עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקי NIH, R44 GM087784 וR01 HL109505. מחברים מודים לצוות הטכני וOEM בGilson, INC לתמיכה טכנית מורחבת.

המחברים MKC, MJG, EEB, NJD וRO הם או היו בזמנם של עובדי פיתוח של InvivoSciences, INC שהגו ופיתחו את הפרוטוקולים רובוטית שתוארו כאן. TW הוא CSO לInvivoSciences INC. SH הנו עובד Gilson INC.

<html> במחקר הנוכחי פיתחנו שיטה של ​​תרבות רובוטיות לייצור iPSC שממזערת וממכן האכלה והמעבר בפורמט צלחת 96-היטב גם בעת מאפשרת קנה מידה עד יעילה. רובוט טיפול נוזלי שימש להאכיל באופן שגרתי מושבות iPSC ומעברם במרווחים זמן קבועים על ידי ניתוק האנזימטית. הרובוט גם לתכנת לייצר צלחות מצופים ג&#39;ל מטריקס ולבצע שיפוע צפיפות זריעה. כאשר פיברובלסטים וiPSCs שומן נגזר היו בתרבית במערכת זו ליותר מ -20 קטעים, כ -3 חודשים, pluripotency נשמר, כמו היו karyotypes היציב. שני שורות התאים היו מסוגלים בידול לשריר לב. יחד, האוסף של פרוטוקולים שתואר כאן מאפשר למשתמשים עם ניסיון מועט מאוד בתאי גזע תרבות, או גישה מוגבלת לציוד תרבות מיוחד, לתאי גזע תרבות ולהשיג ייצור תאים גבוה או רב-קו טיפול עם מינימאלית עבודה ועלות. s = &quot;jove_content&quot;&gt; הפרוטוקולים רובוטית המפורטים כאן מספקים שיטה לקנה מידה עד חסכוני של ייצור וטיפול iPSC. יתרון אחד הוא התרבות של תאי גזע להרחבה בפורמט המבוסס צלחת הוקמה הפגין כאן והעבר 44,47 - 49 כדי לשמור על pluripotency. בעוד פורמטים אחרים של תאי pluripotent תשואת תרבות תאי גזע מדרגי 20,23,29 שיטה מבוססת צלחת זה דורש בעצם לא חל שינוי בפורמט התרבות, כמו adaption להשעיה, שימוש בכימיקלים או antifoaming שימוש ממושך של מעכבי Rho-kinase 20. שיטה מבוססת צלחת זו ולכן במהירות, וצפויה יכולה, להכיל קווים חדשים, כי תנאי התרבות דומים. ככל שהשימוש בiPSCs לדוגמנות מחלה מגביר 4,6,19,50, קווי iPSC חדשים נוצרים באופן רציף. הטכניקות המתוארות כאן הן מתאימות ביותר לקווי תרבות חדשה במדיום לעוצמת שמע גבוה ותפוקה בגלל המחסום למעבר אל הפורמט הוא lאוו. זה נכון גם לעבודה והציוד הדרוש כדי לשמור על המושבות. לבסוף, בגלל הפורמט והטיפול דומים לסביבה המשמשת לחישוב ולאמת קווי iPSC, ביצועי תרבות, כגון בידול מכוון, עשוי להיות צפויים יותר. איור 8 ממחיש אסטרטגיה אחת לקנה מידה מייצור תאי גזע ב96-גם צלחות. צלחת אחת (מחזור 0) משמשת לזרע רובוט 12 צלחות חדשות, גידול של פי 12 (מחזור 0-1). אחרי כמה ימים של האכלה, אחד משנים עשר הצלחות הוא passaged זרע קבוצה נוספת של שנים עשר צלחות (מחזור 1 למחזור 2). הצלחות עשר שנותרו זמינות כעת לשימושים אחרים ומייצגות את רכיב הייצור של המערכת. בקצב הזה, מעבר של צלחת אחת יספק 11 צלחות בכל מחזור, או כל 3-4 ימים. מתודולוגיה זו וניתן לשנותם יותר כאשר צלחות מרובות passaged כפי שמוצגות במעבר מהמחזור 2 למחזור 3. במחזור 3, שתי צלחותתמיד נהג לשמור על המושבה והזרע 24 צלחות חדשות. 22 צלחות הנותרות אז זמינות לשימוש לאחר כל מחזור מעבר. בכל נקודה במחזור תחזוקת המשתמש יכול זרע יותר צלחות להגדיל את הייצור. דוגמא אחת תהיה מעבר לכל עמודה לשני מחזורי צמיחה. המעבר הראשון ממיר צלחת אחת לשנתי עשר צלחות, וכל אחד מעשר הצלחות משמש לזרע 144 צלחות. במקרה זה, משתמש מתחיל עם צלחת אחת ואחרי שני מעברים, או על 1.5-2 שבועות של תרבות, יש 144 צלחות. לדוגמא, קווי iPSC פיברובלסטים ושומן להניב כ 25-75,000,000 תאים לכל צלחת 96-היטב כאשר מוכנים למעבר. 144 צלחות לכן יכולות לייצג על 4-7 x 10 9 תאים. מהו נטל העבודה לביצוע 144 96-גם צלחות רובוט? אחת המטרות לעבודה זו הייתה הפקת תאי גזע להרחבה שצמצמה עבודה בהשוואה ל( צלחת כלומר, 6 היטב) מסורתית נובע תרבית תאים. ACC הרובוטomplishes זה על ידי הקלה בצורך להתמודד מבחינה פיזית כל צלחת במהלך ההאכלה וpassaging. בעוד קשקשי ייצור צלחת 96-היטב באופן ליניארי כמו שזה יהיה ב6-גם צלחות מסורתיות, זמן טכנאי מבלה בעבודה עם הצלחות הוא פחות משמעותי באמצעות תרבות רובוטית. יעילות הייצור של תרבות רובוטית נגזרת מהבדל זה (איור 9). נמצא טכנאים יכולים להסיר 6-גם צלחת מן החממה, לבדוק את זה במיקרוסקופ, אז לשאוב ולהאכיל את הצלחת בכ -3.5 דקות. לשם השוואה, טכנאים לבלות כ -30 שניות הסרת צלחת 96-היטב מהחממה ובודקים אותו במיקרוסקופ לצפיפות וזיהום לפני הצבתו על הרובוט. עם פרוטוקול האכלה מורחב דומה לזה שתואר לעיל, ניתן לטעון שש 96-גם צלחות והפד, אשר לוקחת כ -21 דקות, או 3.5 דקות לכל צלחת. סה&quot;כ הזמן שחלף כדי להאכיל את הצלחת הוא השוואה בין הרובוטIC ושיטות ידניות, אלא יד להאכיל 6 צלחות טכנאי נדרש לכל 21 דקות ואילו הטכנאי מבלה רק 3 דקות טיפול שש הצלחות לרובוט (בדיקת 30 שניות לכל צלחת). כאיור 9 מופעים, זמן טכנאי מבלה טיפול 144 צלחות באמצעות הרובוט הוא כ -1.2 שעות לעומת 8 שעות באופן ידני והרובוט לעולם לא יעשה טעות טיפול הצלחות או העברת נוזלים. שיטות תרבות iPSC 96-היטב המתוארות כאן לספק פלטפורמה צייתנית למשימות הקרנה מורכבות. מכיוון שכל גם הוא זהה מבחינה גנטית וזרע באותו צפיפות מאותו המאגר הראשוני, יכול להיות מופץ משתנה בין הצלחת ומתוחזק על ידי הרובוט עם מאגרים זמינים מסחרי להפריד תנאים. זה יהיה שימושי עבור ניסויים כגון פיתוח צמיחת תאי גזע תקשורת 34,35,47, בדיקות מצע או מצב התרבות ומחקרי רעילות ניצול תאי גזע51. מאז כל שורת תאי גזע היא ייחודית במונחים של דרישות גודל מושבה והמעבר אופטימליות, ניתן להשתמש במערכת זו לווסת צפיפות זריעה, תדירות האכלה וטיפול מעבר על ידי מניפולציה של העמודות שנקטפו, התסיסה המכנית במהלך מעבר ותדירות ההאכלה. Iterating דרך המשתנים הללו יאפשר למשתמש למצוא במהירות סט של תנאים מתאימים לתרבות של קו חדש או לפתח טכניקות תרבות חדשות. מערכת רובוטית היא גם מסוגלת לשמור על 96 מושבות תאי גזע מקבילות אך עצמאיות. כאשר iPSC נגזרים מהתאים סומטיים או משובט לאחר מניפולציה גנטית, רבים שיבוטים מקבילים מוקרנים להניב קווי iPSC פוטנציאליים. ברגע שתאים בודדים הם זורעים לתוך 96-גם צלחות, מערכת זו יכולה להאכיל ומעבר 96-גם צלחות שמירה כל מושבה הפרדה. זה מאפשר תפוקה גבוהה מאוד בעת בחירת שיבוטים פוטנציאל ומבטל את הקושי בculturing הפיזי 96 קווים מקבילים. שיטה זו גםllows בקנה המידה גדול ייצור של כל שיבוט כך חומר שכבר זמין לניתוח מקביל. לבסוף, אנו רואים שילוב טכניקות אלה התרבות עם מערכת סחר צלחת רובוטית המספקת צלחות ומהחממה מאפשרת תרבות אוטומטית לחלוטין. זה יכול להיות מושלם עם יותר רובוטיקה המורכבת המאפשרת להרחבה גדולה יותר מאז הפרוטוקולים הבסיסיים שתוארו כאן הם להעברה למערכות אחרות המבוססות צלחת. השלבים הקריטיים הראשונים כדי לטפל בפרוטוקולים הם אלה המונעים ולבדוק לזיהום כגון צעדים 1.5 ו -4.2. זיהום, כפי שפורט לעיל, ניתן להימנע בהצלחה אם טכניקה סטרילית טובה ושכל ישר מנוצלים. זה הכרחי, ללא קשר לפורמט תרבות תאי גזע, שצק המפעיל לזיהום ועושה זאת בפרוטוקול זה בצעדים שצוינו יהיה להפחית באופן משמעותי את הסיכון לזיהום. יישום ג&#39;ל מטריקס הנכון הוא ESS שניצעד ential להצלחה הכוללת של פרוטוקול זה. ללא ציפוי כראוי 96-גם הצלחות, תאי הגזע לא יגדלו. בעיה נפוצה אחת היא ציפוי גם לא שלם. ניסיון הוכיח כי בועות אוויר, משיכה אלקטרוסטטית ופעולת נימים לעכב ציפוי גם מלא. הצעד מראש ההרטבה (1.6) פותח כדי לשפר את הציפוי גם תחתון באופן משמעותי ולא צריך לדלג עליו. צעד ההרטבה מראש זה מופיע כדי להפחית את הידרופוביות לכאורה של צלחת 96-היטב פלסטיק כך שכאשר ציפוי ג&#39;ל מטריקס מיושם הוא מופץ באופן שווה על פני גם תחתי ודפנות. מומלץ גם לטפוח בעדינות 96-גם הצלחות נגד יד נקייה מצופה פעם אחת כדי להבטיח הפצת פתרון ג&#39;ל מטריקס אפילו תאית. הפרמטרים הניתוק הם גם חשובים כדי לייעל. דגירה ממושכת עם אנזים או מגיב ניתוק מבוסס EDTA תגרום תאים בודדים שיכולה או לא יכולה להיות המטרה במעבר. לכן, המפעילצריך להקדיש תשומת לב מיוחדת לאופן שזמן ניתוק, כוח טחינה דקה, וחזר שוב ושוב לשטוף להשפיע מורפולוגיה מושבה ובריאות ולהתאים בהתאם. הבנת המגבלות לטכניקות המתוארות כאן הן בעל חשיבות עליונה לפעולה מוצלחת. כמו בכל הגדרת תרבות תאים אחרת, השימוש בלוחות 96-גם מהווה סיכון לזיהום גבוה יחסית. כפי שתואר לעיל, טכנאי הוא טיפול בכל צלחת במהלך ההאכלה וpassaging; לדוגמא, בעת פתיחת המכסה, לשים את הצלחת על מיטת הרובוט, ולבדוק את הצלחת על המיקרוסקופ. לכן, כאמור, לאחר שלב 1.5, זה הכרחי שלא לגעת בחלק הפנימי של כל מכסה צלחת או לחשוף את החלק הזה לכל משטח מזוהם כמו בלוקים המשופעים חימום או סיכות אנכיות על המיטה. במהלך פיתוח פרוטוקול מגבלה זו התגלתה והייתה המניע לפיתוח מתלה להחזיק מכסים בצלחת כדי לשמור על סטריליות. כמו כן, מאגרי השוקת, טיפים pipet וoאספקת יס על מיטת רובוט טיפול הנוזלית הן מקורות פוטנציאליים לזיהום, כי הם פתוחים לסביבה ומטופלים על ידי הטכנאי. לכן, טכניקה סטרילית טובה צריכה להיות מיושמת כמו צמצום תנועות על פני חומרי תרבות חשופים או נוזלים פתוחים. מגבלה נוספת היא שכאשר הפרוטוקול בקנה מידה גדול, מבחינה ויזואלית בודק כל גם של&gt; 100 96-גם צלחות היא מסורבל. זה יכול להיות מטופלים על ידי חזותי בודק את כל הצלחת לסימנים של זיהום, כגון תקשורת עכורה, לזהות בארות חשודות. לקנה מידה עד עתיד, שימוש במיקרוסקופ ומחוון של צמיחת תאים וזיהום פוטנציאלי אוטומטיים ישולב. לסיכום, 96-גם הפלטפורמה מבוססת התפוקה גבוהה שתוארה כאן מציעה שיטה לשחזור, איכות גבוהה לתרבות תאי גזע והפקה בפורמט צלחת. שיטה זו מקטינה את הניסיון הנדרש, זמן דרוש ועבודת ציוד הייעודי לגזע תוך תרבית תאיםשמירה על היתרונות של תרבות חסיד מסורתית.

השימוש בתאים אנושיים הנגרם pluripotent גזע (iPSCs) גדל באופן משמעותי מאז גזירתם בשינה 2007 1 לבדיקת מתחם, רפואת רגנרטיבית ומודלים מחלה 2-6. דרישה זו מגיעה מהיכולת של iPSC להניב מספר גדול של תאי pluripotent שיכול להיות מובחן לתוך תאים סומטיים בכמות שאין כמותו. טכניקות בידול מכוונים לשפר 7-10 ופיתוח של תאים אנושיים או דוגמנות רקמה וטיפול בתאים מגביר 11-14, כך גם הדרישה לייצור המוני של iPSCs באיכות גבוהה. הוא ציטט נרחב שבין מחלות אחרות, אוטם שריר לב או החלפה פונקציונלית ב-תא ידרוש מאות מיליון למליארד iPSC נגזר תאים סומטיים 15-18. דוגמנות רקמת 3D יתר על כן, מורכבת יותר ויותר לגילוי תרופות ולאherapy ידרוש מספר גדול של תאים 9,13,19. בכל דוגמאות הללו, מוגדרים, אחידים וiPSCs לשחזור חייב להיות זמין ופשוט כדי לייצר. על מנת לייצר גזע biopharmaceutics תא נגזר ותאים להנדסה והשתלת רקמות, טכנולוגיית תא-ייצור חסכוני היא חיונית. ייצור בקנה מידה של iPSCs התמקד בתרבות השעיה 20 - 25 או השעיה עם השימוש במצעי microcarrier 26-28 גם בגלל טכניקות אלה פרוסות בהצלחה בקנה מידה גדולה שאינו iPSC ייצור מבוסס,, האיקריוטים. מספר קבוצות הפגינו מערכות תרבות השעיה שתנבנה תאי גזע pluripotent 20,21,23,24,29. עם זאת, גישות אלה לנצל מערכות יקרות ומורכבות לא זמינות לחוקרים לפתח תוכניות בידול רומן, נהיגה הנדסת רקמות ועושה Laboratמחקר בקנה מידה אורי. יתר על כן, תרבויות iPSC השעיה וmicrocarrier דורשות הסתגלות וטכניקות או כימיקלים לא מצאו בתרבות iPSC חסיד מסורתית כגון שימוש רצוף של מעכבי Rho-קינאז, סוכני antifoaming וסינון להסדיר צבירה. לחץ פיזי לתאים שכיח יותר בתרבות השעיה, שהוצג על ידי תסיסה מכאנית, כמו גם במהלך התנגשות microcarrier. נושאים אלה מגבילים את יכולת החיזוי והמהירות שבה נוצר זה עתה נובע יכול להיות מתורבת שורות תאים בתרחיף. אחרים פיתחו מערכות טיפול צלחת רובוטית המחקות טכניקות תרבות צלחת 30,31 אבל פלטפורמות אלה דורשים השקעות משמעותיות לציוד ומומחיות לפעול בנוסף לאתגרים הבסיסיים הקשורים לתרבות תאי גזע. העבודה הבאה מתארת ​​את הפיתוח ותרגול של מערכת תרבות iPSC מדרגי שמנצל נוזל עצמאי, סטנדרטי ערוץ 8-רובוטיתצלחות מטפל ו96-היטב. שיטה זו נועדה לגשר בקנה מידה המעבדה תרבות iPSC וייצור iPSC בנפח גבוה (למשל, 10 7-1.5 x 10 9 תאים לכל שבוע לטכנאי) המאפשרים פיתוח טכנולוגיות אלה iPSC חדשים בקנה מידה בקלות את הייצור ללא השקעות בחומרה או בעבודה גדולה. שיטה זו היא זולה יחסית להגדיר, דורשת לא מעט ניסיון תרבות תאי גזע, תכנות או הנדסה, יש לו טביעת ציוד קטנה ללא הצורך במכסת מנוע תרבית תאים ייעודי, ומשתמשת בציוד תרבית תאים סטנדרטי כדי לאפשר בינוני עד גבוהה תפוקה האוטומטית ייצור תאים. המטרה הייתה לפתח מערכת מסוגלת תרבות תאי גזע להרחבה שיכולה להיות מנוצלת על ידי מעבדות חדשות לבלום תרבית תאים, אלה שימצאו במדריך טיפוח מחסום לפיתוח הרעיונות שלהם או אלה שרוצים אמצעי חסכוני לייצר מספר גדול של תאי גזע. הפלטפורמה שהוצגה כאן מסירה השפעת טכנאי בגזע תרבות תא ומנרמל את נהלי האכלה ומעבר כדי לאפשר ייצור תאי גזע עולה בקנה אחד.

<table><tbody><tr><td>96-well plates</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>96-well; Well volume: 360&amp;nbsp;&amp;#956;l; Cell growth area: 0.32&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;; Individually wrapped</td></tr><tr><td>Seahorse Trough</td><td>SeahorseBio</td><td>201308-100</td><td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td></tr><tr><td>Gilson Tips</td><td>Gilson</td><td>F167023</td><td>10 racks gilson 96 tips D200 tips</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12500062</td><td>DMEM/F12 powder.&amp;nbsp; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td></tr><tr><td>Growth Factor Reduced Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Referred to as, &quot;extracellular matrix gel&quot; in the text. Matrigel GFR, 10&amp;nbsp;ml</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5857</td><td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td></tr><tr><td>E8 Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>AdooQ BioScience</td><td>A11001-50</td><td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>ACCUTASE</td><td>Referred to as, &quot;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&quot; in the text. Accutase 500&amp;nbsp;ml sterile cell solution</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH30256FS</td><td>PBS w/o Ca Mg 500&amp;nbsp;ml, 6/pk</td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAX</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAX</td><td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td></tr></tbody></table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

קידום המשיך בתרבית תאי גזע pluripotent סוגר את הפער בין הספסל והמיטה לשימוש בתאים אלה ברפואת רגנרטיבית, גילוי תרופות ובדיקות בטיחות. על מנת לייצר גזע biopharmaceutics תא נגזר ותאים להנדסה והשתלת רקמות, טכנולוגיית תא-ייצור חסכוני היא חיונית. תחזוקה של pluripotency וביצועים יציבים של תאים ביישומים במורד הזרם (לדוגמא, התמיינות תאים) לאורך הזמן היא בעל חשיבות עליונה לייצור תאים בקנה מידה גדול. עם זאת, זה יכול להיות קשה להשגה במיוחד אם הם תאים בתרבית באופן ידני שבו המפעיל יכול להציג את ההשתנות משמעותית, כמו גם להיות יקר בקנה המידה-עד. כדי לאפשר תפוקה גבוהה, ייצור תאי גזע בקנה מידה גדולה ולהסיר פרוטוקולי תרבות תאי גזע רומן השפעת המפעיל באמצעות ספסל העליון רב-ערוצי נוזל טיפול רובוט פותחו הדורשים מעורבות טכנאי מינימאלית או ניסיון. עםתאים אלה אנושי פרוטוקולים מושרה גזע pluripotent (iPSCs) היו בתרבית בתנאים ללא מזין ישירות ממניות קפוא ונשמרו ב96-גם צלחות. בהתאם לשורת תאים ושיעור בהיקף של עד רצויה, המפעיל יכול בקלות לקבוע מתי מעבר מבוסס על סדרה של תמונות המראות את צפיפות המושבה האופטימלית לפיצול. אז ריאגנטים הצורך מוכנים לבצע פיצול מושבה לצלחות חדשות בלי צעד צנטריפוגה. אחרי 20 קטעים (~ 3 חודשים), שני קווי iPSC נשמרו karyotypes היציב, הביעו סמנים של תאי גזע, ומובחנים לשריר לב עם יעילות גבוהה. המערכת יכולה לבצע הקרנת תפוקה גבוהה הבאה של פרוטוקולים חדשים בידול או מניפולציה גנטית נועדו ל96-גם צלחות. טכנולוגיה זו תפחית את נטל העבודה וטכני לייצר מספר גדול של תאי גזע זהים למספר עצום של יישומים.

Watch this Scientific Journal Video about Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System at JoVE.com

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

פלייט מדרגי 96-גם בהתבסס iPSC תרבות וייצור באמצעות מערכת רובוטית טיפול נוזל

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

scalable-96-well-plate-based-ipsc-culture-production-using-robotic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

31.5K Views.  InvivoSciences, Inc.. The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes. 

Video: Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetics

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

ייצור של מספר הגדול של spheroids גידול מבוקר גודל באמצעות צלחות microwell

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Bioengineering

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

הכנס גדול הסביבה הגנום ספריית הפקה

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Biology

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטית מושרית באמצעות מערכת תרבית אוטומטית

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Author Spotlight: אוטומציה של תרבות iPSC לשיפור יכולת השחזור 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.

פלייט מדרגי 96-גם בהתבסס iPSC תרבות וייצור באמצעות מערכת רובוטית טיפול נוזל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

ייצור של מספר הגדול של spheroids גידול מבוקר גודל באמצעות צלחות microwell

הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

הכנס גדול הסביבה הגנום ספריית הפקה

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

שיטת עבור מהירות גבוהה מתיחה פציעתו של האדם המושרה נוירונים נגזר תאי גזע Pluripotent בתבנית 96-ובכן