We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex's Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children's Cancer Foundation.

הערה: כל מחקרי דג הזברה ותחזוקה של בעלי החיים נעשו בקנה אחד עם הפרוטוקול שאושר על-# IACUC Mayo Clinic מכון A41213. 1. בונת DNA לTransgenesis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר אזור אמרגן hydroxylase בטא דופמין 5.2-kb (ד βh) 8 באמצעות שיבוט CH211-270H11 BAC (ממרכז משאבי BACPAC (BPRC)) כתבנית ה- DNA. השתמש מתאים PCR מערכת הגברה PCR ארוכה ומדויקת של תבניות DNA ארוכות ותוכניות מחזור הבאות לPCR: 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 10 מחזורים של (94 ° C, 15 שניות, 50 ° C, 30 שניות, 68 ° C, 8 דקות), ואחריו 30 מחזורים של (94 ° C, 15 שניות, 53 ° C, 30 שניות, 68 ° C, 8 דקות), 68 ° C, 4 דקות (פריימר קדימה 5&#39;-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 &quot; ופריימר ההפוכה 5&#39;- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 &quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור ד βh -pDONRP4-P1R CLO הכניסהne 8 באמצעות מערכת שיבוט רקומביננטי מסחרית כגון שער multisite. לערבב 1 μl של מוצר dβh המטוהר PCR (172 ng / μl), μl 1 (150 ng / μl) וקטור תורם pDONRP4-P1R (יחד עם וקטורי שער אחרים הם מתנות נדיבות מד&quot;ר צ&#39;י-סל Chien, Univ. יוטה) , 4 μl של TE חיץ (pH 8.0) עם 2 μl של תערובת אנזים clonase BP, דגירה עבור שעה 1 של 25 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להפוך לאחת Shot TOP10 E. המוסמך coli על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור ד βh: מהונדס EGFP-MYCN לבנות 8 מערכת שיבוט רקומביננטי באמצעות הוזכרה בשלב 1.2. לערבב 1 μl של כל שיבוט כניסה (150 ng / μl) כולל 5.2-kb אמרגן dβh (מבנה dβh -pDONR P4-P1R), EGFP חסר קודון עצירה (מבנה PME-EGFP), ואדם MYCN cDNA (מתנה נדיבה מד&quot;ר Hogarty בבית החולים לילדים של פנסילבניה, MYCN-pDONRP2R-מבנה P3), μl 1 (150 ng / μl) של וקטור היעד שונה המכיל אתרי I-SCEI הכרה (מתנה נדיבה מד&quot;ר ג Grabher, המכון הטכנולוגי של קרלסרוהה, קרלסרוהה, גרמניה), 4 μl של חיץ TE ( pH 8.0) עם 2 μl של תערובת אנזים LR Clonase, דגירה עבור שעה 1 של 25 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להפוך לE. כימי המוסמך ירייה עליונה coli כגון אחת 10 ועיקבו אחרי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך mitf: מהונדס mitf לבנות 8 על ידי לעכל את וקטור PNP-mitf עם אנזימי הגבלת NotI וסאלי עבור 2 שעות על RT, ועל ידי subcloning 2.65-kb שוחרר (מתנה נדיבה מד&quot;ר ד Raible, Univ של וושינגטון.) קטע DNA המכיל את אמרגן mitf ורצף הקידוד של גן mitf דג הזברה לאתרי NotI וMluI של וקטור pBluescript שונה המכיל אתרי הכרת I-SCEI איגוף (מתנה נדיבה מד&quot;ר הואי Feng, אוניברסיטת בוסטון), תוך שימוש באנזים T4 DNA על פי הפרוטוקול של היצרן. הערה: כדי להגביר את היעילות של יצירת קווי MYCN -expressing יציבים, ד βh: נגזרים צלחת בונה DNA mitf הם coinjected לעוברי צדף שלב אחד תא הצדף מייעד סוג של דגים מוטנטים החסרים עצבית: EGFP-MYCN וmitf. melanophore במהלך פיתוח 36. כך, את המראה של תאי הפיגמנט בעוברים המוזרקים מציע שילוב של mitf: DNA mitf בונה לגנום. הוכח כי שתיים או שלושה מבני DNA coinjected ניתן cointegrated לתוך הגנום הדגים 31. לפיכך, פיגמנטציה נגרמת על ידי ביטוי mitf יכולה לשמש כסמן לאינטגרציה של dβh: transgene EGFP-MYCN ולזיהוי קל יותר של קו מהונדס יציב MYCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את βh ד: EGFP-MYCN וmitf: DNA mitfמבנים ביחס 3: 1 בנפח כולל של תגובת 15 μl עם 1 μl של אנזים I-SCEI ו0.75 μl של חיץ. ודא שהסכום הכולל של ה- DNA בתגובה אינו עולה על 750 ng. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את עיכול I-SCEI ב RT במשך 4 שעות או O / N. ביום השני, I-SceI- מתעכל DNAs מוכן לmicroinjection או ניתן לאחסן ב -20 ° C להזרקה בעתיד. אחסן את אנזים I-SCEI ב -80 מעלות צלזיוס aliquots הקטן כדי לשמור על יעילות אנזימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subclone ALKF1174L האנושי וגן ALK wild-type מוקטור PCDNA3 (מתנה נדיבה מד&quot;ר ג&#39;ורג &#39;בדנו-פרבר מכון הסרטן) 7 לאתרי EcoRI וNotI של וקטור pENTRY1A (מתנה נדיבה מד&quot;ר ג Grabher, המכון הטכנולוגי של קרלסרוהה, קרלסרוהה, גרמניה) באמצעות האנזים DNA T4 על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור βh ד: ALKF1174L &lt;/ Em&gt; או dβh: מבנים מהונדסים ALKWT באמצעות מערכת רקומביננטי כאמור בפרוטוקול 1.2. בקצרה, לשלב שלושה שיבוטים כניסה, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (או ALKWT -pENTRY1A) וp3E-פולה, לתוך וקטור היעד שונה המכיל אתרי הכרה I-SCEI (מתנה נדיבה מד&quot;ר ג Grabher, קרלסרוהה מכון טכנולוגי, קרלסרוהה, גרמניה), באמצעות LR Clonase אנזים Mix, על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ד βh: ALKF1174L (או dβh: ALKWT) וdβh: mCherry הבונה DNA ביחס 3: 1 וlinearize עם אנזים I-SCEI כמתואר בפרוטוקול 1.5-1.6. </li></ol> 2. Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש micropipettes זכוכית עם 1.0 מ&quot;מ קוטר לכל הזריקות 37. לשבור את הקצה של micropipettes הזכוכית עם סכין גילוח לפני ההזרקה. לכייל על ידי להזריק נפח ההזרקהing H 2 O לטיפה של שמן מינרלים. מדוד את הקוטר של טיפות וכתוצאה מכך ולהתאים את microinjector (לחץ או משך דופק לחץ) כדי להבטיח שאת עוצמת הזריקה היא פחות מ -10% מכלל נפח התא של עוברי תא בשלב אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.5 μl נוסף של אנזים I-SCEI הטרי (5 יחידה / μl) ב 5 μl של פתרון הזרקה המכיל DNA בונה ממש לפני ההזרקה כדי להגביר את היעילות של transgenesis 38. הזרק 50-80 pg של מבני ה- DNA לינארית לתוך הציטופלסמה של עוברי שלב אחד תא. על מנת להבטיח את ההצלחה של הזרקה, לערבב את המדגם עם 0.25% פנול אדומים לשם ויזואליזציה. אם תאים הופכים לאדומים לאחר הזרקה, זה מצביע על microinjection הוא מוצלח. כדי להבטיח את שיעור הצלחה גבוה ליצירת דג מהונדס, אנחנו בדרך כלל להזריק רבים כמו 500 עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור דג מהונדס ביציבות להביע MYCN, coinject βh ד ינארית: EGFP-MYCN וmitf: בונה DNA mitf (ביחס 3: 1) לעוברי של דג הזברה צדף המוטציה פיגמנטציה בשלב אחד התא. הביטוי של Mitf משמש ככתב בשילוב של מבנים מהונדסים בגנום הדגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לביטוי יתר פסיפס של ALK בwild-type או עובר מהונדס MYCN, שיתוף להזריק βh ד ינארית: ALK F1174L (או dβh: ALKWT) עם dβh: mCherry בונה DNA (ביחס 3: 1) לאחד התאים עוברים כתוצאה מגידול של F1 הטרוזיגוטיים Tg (dβh: EGFP-MYCN) דג מהונדס עם דגי AB wild-type. כך, מחצית מצאצאים הן מהונדסים לMCYN וחצי הם wild-type. </li></ol> 3. מסך לדגים יציבים או פסיפס מהונדס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגביר את היעילות של זיהוי קווי MYCN -expressing יציבים, להרדים עוברי צדף הזריקו בעיקר עם tricaine (0.02%)ימי t 3-5 של postfertilization ומסך לפיגמנטציה. העבר את העוברים עם פיגמנטציה לצלחת פטרי חדשה עם מים ביצה טריים ולהעלות אותם לבגרות מינית להקרנה נוספת לדגי המייסד, אשר נושאים את ד βh: transgene EGFP-MYCN בתאי הנבט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות את המייסד עם שידור בתאי מין של EGFP-MYCN, דגים בוגרים F0 פיגמנט outcross עם wild-type דגי AB ומסך לעוברי EGFP חיובי ב1-2 ימים לאחר הפריה לgenotyping נוסף. הנח עובר F1 EGFP החיובי יחיד לתוך צינור PCR ולהסיר את כל הנוזלים. הוסף 50 μl של חיץ חילוץ gDNA המכיל 12.5 μl של חיץ תמוגה 4x, 35 H 2 O וμl 2.5 μl proteinase K (10 מ&quot;ג / מיליליטר) לעובר יחיד. דגירה התגובה במשך 2-3 שעות על 55 מעלות צלזיוס, ואחריו 10 דקות של דגירה על 98ºC כדי להשבית proteinase K. כדי להפוך 50 מיליליטר של חיץ תמוגה 4x, להוסיף 500 μl של 1M טריס (pH 8.4), 2.5 מיליליטר של 1M t KClo 47 מיליליטר של H 2 O. הערה: לאחר דג מהונדס יציב F0 MYCN הם התרבו עם דגי AB wild-type, כל הצאצאים הם פיגמנט. לפיכך, פיגמנטציה אינה יכולה לשמש כסמן לזיהוי הדגים החיוביים MYCN-. בעוד שבדג המהונדס MYCN, חלבון היתוך EGFP-MYCN בא לידי ביטוי בPSNS, כולל נוירונים האוהד של גרעיני צוואר רחם מעולים וגנגליון המגזרי רציף של השרשרת הסימפתטית ואינו PSNS נוירונים דופאמין, כגון הלשד המוארך ו גרעיני גולגולת 8. לפיכך, הביטוי של EGFP יכול לשמש כסמן לזיהוי עובר המהונדס היציב MYCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 2 μl של gDNA חולץ מן עובר F1 פיגמנט כתבנית, פריימרים MYCN -test F1: 5&#39;-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 &#39;; MYCN -R3: 5&#39;-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 , ושנינות התכנית הבאות &quot;h GC-RICH מערכת PCR: מחזור 1 של 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. אנחנו בדרך כלל גנוטיפ 14-16 עוברים פיגמנט מהזדווגות אחת כדי לאשר את קיומו של transgene MYCN המשולב בעוברי פיגמנט, יותר מ -6 דגי מייסד ביתר MYCN mitf וזוהו על ידי שיטה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגייס את שארית עוברי F1 EGFP החיובי. קליפ הסנפיר וגנוטיפ בחודש 2-3 של גיל באמצעות הפרוטוקול לעיל כדי לאשר את האינטגרציה של transgene MYCN לדגים נוספים. גזע F1 MYCN דג מהונדס יציב עם דגי AB wild-type. Co-להזריק βh לינארית ד: ALK F1174L (או dβh: ALKWT) עם dβh: mCherry הבונה DNA לעוברים אחד התאים כמתואר בפרוטוקול 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין MYCN -expressing עוברים בניסוי מתואר בפרוטוקול 2.4 באמצעות פלואוריד סטריאוסקופיתמיקרוסקופ escence ולהקרין את העוברים מוזרקים בעיקר בימים 1-3 בpostfertilization לביטוי EGFP-MYCN בPSNS. ואז, בימים 2-5 בpostfertilization, להרדים את העוברים עם tricaine (0.02%) ולמיין את העוברים חיוביים או שליליים MYCN- אלה שוב מבוססים על הביטוי של mCherry בPSNS באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופית. הביטוי של mCherry משמש כסמן לCoexpression של ALK ברקמות של בעלי החיים עיקרי פסיפס המוזרק. הערה: ~ 600 צאצאים כתוצאה מהרבייה של דגים מהונדסים יציבים MYCN עם דגי wild-type הוזרקו לכל קבוצה עם בונה DNA לינארית, כולל βh ד: ALK F1174L וdβh: mCherry, dβh: ALKWT וdβh: mCherry, או dβh : MCherry לבד, בהתאמה. ביטוי פסיפס של mCherry ניתן לצפות ב70-90% מהדגים שהוחדרו בעיקר. מחצית לחדשלישי של הדגים המוזרקים שרד דרך שלב הזחלים לשעון גידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את כל mCherry + MYCN + וmCherry + MYCN - עוברים על פי הפרוטוקולים סטנדרטיים מהספר דג הזברה 39 ולפקח על תחילת גידול מתחיל בpostfertilization 5 שבועות. </li></ol> 4. גידול צפה בפסיפס מהונדס דגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג דגים מוזרקים בעיקר חיוביים mCherry- כל 2 שבועות החל משעת postfertilization 5 שבועות לראיות של הופעת גידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי דגים עם tricaine (0.02%) ומסך לנוכחות של mCherry - וEGFP -expressing גידולים בPSNS תחת SMZ-1500 מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופית Nikon מצויד במראה מצלמה דיגיטלי DS-U1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר את הגידולים מביעים את גן ALK, לבודד את mCherry- והמוני EGFP החיובי עבור genotyping ALK PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות PCR, להגביר הדנ&quot;א הגנומימופק מגידולים שפותחו עם פריימרים הבאים: ALK P7: 5&#39;-AGG-3 GC &#39;וALK P18: GC-3 CTT CAG GCT GAT GTT 5&#39;-TGT&#39; המרכז לאמנות עכשווית GGT GTC CGG AAT: מחזור 1 ותגובת PCR הבאה של 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורים של (94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות). לאחר מכן, רצף מוצר PCR עם פריימר P7 ALK כדי לאשר נוסף לקיומה של מוטציה או ALK wild-type בגידולי mCherry-החיוביים. </li></ol>

<ol>
	<li>Tenesa, A., Dunlop, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+aetiology+of+colorectal+cancer+from+genome-wide+association+studies.">New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies.</a> Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).</li><li>Maher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+takes+centre+stage+in+cancer+profiling.">Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling.</a> Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).</li><li>Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+cancer+genomes+through+second-generation+sequencing.">Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing.</a> Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).</li><li>Chung, C. C., Chanock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+genome-wide+association+studies+in+cancer.">Current status of genome-wide association studies in cancer.</a> Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).</li><li>Mosse, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ALK+as+a+major+familial+neuroblastoma+predisposition+gene.">Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene.</a> Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).</li><li>Janoueix-Lerosey, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+and+germline+activating+mutations+of+the+ALK+kinase+receptor+in+neuroblastoma.">Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).</li><li>George, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+ALK+provide+a+therapeutic+target+in+neuroblastoma.">Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ALK+Collaborates+with+MYCN+in+Neuroblastoma+Pathogenesis.">Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li><li>White, R., Rose, K., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+cancer:+the+state+of+the+art+and+the+path+forward.">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward.</a> Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).</li><li>Amatruda, J. F., Patton, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+cancer+in+zebrafish.">Genetic models of cancer in zebrafish.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).</li><li>Konantz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+tool+for+in+vivo+studies+on+human+cancer.">Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).</li><li>Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+hallmarks+of+cancer+in+living+mice.">Imaging hallmarks of cancer in living mice.</a> Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).</li><li>Kettleborough, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+analysis+of+zebrafish+protein-coding+gene+function.">A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function.</a> Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myc-induced+T+cell+leukemia+in+transgenic+zebrafish.">Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish.</a> Science. 299 (5608), 887-890 (2003).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-lymphoblastic+lymphoma+cells+express+high+levels+of+BCL2,+S1P1,+and+ICAM1,+leading+to+a+blockade+of+tumor+cell+intravasation.">T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation.</a> Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).</li><li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma.">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).</li><li>Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+penetrant+melanoma+in+a+zebrafish+model+is+independent+of+ErbB3b+signaling.">Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).</li><li>Leacock, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+transgenic+model+of+Ewing's+sarcoma+reveals+conserved+mediators+of+EWS-FLI1+tumorigenesis.">A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).</li><li>Le, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock-inducible+Cre/Lox+approaches+to+induce+diverse+types+of+tumors+and+hyperplasia+in+transgenic+zebrafish.">Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+RAS+on+the+genesis+of+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Genes &amp; development. 21 (11), 1382-1395 (2007).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KRAS+induces+progenitor+cell+expansion+and+malignant+transformation+in+zebrafish+exocrine+pancreas.">Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas.</a> Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).</li><li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xmrk,+kras+and+myc+transgenic+zebrafish+liver+cancer+models+share+molecular+signatures+with+subsets+of+human+hepatocellular+carcinoma.">Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma.</a> PLoS One. 9 (3), e91179 (2014).</li><li>Forrester, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9-transgenic+zebrafish+develop+a+myeloproliferative+neoplasm+and+provide+new+insight+into+mechanisms+of+myeloid+leukaemogenesis.">NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis.</a> British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).</li><li>Alghisi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+oncogene+expression+to+endothelial+cells+induces+proliferation+of+the+myelo-erythroid+lineage+by+repressing+the+Notch+pathway.">Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway.</a> Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).</li><li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+zebrafish.">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+responses+to+exogenous+DNA+in+mammalian+cells+and+its+effect+on+oligonucleotide-directed+gene+modification.">Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification.</a> Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).</li><li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+mutations+of+ALK+kinase+in+neuroblastoma.">Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).</li><li>Pugh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+high-risk+neuroblastoma.">The genetic landscape of high-risk neuroblastoma.</a> Nature genetics. , (2013).</li><li>Berry, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ALK(F1174L)+mutation+potentiates+the+oncogenic+activity+of+MYCN+in+neuroblastoma.">The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma.</a> Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).</li><li>Heukamp, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+expression+of+mutated+ALK+induces+neuroblastoma+in+transgenic+mice.">Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice.</a> Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191 (2012).</li><li>Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nacre+encodes+a+zebrafish+microphthalmia-related+protein+that+regulates+neural-crest-derived+pigment+cell+fate.">nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate.</a> Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+Tol2+transposable+element+from+a+single-copy+donor+in+zebrafish.">Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).</li><li>Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+bridges+in+vertebrate+gastrulation.">Intercellular bridges in vertebrate gastrulation.</a> PLoS One. 6 (5), e20230 (2011).</li><li>Ivics, Z., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+universe+of+transposon+technologies+for+gene+and+cell+engineering.">The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering.</a> Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+patterns+of+somatic+mutations+in+cancer.">Emerging patterns of somatic mutations in cancer.</a> Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

במחקר נציג זה, השתמשנו coinjection וCoexpression של ALK מופעל חולפים עם גן כתב mCherry בMYCN -expressing דג מהונדס כדי להראות שהגנים הללו ישתפו פעולה על מנת להאיץ את תחילתה של נוירובלסטומה, עולה בקנה אחד עם הממצא הקודם שלנו בcoexpressing דגי התרכובת יציב מהונדס במידה ניכרת שני הופעל ALK ...

סרטן הם מחלות מתקדמות המסומנות על ידי ההצטברות של מוטציות פתולוגיים, מחיקות ורווחי כרומוזום לאורך זמן. מומים גנטיים אלה יכולים להשפיע על תהליכים תאיים רבים, החל ממחזור התא, המוות של תאים, חילוף החומרים וההרכבה האנרגטיים של שלד התא להדגיש תגובות כגון היפוקסיה. לפיכך, יצירת גידולים משקפים את הפעולות הקולקטיביות של סטיות גנטיות מרובות על פני ספקטרום של תהליכים ביולוגיים. מאמצים האחרונים אינטגרטיבית הגנומי מחקר, כוללים רצף הגנום כולו, רצף exome, רצף ממוקד, רצף עמוק ומחקרי עמותת הגנום, זיהו מספר גדל והולך של שינויים גנטיים רומן במהותו את כל סוגי הגידולים 1-4. במקרים רבים, הנגעים הגנטיים מתרחשים ביחד באופן לא-אקראי 5-8, המצביעים על שיתוף הפעולה שלהם בפתוגנזה של מחלה. לנתח את התפקידים שבעור של המגוון הרחב של גנים הביעו aberrantly כתוצאה fROM נגעים הגנומי אלה יש צורך לתכנן אסטרטגיות טיפוליות חדשות ולהבין את התגובות של תאים סרטניים לסוכנים אלה, אבל זה הוכיח את עצמו להיות משימה מרתיעה, הדורש מערכות מודל חיה מאוד חזקות להתנהלות של אנליזה גנומית פונקציונלית תפוקה גבוהה ב vivo. למרות יונקים, במיוחד מכרסמים, דגמים מועדפים בביולוגיה של סרטן, דג הזברה החלה למשוך תשומת לב רבה. דג הזברה החוליות (דריו rerio) נעשה שימוש כאורגניזם מודל למחקר פיתוח מאז 1960 ויושמה לראשונה לחקר פתוגנזה גידול בשינה 1982 9-11. קלות תחזוקה, גודל גוף קטן, ופוריות גבוהה להפוך את דג הזברה מודל חזק למסכים גנטיים קדימה בקנה מידה גדולה כדי לזהות מוטציות המעניקות פנוטיפים חריגים ופתולוגיים 10. השקיפות האופטית של עוברי דג הזברה היא תכונת מפתח נוספת התומכות בשימוש רחב יותר של מודל סרטן זה, כהיא מאפשרת בתחום ההדמיה vivo להתנהל כדי לאתר התפתחות גידולים בזמן אמת 9, יישום שהוא קשה יחסית במכרסמים 12. ניתוח גנומיקה השוואתית האחרון של הגנום התייחסות דג הזברה (Zv9) חשף 26206 גני המקודדים חלבונים, עם 71% שיש orthologues אדם, מתוכם 82% מתואמים עם גנים הקשורים למחלות בירושת מנדל באינטרנט בMan (OMIM) מסד הנתונים 13, 14. לוקמיה T-cell החריף לימפובלסטית (T-ALL) 15,16, מלנומה 17,18,, קרצינומה של לבלב כתוצאה מכך, דג הזברה כבר משמשת מודל סוגים שונים של סרטן, כגון: נוירובלסטומה 8, סרקומה ע&quot;ש יואינג 19, 20,21 ראדומיוסרקומה 22, קרצינומה hepatocellular 23 ומיאלואידית ממאירות 24,25, ונבחרו כמודל לסרטן השתלה שלא מבן-מינית חוקר 11,26. מהונדס יציבגישה בדג הזברה משמשת בדרך כלל כדי לחקור את ההשפעה של רווח של פונקציה של גנים בהתפתחות נורמלית או היווצרות המחלה 27,28. לפתח מודל (איור 1 א) כאמור, אחד מזריק מבנה ה- DNA המכיל את הגן של עניין מונע על ידי אמרגן רקמות ספציפיות לעוברי פרא-סוג אחד תאים. שלושה עד ארבעה חודשים לאחר ההזרקה, כאשר עובר המוזרקים מגיע לבגרות מינית, הם outcrossed עם דגי wild-type למסך לאלה המראים שילוב של DNA לבנות בתאי המין שלהם, שרישיונותיהם כדגי מייסד. גורמים רבים, כגון מספר העותק ואתר אינטגרציה של transgene, משפיעים על ביטוי של transgene בקווים מהונדסים יציבים. לכן, כדי לפתח מודל גידול מהונדס, קווים מהונדסים יציבים מרובים ביתר אונקוגן יחיד צריכים להיות שנוצרו ראשון והוקרנו לקו מבטא את הגן ברמה שעלולה להוביל לגידול אינדוקציה. עם זאת, אם ביטוי יתר של o מועמדncogene הוא רעיל לתאי נבט, קשה ליצור קו מהונדס יציב על ידי ישירות ביתר transgene 29. לפיכך, גישה זו יכולה להיות זמן רב, עם סיכון גבוה לכישלון כדי ליצור מודל סרטן מתאים. כאן, אנו ממחישים אסטרטגיה חלופית המבוססת על transgenesis החולף הפסיפס (איור 1) המספקת יתרונות ייחודיים על פני transgenesis היציב המסורתי למחקר גנומי פונקציונלי in vivo. בגישה זו, בונה transgene אחד או יותר הם שהוחדרו לתוך השלב אחד התא של עוברים מהונדסים או wild-type. בונה DNA המוזרקת מכילה transgenes אז הם משולבים mosaically ואקראי לדגים המוזרקים העיקריים, וכתוצאה מכך מעורבים גנוטיפים בתוך אוכלוסיות תאים מרובות בדגים בודדים 30. יתר על כן, coinjection של DNA מרובה בונה בעוברי תא אחד מוביל לשיתוף השתלבות באותו התא באתרים אקראיים, המאפשר אחד כדי TRAהספירה התאים עם ביטוי של גנים מושתלים ולחקור את יחסי הגומלין של גנים שונים בהיווצרות מחלה בבעלי החיים הפסיפס 31. כהוכחה לעיקרון, אנחנו זמניים ביטוי יתר ALK מופעל mutationally (F1174L) עם גן כתב mCherry במערכת העצבים הסימפתטית ההיקפית (PSNS) תחת שליטה של hydroxylase בטא דופמין (βh ד) האמרגן בדגי פרא-סוג ודג מהונדס ביתר MYCN. ALK, אשר מקודד טירוזין קינאז קולט, הוא הגן שעבר מוטציה הנפוצות ביותר בנוירובלסטומה בסיכון גבוה 5-7,32,33. ALK (F1174L), כאחד מהמוטציות סומטיות הפעלה התכופות והחזקות ביותר, הוא ייצוג-יתר ב MYCN- מוגבר חולי נוירובלסטומה בסיכון גבוה וsynergizes עם ביטוי יתר MYCN להאיץ יצירת גידולי נוירובלסטומה בשני עכברים הטרנסגניים יציבים ודגמי דג הזברה מהונדסים 8,34,35. על ידי פסיפסביטוי יתר חולף של ALK (F1174L) עם mCherry בדג המהונדס MYCN, אנחנו סכמנו האצת תחילת גידול שנצפתה בדגים מהונדסים יציבים ביתר שני ALK (F1174L) וMYCN, המצביע על כך את אסטרטגית transgenesis פסיפס יכולה לשמש למהירות וביעילות להעריך את התרומה היחסית של אונקוגנים רבים בייזום גידול in vivo.

<table><tbody><tr><td>Expand Long Template PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>pCR-TOPO vector&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, CA</td><td>451641</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II enzyme&lt;br/&gt; Mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&amp;reg; BP Clonase&amp;reg; II enzyme mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>GC-RICH PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>12 140 306 001</td><td></td></tr><tr><td>Meganuclease I-SceI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>R0694S</td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon digital sight DS-U1 camera</td><td>Nikon, NY</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

לבדוק האם ביטוי יתר של F1174L ALK מופעל mutationally או ALK wild-type יכול לשתף פעולה עם MYCN באינדוקצית נוירובלסטומה, אנו ביטוי יתר או ALK אדם מופעל או ALK אדם wild-type תחת שליטה של אמרגן βh ד בPSNS של דג מהונדס ביתר MYCN. אחד מהמבנים הבאים, dβh - ALKF1174L או <em...

Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis at JoVE.com

פסיפס טרנסגנזה של דג זברה לניתוח גנומי פונקציונלי של גנים שיתופיים מועמדים בפתוגנזה של גידולים | ביולוגיה התפתחותית | וִידֵאוֹ

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

פסיפס דג הזברה Transgenesis לניתוח הגנום פונקציונלי של גנים שיתופיים מועמד בפתוגנזה גידול

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

mosaic-zebrafish-transgenesis-for-functional-genomic-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Genetics

Classical and Modern Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

11.1K Views.  Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine. The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Video: Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

השתלת דג הזברה גידולים מוחיים במוח לתוך מארחים המוסמכת החיסונית עבור מחקר לטווח ארוך של התנהגות תאים סרטניים והתגובה לסמים

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Cancer Research

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

הקרנה למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Medicine

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

דור של זברה דג זחל קסנוגרפטים וניתוח התנהגות הגידול

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

מודל דגי זברה של גרורות נוירובלסטומה

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Gene Expression גלובל ניתוח באמצעות פלטפורמה דג הזברה microarray oligonucleotide

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have been developed that permit engraftment of normal and malignant cells into irradiated, syngeneic, and immune compromised adult zebrafish. These models when coupled with optimized cell transplantation protocols allow for the rapid assessment of stem cell function, regeneration following injury, and cancer. Here, we present a method for cell transplantation of zebrafish adult skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), a pediatric sarcoma that shares features with embryonic muscle, into immune compromised adult rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. Importantly, these animals lack T cells and have reduced B cell function, facilitating engraftment of a wide range of tissues from unrelated donor animals. Our optimized protocols show that fluorescently labeled muscle cell preparations from &#945;-actin-RFP transgenic zebrafish engraft robustly when implanted into the dorsal musculature of rag2 homozygous mutant fish. We also demonstrate engraftment of fluorescent-transgenic ERMS where fluorescence is confined to cells based on differentiation status. Specifically, ERMS were created in AB-strain myf5-GFP; mylpfa-mCherry double transgenic animals and tumors injected into the peritoneum of adult immune compromised fish. The utility of these protocols extends to engraftment of a wide range of normal and malignant donor cells that can be implanted into dorsal musculature or peritoneum of adult zebrafish.

Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.

השתלת תאי שריר נורמלית וממאירים לחיסון חלש למבוגרים דג הזברה

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

Immunology and Infection

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non coding sequences. One prominent function carried out by the non coding fraction of the genome is to regulate gene transcription; however, there are no effective methods to broadly predict cis-regulatory elements from primary DNA sequence. We have developed an efficient protocol to functionally evaluate potential cis-regulatory elements through zebrafish transgenesis. Our approach offers significant advantages over cell-culture based techniques for developmentally important genes, since it provides information on spatial and temporal gene regulation. Conversely, it is faster and less expensive than similar experiments in transgenic mice, and we routinely apply it to sequences isolated from the human genome. Here we demonstrate our approach to selecting elements for testing based on sequence conservation and our protocol for cloning sequences and microinjecting them into zebrafish embryos.

We demonstrate our approach to finding potential enhancer elements from developmentally regulated genes and evaluating their function through mosaic zebrafish transgenesis.

דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

שימוש בדגי זברה זחלים למחקרים יעילים בגידולי Vivo

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

מחבר זרקור: קידום טיפולים בסרטן באמצעות השתלת קסנו-גידול בדגי זברה

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

שיטה פשוטה, מהירה ויעילה לניתוח השתלת גידול בעוברים שקופים של דגי זברה

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

פסיפס דג הזברה Transgenesis לניתוח הגנום פונקציונלי של גנים שיתופיים מועמד בפתוגנזה גידול

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

השתלת דג הזברה גידולים מוחיים במוח לתוך מארחים המוסמכת החיסונית עבור מחקר לטווח ארוך של התנהגות תאים סרטניים והתגובה לסמים

הקרנה למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה

דור של זברה דג זחל קסנוגרפטים וניתוח התנהגות הגידול

מודל דגי זברה של גרורות נוירובלסטומה

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Gene Expression גלובל ניתוח באמצעות פלטפורמה דג הזברה microarray oligonucleotide

השתלת תאי שריר נורמלית וממאירים לחיסון חלש למבוגרים דג הזברה

דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer

שיטה פשוטה, מהירה ויעילה לניתוח השתלת גידול בעוברים שקופים של דגי זברה

שיטה פשוטה, מהירה ויעילה לניתוח השתלת גידול בעוברים שקופים של דגי זברה