוגרים באמבט המים C ° 65 במשך 5 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של 100% EtOH לeluate ההפוך-crosslinked. מערבבים היטב דגירה ב -80 ° C 2 - 3 שעות או ב -20 CO ° / N. ספין הדגימות ב17949 XG במשך 15 דקות וזורקי אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 800 אתנול 70% μl ללשטוף את הכדור. ספין ב17949 XG במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס וזורקי אתנול. ספין בקצרה כדי להסיר כל אתנול שיורית. האוויר יבש הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להסיר אתנול שייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים DNA ב -90 RNase μl ומים חופשיים DNase ולהוסיף 2 μl 10 מ&quot;ג / מיליליטר RNase ב0.2 מ&quot;ג / מיליליטר ריכוז סופי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl 10x proteinase K הצפת (100 מ&quot;מ טריס pH-Cl 8.0, 50 מ&quot;מ EDTA pH 8.0, 5% SDS). מערבבים היטב ומוסיף μl 1 proteinase ק לדגור על 42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA קלט והשבב באמצעות ערכת טיהור מסחרית PCR על פי הפרוטוקול של היצרן וelute DNA במי 50 μl. DNA החנות ב -20 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol> 2. חריץ ניתוח כתם של השבב ה- DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את התשואה של קלט ושבב ה- DNA eluted במי 50 μl כמתואר בשלב 1.22 באמצעות ספקטרופוטומטר ב 280 ננומטר פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כמויות שווה (50 μl) של קלט או DNA immunoprecipitated שנמצאים בטווח ליניארי של זיהוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא, אם קלטתשואת DNA היא 1.5 ng / μl, ואז לקחת 30 μl (או 45 ng DNA סך הכל) ולהפוך את נפח 50 μl עם מים. לשבב גורם, לקחת את כל eluate 50 μl משלב 2.1 והמשיכו לשלב 2.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל 50 קלט μl או DNA immunoprecipitated ידי הוספת 2.5 כרכים של 0.4 N NaOH, בקצרה מערבולת ו צנטריפוגות לXG 956 במשך 10 שניות, ולדגור על RT למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את ה- DNA מפוגל ידי הוספת 175 μl של 1 M טריס- HCl, pH 6.8, מערבולת, צנטריפוגות במשך 956 XG במשך 10 שניות ומניחים את הדגימות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול סדרתי של קלט וDNA immunoprecipitated עבור assay כתם חריץ כמפורט להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הפעולות 2.3-2.4 כדי לקבל נפח דגימה כולל של 350 μl (כלומר, 50 קלט μl / השבב ה- DNA, 125 μl 0.4 N NaOH, 175 μl 1 M טריס- HCl, pH 6.8). הערה: הדוגמא האמורה לעיל, 45 ng של DNA הקלט יהיה בסופו .129 ng / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לDNA קלט, תווית שלושה צינורשל 100, 50 ו -25 ולהוסיף 100 μl, 50 μl ו -25 μl של דגימת DNA מפוגל ונוטרלה. הפוך את הנפח הסופי 100 μl עם מים nuclease חינם. לשבב ה- DNA, תווית שלושה צינורות 200, 100 ו -50 ולהוסיף 200 μl, 100 μl ו -50 μl של דגימת DNA מפוגל ונוטרלה. הפוך נפח סופי 200 μl עם מים nuclease חינם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקרום לגודל של מנגנון כתם חריץ. טרום להרטיב את הקרום וניירות סופג ב20x SSC לפני ולפני הוספת ה- DNA. להרכיב אותם למנגנון כתם חריץ על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA Pipet מצעד 2.5.2 לחריצים מתאימים. החל ואקום לאט למשוך את ה- DNA על הממברנה זטה-בדיקה. תפסיק ואקום לאחר כל הדגימות שעברו במנגנון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את המנגנון ולשתק באופן מיידי את ה- DNA על הממברנה באמצעות crosslinker UV. יש צד DNA בcrosslinker UV ולהשתמש autocrosslink ההגדרה בcrosslinker. עקוב הפרוטוקול של היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי BrdU על כתם החריץ על ידי ביצוע מערבי סופג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה עם 5% חלב יבש ללא שומן PBS המכילים 0.1% Tween-20 (PBST) במשך שעה 1 ב RT כדי למנוע שאינו ספציפי המחייב של נוגדנים לממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נוגדן ראשוני נגד BrdU (1: 500 דילול) בדילול מלא בחלב 1% יבשים ללא שומן בPBST דגירה הכתם עם הנוגדן הראשוני עבור 3 שעות ב RT על שייקר. לשטוף את הממברנה עם PBST שלוש פעמים לאחר הדגירה הנוגדן הראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוגדן המשני אנטי עכבר HRP-מצומדות לכתם (1: דילול 5000) ולדגור על RT עבור שעה 1. לשטוף את הממברנה עם PBST שלוש פעמים לאחר הדגירה נוגדנים משני. הערה: השתמש בנפח מספיק של הנוגדנים כדי לכסות את הקרום במהלך incubations נוגדן הראשוני והמשני לחלוטין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת ECL ולהוסיף אותו לAC הכתםcording לפרוטוקול של היצרן. דגירה הממברנה עם תערובת ECL במשך 5 דקות על RT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקרום בקלטת רנטגן, לחשוף את הקרום לסרט X-ray ולפתח את הכתם באמצעות הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את האות המתקבל עבור קלט וDNA ChIPed לאחר סריקת הכתמים באמצעות תוכנת J תמונה על פי הפרוטוקול של היצרן. לכימות, להשתמש באות שנמצאת בטווח ליניארי של זיהוי על מנת להבטיח דיוק של מדידה. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX+Phosphorylation%3A+Its+Role+in+DNA+Damage+Response+and+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy.</a> J nucleic acids. , (2010).</li>
<li>Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+challenges+during+DNA+replication+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin challenges during DNA replication and repair.</a> 128, 721-733 (2007).</li>
<li>Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodelling+and+DNA+replication%3A+from+nucleosomes+to+loop+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains.</a> Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+histone+deacetylase+3+reveals+critical+roles+in+S+phase+progression+and+DNA+damage+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control.</a> Mol Cell. 30, 61-72 (2008).</li>
<li>Bhaskara, S., Hiebert, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+histone+deacetylase+3+in+maintenance+of+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability.</a> Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+maintain+S-phase+chromatin+and+DNA+replication+fork+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression.</a> Epigenetics Chromatin. 6, 27(2013).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hdac3+is+essential+for+the+maintenance+of+chromatin+structure+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability.</a> Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).</li>
<li>Johnson, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC1%2C2+inhibition+impairs+EZH2-+and+BBAP-mediated+DNA+repair+to+overcome+chemoresistance+in+EZH2+gain-of-function+mutant+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma.</a> Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).</li>
<li>Bhaskara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+regulate+DNA+replication+and+DNA+repair%3A+potential+targets+for+genome+stability-mechanism-based+therapeutics+for+a+subset+of+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers.</a> Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).</li>
<li>Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplication+and+maintenance+of+heterochromatin+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Duplication and maintenance of heterochromatin domains.</a> J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).</li>
<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492, 280-284 (2012).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).</li>
</ol>

I have no competing financial interests.

הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה הוא שיטה מהירה יחסית להפגין הנוכחות של חלבונים או הצורות שונה לאחר translationally על DNA משוכפל או המתהווה חדשים. בנוסף, טכניקה זו מאפשרת לאדם למדוד את קינטיקה עמותה-הניתוק של חלבון או צורה שונה שלה עם ה- DNA המתהווה. טכניקה זו היא משלימה את טכנולו?...

תיקון דנ&quot;א פגום ו / או שכפול ה- DNA הוא אחד גורמים עיקריים לחוסר יציבות הגנום, שיכול לגרום למוות של תאים. הפסקת גדיל בודדת מתוקנת כפולה מספיקה כדי לגרום לתא מוות 1. ארגון הכרומטין משתנה זמני במהלך שני השכפול ולתקן 2,3, ואי-שמירה על מידע אפיגנטיים בתהליכים אלה יביאו לאיום על שלמות הגנום. אובדן HDAC3 או פונקצית HDAC1,2 מעכב התקדמות S-שלב, שכפול הדנ&quot;א ותיקון מוביל ללחץ genotoxic (נזק לדנ&quot;א) ותא מות 4-9. לכן אסטרטגיה מעשית לשימוש במעכבי HDAC סלקטיבית לשבש שכפול, תיקון והכרומטין בתאי סרטן ולגרום נזק לדנ&quot;א, אשר בתורו יכול לעצור את הצמיחה ולגרום למוות של תאים באופן סלקטיבי בתאי הסרטן גדלו במהירות. במהלך שכפול הדנ&quot;א, הכרומטין הוא מפורק במהירות ולאחר מכן מחדש הבא שכפול ה- DNA. חדש סאיH4 היסטון nthesized הוא acetylated בK5 ושאריות K12 (H4K5K12ac) והתצהיר הבא על הכרומטין, הם deacetylated במהירות על ידי deacetylases היסטון (HDACs) 10,11. כישלון של תאים כדי לשמור על שלמות הכרומטין המתהווה ידי deacetylation היסטון יכול להוביל לקריסת מזלג, אשר בתורו יכול לגרום לניזק לדנ&quot;א ומוות של תאים. לאחרונה הראה כי עיכוב סלקטיבי של HDAC1,2 מגביר acetylation היסטון (H4K5ac, H4K12ac וH4K16ac) ומעכב את פעילות remodeler הכרומטין SMARCA5 על הכרומטין המתהווה, שבקורלציה עם התקדמות מזלג שכפול מופחתת, הגדילו את קריסת מזלג והגדילו את הנזק לדנ&quot;א מתח מושרה שכפול 6 . לפיכך, טיפול מעכב HDAC יכול לשנות את מבנה הכרומטין המתהווה כדי לעורר נזק לדנ&quot;א ומוות מהר מאוד בתאי סרטן, כמו מחזור תאים אלה במהירות ועובר פעמים רבות דרך S-השלב. לכן חשוב להבין כיצד HDACs לתפקד להסדיר acetylation היסטון ובינדי החלבוןng לשמור שכפול ה- DNA בתאי יונקים. כמותית למדוד את כמות acetylation היסטון וremodeler הכרומטין SMARCA5 קשורה עם DNA המתהווה בעת שכפול ה- DNA, שהמצאנו assay שבב שונה נקרא טכניקת BrdU-שבב חריץ-המערבית. בעקבות immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של שינוי חלבון או היסטון רצוי, כמות ה- DNA המתהווה (שכותרתו באמצעות אנלוגי תימידין, BrdU) במדגם השבב ניתן לאתר באמצעות ניתוח מערבי של שכותרת BrdU השבב ה- DNA מועבר על גבי קרום באמצעות חריץ מנגנון כתם. שימוש בטכניקה זו, הראינו כי בן משפחת ISWI SMARCA5 (רגולטור אקטין תלויה הקשורים מטריצה ​​הקשורות SNF SWI / של הכרומטין) remodeler הכרומטין H4K16ac (סימן המעורב באריזת הכרומטין) וקשורים עם ה- DNA בתאים המתהווה S-שלב 6. מצאנו גם כי סימן H4K16ac המתהווה הוא deacetylated ידי HDAC1,2 במהלך שכפול הדנ&quot;א 6. מעכב H4K16acפעילות remodeler הכרומטין בן משפחת ISWI 12 SMARCA5 של. לפיכך, שימוש בטכניקת BrdU-CHIP-חריץ-מערבי, אנחנו יכולים לחבר את הפונקציות לHDAC1,2 בויסות שיפוץ הכרומטין בעת ​​שכפול ה- DNA. לפיכך, טכניקת BrdU-שבב חריץ-המערבי הכתם היא גישה רבת עוצמה למדידת כמותית דינמיקת העמותה וניתוק של חלבונים או לאחר translational שינוייהם שקשורים ל- DNA המתהווה.

<table><tbody><tr><td>Anti-BrdU (westerns)</td><td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H4K16ac</td><td>Active Motif</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Zeta-Probe GT Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Protein A agarose</td><td>Millipore</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Corporation</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-treated water</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Mallinckrodt GenAR&amp;nbsp;</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Life Technologies</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Lab Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>X-ray film</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier&amp;nbsp; Digital Ultrasonic Cell Disruptor</td><td>Model: 450</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Model: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>Model: 2322</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 spectrophotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>Model: 1000</td><td></td></tr><tr><td>Slot Blot apparatus&amp;nbsp;</td><td>Schleicher and Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators</td><td></td></tr></tbody></table>

examination of proteins bound to nascent dna in mammalian cells using  brdu-chip-slot-western technique

deacetylases היסטון 1 ו -2 (HDAC1,2) בתרגום לאתרים של שכפול הדנ&quot;א. במחקר הקודם, באמצעות מערכת מציאה גנטית מעכב וסלקטיבי, הראינו פונקציות חדשניות לHDAC1,2 בהתקדמות מזלג שכפול ותחזוקת הכרומטין המתהווה בתאי יונקים. בנוסף, השתמשנו בטכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי המשלבת immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של bromo-deoxyuridine DNA -labeled (BrdU) עם כתם חריץ ומערבי מנתחת למדוד כמותית חלבונים או שינוי היסטון קשור עם DNA המתהווה. פעיל טופלו תאי החלוקה עם מעכב סלקטיבי HDAC1,2 או transfected עם siRNAs נגד Hdac1 וHdac2 ולאחר מכן DNA מסונתז חדש תויג עם bromodeoxyuridine האנלוגי תימידין (BrdU). תיוג BrdU נעשה בנקודת זמן שבו לא הייתה עצירת מחזור התא משמעותית או אפופטוזיס עקב האובדן של פונקציות HDAC1,2. l הבאabeling של תאים עם BrdU, immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של סימני acetylation היסטון או הכרומטין-remodeler בוצע עם נוגדנים ספציפיים. ה- DNA הקלט שכותרת BrdU וimmunoprecipitated (או ChIPed) DNA אז הבחינו על קרום באמצעות טכניקת כתם חריץ ומשותק באמצעות UV. כמות ה- DNA המתהווה בכל חריץ אז כמותית הוערכה באמצעות ניתוח מערבי עם נוגדן אנטי BrdU. ההשפעה של אובדן של פונקציות HDAC1,2 ברמות של סימנים מסונתזים חדש הקשורים DNA היסטון acetylation וremodeler הכרומטין הייתה אז נקבעה על ידי נרמול אות BrdU-השבב המתקבלת מהדגימות שטופלו על דגימות השליטה.

כדי לקבוע את הספציפיות של מעכבי HDAC1,2 סלקטיבי, תאי fibrosarcoma Hdac1,2 פלורידה / פלורידה וHdac3 פלורידה / פלורידה היו בשימוש. recombinase Cre (Ad-Cre) המכיל אדנווירוס שימש למחוק Hdac1,2 וHdac3 בתאים אלה. זיהום Ad-Cre הבא של Hdac1,2 פלורידה / פלור...

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique at JoVE.com

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

examination-proteins-bound-to-nascent-dna-mammalian-cells-using-brdu

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K Views.  University of Utah School of Medicine. In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA. 

Video: Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Genetics

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Biochemistry

מדידת קישורים מוצלבים של DNA-PROTEIN Ubiquitylated, SUMOylated ו-ADP-Ribosylated

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

Author Spotlight: זיהוי כמותי של הצלבות חלבוני DNA והשינויים שלאחר התרגום  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be assessed by alkaline hydrolysis and gel electrophoresis as RNA is highly susceptible to hydrolysis in alkaline conditions. This, in combination with Southern blot analysis can be used to determine the location and strand into which the ribonucleotides have been incorporated. However, this procedure is only semi-quantitative and may not be sensitive enough to detect small changes in ribonucleotide content, although strand-specific Southern blot probing improves the sensitivity. As a measure of one of the most striking biological consequences of ribonucleotides in DNA, spontaneous mutagenesis can be analyzed using a forward mutation assay. Using appropriate reporter genes, rare mutations that results in the loss of function can be selected and overall and specific mutation rates can be measured by combining data from fluctuation experiments with DNA sequencing of the reporter gene. The fluctuation assay is applicable to examine a wide variety of mutagenic processes in specific genetic background or growth conditions.

Ribonucleotides are among the most abundant non-canonical nucleotides incorporated into the genome during eukaryotic nuclear DNA replication. If not properly removed, ribonucleotides can cause DNA damage and mutagenesis. Here, we present two experimental approaches that are used to assess the abundance of ribonucleotide incorporation into DNA and its mutagenic effects.

לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs for cancer treatment. These targets are poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs), which initiate various forms of DNA repair. Inhibiting these enzymes using PARP inhibitors (PARPi) achieves synthetic lethality by conferring a therapeutic vulnerability in homologous recombination (HR)-deficient cells due to mutations in breast cancer type 1 (BRCA1), BRCA2, or partner and localizer of BRCA2 (PALB2). 
Cells treated with PARPi accumulate DNA double-strand breaks (DSBs). These breaks are processed by the DNA end resection machinery, leading to the formation of single-stranded (ss) DNA and subsequent DNA repair. In a BRCA1-deficient context, reinvigorating DNA resection through mutations in DNA resection inhibitors, such as 53BP1 and DYNLL1, causes PARPi resistance. Therefore, being able to monitor DNA resection in cellulo is critical for a clearer understanding of the DNA repair pathways and the development of new strategies to overcome PARPi resistance. Immunofluorescence (IF)-based techniques allow for monitoring of global DNA resection after DNA damage. This strategy requires long-pulse genomic DNA labeling with 5-bromo-2&#8242;-deoxyuridine (BrdU). Following DNA damage and DNA end resection, the resulting single-stranded DNA is specifically detected by an anti-BrdU antibody under native conditions. Moreover, DNA resection can also be studied using cell cycle markers to differentiate between various phases of the cell cycle. Cells in the S/G2 phase allow the study of end resection within HR, whereas G1 cells can be used to study non-homologous end joining (NHEJ). A detailed protocol for this IF method coupled to cell cycle discrimination is described in this paper.

In the present protocol, we demonstrate how to visualize DNA double-strand end resection during S/G2 phase of the cell cycle using an immunofluorescence-based method.

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי

Summary

Explore More Videos

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט

לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא