אנו מודים לבני זוג. מרקוס מנז ואירווינג וייסמן למתן חומרים כימיים. אנחנו גם מכירים את השירות הניתן על ידי Cytometric ניתוח הזרימה ותא מתקן המיון Core הראשון והמעבדה הליבה השנייה בלאומית טייוואן אוניברסיטת קולג &#39;של בית חולים לרפואה וNTU, בהתאמה. עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן (רוב 102-2,320-B-002-030-MY3) ומכוני מחקר הבריאות הלאומי, טייוואן (NHRI-EX102-10256SI וNHRI-EX103-10256SI).

/ 6 עכברי wild-type C57BL נרכשו מהמרכז הלאומי בעלי החיים במעבדה (NLAC), טייוואן. כל העכברים התרבו וכל זמן תחת תנאי הפתוגן ללא ספציפיים. פרוטוקולים ונהלי שימוש בבעלי החיים היו נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של לאומית טייוואן המכללה לרפואה של האוניברסיטה (הרשאה מס &#39;: 20,120,075). בנוסף, חוקרים עשו כל מאמץ כדי לצמצם את הפוטנציאל לכאב, לסבל, או מצוקה בבעלי החיים בעת ביצוע ניסויים. כל ההליכים המתוארים בוצעו ב RT בכפפות. 1. הכנת AC-6 תאי מזין הערה: AC-6.21 (AC-6 בקיצור) שורת תאי סטרומה 18 (המסופקת על ידי י &#39;וייסמן, אוניברסיטת סטנפורד) יש לשמור בRPMI בתוספת 15% בסרום חום מומת שור עוברי (FBS). לשמש כתאים מזינים, AC-6 תאים עם 3,000 rad (30Gy) יום אחד לפני שיתוף התרבות למניעת תפוצתם מוקרן γ. ה הערהבAC-6 תאים נוטים לאבד את היכולת לתמוך ב- ההתמיינות שלהם אם נותרו צפוף בתחזוקה, או אם מספר המעבר שלהם הוא מעל 20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף AC-6 תאים פעם אחת עם 1 מיליליטר פוספט שנאגר מלוח של Dulbecco (DPBS) ולהסיר DPBS על ידי שאיפה. פנק את AC-6 תאים עם 0.8 מיליליטר פתרון טריפסין (טריפסין 0.05% ו -0.5 מ&quot;מ EDTA בDPBS) במשך 3-5 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולאחר מכן לעצור את התגובה על ידי דילול זה עם 10 כרכים של מדיום תרבות להפוך את ההשעיה תא בודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע AC-6 תאים ב5.9x10 4 תאים / גם לתוך 12 גם צלחות ולדגור על 37 מעלות צלסיוס, 5% CO 2 O / N. הערה: הצפיפות של AC-6 תאים היא מאוד חשובה כמו צפיפות נמוכה תעדיף דור ה- CDC. זריעה בצפיפות של 5.9x10 4 תאים / גם יאפשר AC-6 כדי להגיע confluency ידי למחרת, שהוא אופטימלי לגזירה של pDCs מCLPs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר את AC-6 תאים ב3,000 רד (30 Gy) באמצעות γ-irradiator. הערה: המינון שניתן ללהקרין AC-6 הוא מותאם כדי למנוע את התאים ממתרבים ועדיין לשמור אותם קיימא מספיק זמן כדי לספק את ציטוקינים ומגע תאי תאים דרושים להתמיינות של DCs מCLPs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב ולהחליף עם 1 מיליליטר מלא RPMI (RPMI עם FBS מומת חום 10%, 50 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin וβ-mercaptoethanol 50 מיקרומטר). </li></ol> 2. תאים בודד בע&quot;מ מעכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכברים על ידי CO 2 מחנק ונקע בצוואר הרחם. מניחים את העכברים על מגש לנתיחה ולעקר עם 70% אתנול. עושה חתך באמצע הבטן-ולהסיר את העור מחלקו האחורי של העכבר כולל העור מכסה את הגפיים התחתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח עכברים במכסת מנוע חצי סטרילי. כדי לשחרר את עצם הירך וtibiae, קליפ עצם הירך מעל ומתחת tibiae מפרק הברך. לנתק את השרירים מהעצמות באמצעות מספריים ולמקם את העצמות בצלחת פטרי 6 סנטימטר המכילה 5 מ&quot;ל להשלים RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למכסת מנוע תרבות סטרילית. ממלאי מזרק 3 מיליליטר מחובר למחט 27G עם RPMI השלם. חותך את שני הקצוות של העצמות באמצעות מספריים, ולהכניס את מחט 27G כדי לשטוף את מוח מהעצמות בעדינות על ידי הזרקת RPMI השלם פעם אחת מכל קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה תא בודדת על ידי pipetting העדין התאים למעלה ולמטה 3-5 פעמים בצלחת התרבות באמצעות המזרק ללא המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים 5 דקות בXG 500 ולמזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי דם אדום Lyse עם חיץ 1 מיליליטר ACK (150 מ&quot;מ NH 4 Cl, 10 מ&quot;מ KHCO 3, 0.1 מ&quot;מ EDTA) דוגרים דקות 1 ולעצור את התגובה על ידי דילול עם 10 כרכים של RPMI השלם. לאפשר לתאים לעמוד במשך 5 דקות כדי גלולה למטה גושי תאים מתים ופסולת רקמות על ידי כוח הכבידה. הערה: אל תעמוד יותר מ 5 דק &#39;כמו זה יגרום באובדן תא עקב שיקוע של תאי קיימא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant המכיל תא לאט למזוג לפסולת צינור עוזבת חדשהמאחורי בצינור המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 500 לגלולת התאים, ולאחר מכן להסיר ולבטל את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כולל תאים בע&quot;מ (בדרך כלל 4-6 x 10 7 BM תאים מתקבלים מעכבר אחד) ב -100 μl חיץ FACS (1x PBS + 2% + 1 המ&quot;מ EDTA FBS). </li></ol> 3. FACS ניתוח ומיון של CLPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אנטי-CD16 / 32 (2.4G2 שיבוט supernant hybridoma, 50 μl / תגובה או 1-2 מיקרוגרם / תגובה) לתאים במאגר FACS (שלב 2.9) במשך 1-2 דקות כדי לחסום קולטני Fc. הערה: אנטי-CD16 / 32 גם נקרא בלוק FC, אשר מתווסף למניעה מחייבת הלא ספציפית של נוגדנים לתאים לבטא קולטנים Fc כוללים גרנולוציטים, מונוציטים, ולימפוציטים מסוג B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל להכתים תאים עם הנוגדנים הבאים ניאון שכותרתו צבע (ל4x10 7 תאים) במשך 15 דקות על קרח, הימנעות אור הסביבה. נוגדנים: סמני שושלת PE-מצומדת (0.2 מיקרוגרם לכל אחד) כולל אנטי-CD3 (17 א2), אנטי-CD8 (53-6.7), אנטי-B220 (RA3-6B2), אנטי-CD19 (eBio1D3), אנטי-CD11b (M1 / 70), אנטי-Gr-1 (RB6-8C5), אנטי Thy1.1 (HIS51), אנטי-NK1.1 (PK136), אנטי-TER119 (TER-119), ואנטי-MHC-II (נימר-4), 0.2 מיקרוגרם אנטי-ג-קיט-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 מיקרוגרם אנטי SCA-1-FITC (D7), 0.4 מיקרוגרם אנטי-M-CSFR-APC (AFS98), ושל 0.2 מיקרוגרם אנטי-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאים עם FACS חיץ 3 מיליליטר, וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 300 FACS μl חיץ ותאי סינון דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הצינור עם חיץ FACS 100 μl נוסף להתאושש כל תאים הנותרים ולסנן לFACS סטרילי מיון צינור תוך שימוש באותה מסננת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח התזרים cytometric מייד לאחר הצביעה באמצעות מסננים ומתחים מתאימים לגילוי אות. השתמש 488 ננומטר לייזר כדי לזהות את הנוגדנים שכותרת PerCP-Cy5.5 FITC-,, 561 ננומטר לייזר כדי לזהות פטרוביץ, ונוגדני PE-labelded-Cy7 ואס 633 ננומטראה לזהות את הנוגדן שכותרתו APC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין את CLPs פי הסמנים הבאים לין - SCA-1 int M-CSFR int c-kit - IL-7Rα + (כמוכתם בשלב 3.2) באמצעות סדרן תא. לאסוף תאים הממוינים בצינור 15 מיליליטר המכיל 8 מיליליטר של RPMI מלא ככרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המספר המוחלט של תאים ממוינים, כפי שמוצג על ידי סדרן התא בסוף הריצה. בדרך כלל, ניתן להשיג 5x10 4 CLPs מBM של עכבר אחד. </li></ol> 4. CLPs וCoculture AC-6 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים הממוינים מצעד 3.7 במשך 10 דקות ב 500 XG, להסיר את supernatant וresuspend התא גלולה עם מספיק RPMI השלם כדי להשיג צפיפות תאים סביב 5x10 מיליליטר / 4 תאים. תאי זרע 500 / גם לתוך הצלחת 12-המכילה גם תאים מזינים מוכנים בשלב 1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 ng / ml FL 19 (הו-Flt3L איג שנוצר בבית באמצעות מערכת ביטוי הניתנת על ידי מ &#39;מנז, Universiטאי החולים ציריך, שווייץ) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עם ניטור חזותי תקופתי של פיתוח DC תחת מיקרוסקופ. הערה: FL האנושי רקומביננטי ניתן להשיג בחנויות או עכבר פלורידה יכולה לשמש כתחליף לhu-Flt3L איג לתמוך בפיתוח DC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים בsupernatant ביום 12 ולשטוף את הבארות פעם אחת עם 0.5 מ&quot;ל להשלים בינוני RPMI שילוב supernatants וכתוצאה מכך. הוסף 0.5 מיליליטר בינוני טרי וגרוטאות התאים חסיד עם מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המדיום המכיל תאים משני החלקים וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי supernatant ו resuspend למזוג במאגר FACS 50 μl. להוסיף אנטי-CD16 supernatant 50 μl / 32 hybridoma דגירה במשך 1-2 דקות כדי לחסום קולטני Fc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנות ולהכתים את כל התאים עם הנוגדנים הבאים (0.05 מיקרוגרם לכל אחד) נגד CD11c-APC (N418), אנטי-CD11b-FITC, ואנטי-B220-PE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ו צנטריפוגות התאים כמו לתארד בשלב 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 100 μl FACS חיץ, שער ב+ CD11c ולנתח לcDCs (CD11c + CD11b + B220 -) וpDCs (CD11c + CD11b - + B220) 17. </li></ol>

<ol>
	<li>Hartwig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor-mediated+antigen+uptake+by+lung+DC+contributes+to+allergic+airway+hyper-responsiveness+and+inflammation.">Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).</li><li>Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dendritic+cell+lineage:+ontogeny+and+function+of+dendritic+cells+and+their+subsets+in+the+steady+state+and+the+inflamed+setting.">The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting.</a> Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).</li><li>Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Function+of+Dendritic+Cell+Subsets.">Development and Function of Dendritic Cell Subsets.</a> Immunity. 40, 642-656 (2014).</li><li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections,+autoimmunity,+and+tolerance.">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).</li><li>Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPC:+professional+type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors.">IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).</li><li>Merad, M., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+homeostasis.">Dendritic cell homeostasis.</a> Blood. 113, 3418-3427 (2009).</li><li>Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+expression+of+the+transcription+factor+e2-2+maintains+the+cell+fate+of+mature+plasmacytoid+dendritic+cells.">Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells.</a> Immunity. 33, 905-916 (2010).</li><li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3++lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3++dendritic+cells+in+vivo.">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).</li><li>Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+potentials+of+early+lymphoid+and+myeloid+progenitors.">Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors.</a> Blood. 97, 3333-3341 (2001).</li><li>D'Amico, A., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+progenitors+of+mouse+dendritic+cells+and+plasmacytoid+predendritic+cells+are+within+the+bone+marrow+hemopoietic+precursors+expressing+Flt3.">The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3.</a> J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).</li><li>Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+differentiation:+myeloid+and+lymphoid+pathways+to+murine+plasmacytoid+dendritic+cells.">Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells.</a> Blood. 121, 11-19 (2013).</li><li>Shigematsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+activate+lymphoid-specific+genetic+programs+irrespective+of+their+cellular+origin.">Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin.</a> Immunity. 21, 43-53 (2004).</li><li>Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells:+recent+progress+and+open+questions.">Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).</li><li>Naik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+subtypes+from+single+precursor+cells+derived+in+vitro+and+in+vivo.">Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo.</a> Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).</li><li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+I+IFN-Flt3+ligand+axis+augments+plasmacytoid+dendritic+cell+development+from+common+lymphoid+progenitors.">A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors.</a> J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).</li><li>Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cell+lines+with+lymphopoietic+activity+express+high+levels+of+a+pre-B+neoplasia-associated+molecule.">Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule.</a> Cell. 48, 1009-1021 (1987).</li><li>Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Flt3+signal+transduction+cascade+rescues+and+enhances+type+I+interferon-producing+and+dendritic+cell+development.">Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development.</a> J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).</li><li>Szilvassy, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia+inhibitory+factor+upregulates+cytokine+expression+by+a+murine+stromal+cell+line+enabling+the+maintenance+of+highly+enriched+competitive+repopulating+stem+cells.">Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells.</a> Blood. 87, 4618-4628 (1996).</li><li>Arcanjo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+heparan+sulfate+derived+from+murine+hemopoietic+stromal+cell+lines:+a+bone+marrow-derived+cell+line+S17+and+a+fetal+liver-derived+cell+line+AFT024.">Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024.</a> J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+progenitor+with+prominent+plasmacytoid+dendritic+cell+developmental+potential.">A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential.</a> Immunity. 38, 943-957 (2013).</li><li>Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+B-lymphoid+cultures+from+murine+bone+marrow+establishment+and+cloning+by+using+stromal+cell+line+AC+6.21.">Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21.</a> Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).</li><li>Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Plasmacytoid+Dendritic+Cell+from+Common+Lymphoid+Progenitors+by+Flt3+Ligand.">Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

כאן אנו מתארים מערכת במבחנה תרבות לדור החזקה של DCS, וpDCs בפרט, ממספר קטן של CLPs. ייחודה של מערכת זו התרבות הוא עקב השימוש של AC-6 תאים, שורת תאי סטרומה, כהאכלה. גישה זו הוכחה לספק לא רק ציטוקינים, כגון IL-7, SCF, M-CSF ופלורידה 20, אלא גם את קשר תאי תאים 21 הדרוש כדי לתמ...

תאים דנדריטים (DCS) הם תאי מציגי אנטיגן מקצועיים שמשחקים תפקיד חשוב בשליטה על תגובות 1 חיסונית. בעוד DCs הוא הטרוגנית, הם יכולים להיות מסווגים באופן כללי לשתי אוכלוסיות, DCS קונבנציונלי (cDCs) וDCs plasmacytoid (PDC) 2,3. בנוסף לאיברי הלימפה, cDCs וpDCs נמצאים גם ברקמות כוללים סרטן ריאות, מעי, ועור 2. המורפולוגיה של cDCs וpDCs שונה, עם cDCs מציג תחזיות כמו דנדריט-והצורה של pDCs להיות כמו תא-יותר פלזמה. בנוסף, סמן העכבר הנפוץ DC, CD11c, באה לידי ביטוי גבוה יותר על cDCs מאשר על pDCs. יתר על כן, cDCs ניתן לחלק עוד יותר לתוך CD11b + CD24 - cDCs וCD11b - CD24 + cDCs, אשר שניהם מבטאים רמות גבוהות יותר של כיתת MHC II ומולקולות costimulatory מאשר לעשות pDCs 2. pDCs מבוגרים, לעומת זאת, הוכח להביע Siglec-H וBST2 4 סלקטיבי. Functionally, cDCs הוא אנטיגן טוב יותר מאשר הצגת תאי pDCs; עם זאת, pDCs יכול לייצר כמות עצומה של סוג אני אינטרפרון על זיהום בנגיף או גירוי דלקתי 5. cDCs וpDCs שניהם קצרים, ולכן, חייב להתחדש כל הזמן מאבות במח העצם (BM) 6,7. העברת מאמצת של אבות משותפים מיאלואידית (CMPS) ואבות הלימפה נפוצים (CLPs) לעכברים קטלני-המוקרנים מוכיחה כי יכולים להיות שנוצרו cDCs וpDCs משני השושלות 8-10. עם זאת, יש קבוצת משנה של pDCs המבטא RAG1 / 2 ויש מגזרי DJ מחדש במוקד IGH 11,12. תאים אלה גם לשתף דמיון מולקולרי עם לימפוציטים מסוג B, כוללים ביטוי של סמן B220, קולטני חישת חומצות גרעין (TLR7 / TLR9), וגורמי שעתוק (Spib וBcl11a) 13, כולל את כל האמינו להיות חתימות של השושלת הלימפה. לכן, CLPים עשוי להיות בחירה טובה עבור דור במבחנה של pDCs בגלל דמיון שושלת. בעוד התדירות של שני cDCs וpDCs בבני אדם ועכברים היא מאוד נמוכה 6 פלורידה, DCS, במיוחד cDCs, יכול להיות שנוצר במבחנה מBM או אבות בנוכחות ציטוקינים, כגון GM-CSF 11,14 או יגנד FLT3 ( ) באמצעות מערכות ללא מזין 11,15,16. למרבה הצער, עם זאת, לא ניתן לייצר מספר גדול של pDCs במבחנה באמצעות FL 11,15,16. בעבר הראה כי pDCs יכול להיות שנוצר במבחנה ביעילות מCLPs באמצעות מערכת המזין AC-6 17. היתרון של שימוש בקו תא סטרומה AC-6 במערכת התרבות הוא שהיא מספקת מגע תאי תאים והפרשה של ציטוקינים התומכים בדור של מספר הגדול של pDCs מCLPs. למרות שייצור עם מערכת זו הוא די חזק, השכפול זהיר של ההליכים המתוארים להלן נדרש אניכדי n כדי להבטיח דור יעיל של pDCs.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108408</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136</td><td>Biolegend</td><td>108708</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse&amp;nbsp; CD11b (PE), cloneM1/70</td><td>Biolegend</td><td>101208</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3</td><td>Biolegend</td><td>115508</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>linage marker/FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100308</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100707</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4</td><td>Biolegend</td><td>107608</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51</td><td>eBioscience</td><td>12-0900-83</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98</td><td>Biolegend</td><td>135510</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105824</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7</td><td>Biolegend</td><td>108106</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34</td><td>Biolegend</td><td>135014</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td>FACS</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Cell sorter</td></tr><tr><td>FACS sorting tube&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>Flow analysis sofrware</td></tr></tbody></table>

in vitro generation of murine plasmacytoid dendritic cells from common lymphoid progenitors using the ac-6 feeder system

תאים הדנדריטים Plasmacytoid (PDC) הם סוג חזק אני אינטרפרון תאים (IFN-I) ייצור המופעלים בתגובה לזיהום או בתגובות דלקתיות. למרבה הצער, מחקר של פונקצית PDC מתעכבת לפי התדירות הנמוכה שלהם באיברי הלימפה, ושיטות קיימות במבחנת דור DC בעיקר להעדיף הייצור של cDCs על pDCs. כאן אנו מציגים גישה ייחודית ליצירת יעילות pDCs מאבות הלימפה נפוצים (CLPs) במבחנה. באופן ספציפי, הפרוטוקול מתואר פרטים כיצד לטהר CLPs ממח עצם וליצור pDCs ידי coculturing עם AC-6 תאים מזינים מוקרן γ בנוכחות יגנד FLT3. מאפיין ייחודי של מערכת זו התרבות הוא שCLPs להעביר מתחת לAC-6 תאים ולהפוך לתאי יוצרי שטח מרוצפים, צעד קריטי להרחבת pDCs. DCs מורפולוגית המובהק, כלומר pDCs וcDCs, נוצרו לאחר כ -2 שבועות עם הרכב של 7pDCs 0-90% בתנאים אופטימליים. בדרך כלל, מספר pDCs שנוצר בשיטה זו הוא בערך פי 100 ממספר CLPs זרע. לכן, מדובר במערכת חדשנית שבה ליצירה וחסונה המספר הגדול של pDCs הנדרש כדי להקל על מחקרים נוספים להתפתחות והתפקוד של תאים אלה.

כולל של 4-6x10 7 תאים BM מבודדים בדרך כלל מעצמות ירך וtibiae של C57BL / 6 עכבר אחד 6-8 WK-ישן, wild-type. כדי למיין את CLPs, הכולל תאי BM מגואלות נוגדני PE מצומדות נגד סמני שושלת (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119, וMHC-II), אנטי -c-קיט-PerCP / Cy5.5, אנטי SCA-1-FITC, אנטי-M-CSFR-APC ואנטי-IL-7Rα-PE / Cy7, ניתחו ומסודרי...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System at JoVE.com

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

in-vitro-generation-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-from-common

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

8.4K Views.  National Taiwan University College of Medicine. In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. 

Video: In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Biology

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים Murine לשימוש 2-פוטון הדמיה

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

הדור של בוגר, בוגרת Tolerogenic דנדריטים תאים, עם שינוי פנוטיפים מטבולית

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state against self-antigens as well as antigens derived from commensal organisms. The disruption of this immune homeostasis can lead to chronic inflammation and to the development of autoimmunity. Dendritic cells (DCs) are the professional antigen-presenting cells of the innate immune system involved in activating na&#239;ve T cells to initiate immune responses against foreign antigens. However, DCs can also be differentiated into TolDCs that act to maintain and promote T cell tolerance and to suppress effector cells contributing to the development of either autoimmune or chronic inflammation conditions. The recent advancement in our understanding of TolDCs suggests that DC tolerance can be achieved by modulating their differentiation conditions. This phenomenon has led to tremendous growth in developing TolDC therapies for numerous immune disorders caused due to break in immune tolerance. Successful studies in preclinical autoimmunity murine models have further validated the immunotherapeutic utility of TolDCs in the treatment of autoimmune disorders. Today, TolDCs have become a promising immunotherapeutic tool in the clinic for reinstating immune tolerance in various immune disorders by targeting pathogenic autoimmune responses while leaving protective immunity intact. Although an array of strategies has been proposed by multiple labs to induce TolDCs, there is no consistency in characterizing the cellular and functional phenotype of these cells. This protocol provides a step-by-step guide for the development of bone marrow-derived DCs in large numbers, a unique method used to differentiate them into TolDCs with a synthetic triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid-difluoro-propyl-amide (CDDO-DFPA), and the techniques used to confirm their phenotype, including analyses of essential molecular signatures of TolDCs. Finally, we show a method to assess TolDC function by testing their immunosuppressive response in vitro and in vivo in a preclinical model of multiple sclerosis.

Here, we present a protocol to develop and characterize tolerogenic dendritic cells (TolDCs) and evaluate their immunotherapeutic utility.

פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר Tolerogenic

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

Medicine

In Vitro Generation of Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors

Source: Chang, S., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53211">In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates an in vitro assay to generate plasmacytoid dendritic cells (pDCs) from common lymphoid progenitor cells (CLPs). Upon co-culturing purified CLPs with &#947;-irradiated feeder cells in the presence of Fms-like tyrosine kinase-3 ligand (FL), the CLPs differentiate into non-adherent pDCs, the presence of which is confirmed using flow cytometry.

דור חוץ גופי של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים מאבות לימפואידים נפוצים

Source: Chang, S., et al. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. ...