מימון: עבודה זו נתמכה על ידי מענק הקרן Bertarelli (Djl), מענק MED-EL (Djl), ומכון לאומי לבריאות מענקי DC01089 (MCB).

הערה: כל הליכי הניסוי מבוצעים בהתאם לועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש בעיני מסצ&#39;וסטס ומרפאת אוזן ובית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד, שפועל לפי הנחיות טיפול בבעלי החיים לאומיות, ובכלל זה לבריאות ציבור שירות מדיניות על הומניות טיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה, ILAR מדריך, ובעלי חי חוק צער. הפרוצדורות מפורטות להלן פירוט חשיפה של DCN השמאל. השתמש בכלים סטריליים בעת ביצוע ניתוח הישרדות. 1. היסודי Craniotomy וחשיפה הגבי שבלול Nucleus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר, בגילי 8-12 שבועות, במשקל 18-24 גרם, עם 20 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine וקטמין 100 מ&quot;ג / קילוגרם באמצעות ממשל intraperitoneal. אשר הרדמה תקינה על ידי קצב ניטור לב, קצב נשימה, כמו גם רפלקס נסיגת קמצוץ הבוהן. משחה וטרינר מקום על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. ברגע כראוי בהרדמה, לא מעל שיער גילוחהוא הקרקפת כדי לספק גישה ללא הפרעה לאתר כירורגית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר באופן מאובטח בבעל החיים קטן stereotaxic, שנערך במקום על ידי מהדק חוטם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שמהדקים החוטם הוא רופף מספיק כדי לאפשר לנשימה נאותה אבל חזק מספיק כדי לשתק את הראש של העכבר לחלוטין. אם ראש העכבר הוא רופף, בעל החיים עלולים ליפול מבעל הראש במהלך חלק craniotomy של הליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אלקטרודות שתל גזע המוח שמיעתיות באופנה סטנדרטית, המאפשרת לניטור קצב לב. קצב נשימה צריך להיות במעקב על ידי הדמיה. שים לב שקצב לב נורמלי וקצב נשימה משתנים בהתאם לגילו של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדחום ממוקם וeuthermia מובטח באמצעות מיקום על שמיכת חימום homeothermic. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך בעור וחשיפה של עצמות interparietal והעורפיות של הגולגולת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת microscאופ, לעשות חתך אנכי דרך העור מתחיל בקו האמצע, ישירות בין האפרכסת, והארכת לחלק הזנב של העורף. בעקבות חתך בעור קו האמצע, לעקור את העור רוחבי. דמיינו את השרירים המכסים את עזב את החלק האחורי של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שריר שמעל השמאל הקודקודית, interparietal, ועצמות עורפיות של הגולגולת על ידי disarticulation של קבצים מצורפים שרירים לעצמות שלהם עם מספריים או אזמל איריס. שים לב במידה קטנה של דימום לאורך קצות שרירים לחתוך. למזער את זה על ידי לחץ עדין עם המוליך כותנה שקצה במשך 10-15 שניות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמעליה craniotomy השבלול Nucleus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות קווי תפר רלוונטיים, כולל קווי תפרים sagittal ולמבדה (איור 1, שמאל לוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש rongeurs, להפוך את פתיחת גולגולת על עצם interparietal, השמאלית של קו האמצע, ~ הזנב 2 מ&quot;מ לקו התפר למבדה. אזור זה overlies DCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Followincraniotomy g, להתבונן בשכבה דקה של דורה שoverlies המוח הקטן. באמצעות סכין אזמל, להסיר את הדורה. (איור 1, פנל באמצע). הערה: הסרת הדורה עלולה לגרום למידה קטנה של דימום. תהליך זה של שימוש בלהב סכין המנתחים כדי להסיר את הדורה נועד להפחית את כמות איבוד דם במהלך שאיפת המוח הקטן, שברכה על פני השטח של גזע המוח וזיהוי אלמוני של DCN. סה&quot;כ נפח דם של עכבר הוא ~ 1.5 מיליליטר לא יעלה&gt; מ -15%. אם הדימום עולה על סכום זה, העכבר צריך להיות מסופק עם עם תוספת נוזלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דם קרוש כיסה את המוח הקטן עם המוליך קצה כותנה. לחלופין, בעדינות לטפטף מי מלח באמצעות נקודת שיניים על המוח הקטן כדי לנקות דם משם דם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח הקטן שאיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 5 יניקה צרפתית, לשאוב את החלק לרוחב-ביותר של המוח הקטן השמאלי מעל DCN עד DCN הוא מולרע&quot;מ (איור 1, ימין לוח). הסר כ 1/4 עד 1/3 של המוח הקטן משמאל. ציון דרך העיקרי בסמוך לDCN הוא ampulla של התעלה חצי עגולה מעולה. הערה: שאיפה של המוח הקטן היא צעד מפתח לפרוטוקול. שאיפת בימוי של המוח הקטן מתבצעת ביותר בהצלחה אם היא מתרחשת בניסיון בודד ולא עם מעברים מרובים של היניקה כמו זה יגרום לדימום. כדי לסייע בשאיפה, להגדיר את מישור המוקד של המיקרוסקופ בעומק הצפוי של CN, שיהיה מעט דיסטלי אל פני השטח של המוח הקטן. הגדרת מישור המוקד לCN תשפר הדמיה ולהבטיח תמונה חדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאיפה הבאה, דימום נוסף, נוזל השדרתי (CSF) הצטברות, ועקירת המוח הקטן על DCN צפויים. להחדיר 0.5 סמ&quot;ק של תמיסת מלח סטרילית במהירות לפתיחת הגולגולת כדי למנוע קרישת דם. שילוב של ספיגה עדינה עם נקודה ויניקת שיניים יכול להיות אזנהג לסלק דרך להדמיה ישירה של DCN. ישירות לא לפנות אל פני השטח של DCN. </li></ol></li></ol> Microinjection לחץ 2. להעברת גנים בתיווך וירוס ושחזור כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר DCN הוא חופשי של דם וCSF שמעליה ונראים בבירור, להפוך microinjections לחץ לDCN באמצעות מזרק המילטון 10 μl על פני תקופה 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את המחט עם micromanipulator עד הקצה הוא כבר לא נראה לעין מתחת לפני השטח של DCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת ביצועים מיטביים, השתמש במחט 33 או 34 מד (להשתמש במזרק gastight עם מחט 34 מד) עם שיפוע רדוד, כגון 45 מעלות, כדי למזער את הטראומה קהה ולמקם את עוצמת הזריקה בתוך DCN, שהוא דק ו מבנה גזע המוח רדוד (&lt;300 מיקרומטר עבה). הערה: מכשירי microinjection אחרים עשויים להיות מבוססים מנוצלים. באופן אידיאלי, מכשיר ההזרקה צריך להיות גמיש כדי לאפשר לכמה בן קלד, נחוץ אם לפנות ישירות לקהל DCN. יתר על כן, כפי שהעכבר זז מעט לאורך כל ההליך בשל נשימה, המכשיר צריך להיות חזק מספיק כדי לעמוד בכמויות קטנות של תנועה. </li></ol> שחזור כירורגי 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד ההזרקה הבאה, מחדש משוערת העור ולאפשר העכבר כדי להתאושש להליך התאוששות סטנדרטי. רקמת המוח הקטן וצלקת שנותרה למלא את החלל שנגרם על ידי שאיפה של המוח הקטן. כל הזמן לפקח על בעלי חיים עד תודעה מספיק הוא חזר כדי לשמור על כיבה sternal. לעקוב אחר קצב לב, קצב נשימה, כמו גם יכולת להאכיל. הערה: אין חיה שעברה ניתוח חזר לכלוב עם בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עכבר מתחיל ללכת במעגלים לאחר ניתוח (&lt;5% מהמקרים), בדרך כלל 2-4 שעות לאחר סגירת החתך בעור, להקריב מייד העכבר, כפי שהוא עלול להביא להאכלת תקופה קשה. Tתופעת הלוואי שלו היא כנראה עקב שאיפה של המוח הקטן. בעלי החיים צריכים להיות במעקב לכאב לאחר הניתוח, ויש לתת סמים מתאימים כדי להבטיח נוחות בעלי חיים המבוססים על תקנים מוסדיים. אנטיביוטיקה עשויה להיות נחוצה, אם עדות לזיהום. </li></ol> 4. חשיפה Craniotomy והשבלול Nucleus משנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2-4 שבועות של ריפוי ודגירת העברת גני וירוס בתיווך, מחדש להרדים זמן דגירה אופטימלית הזריק בעבר צעד עכבר וחזור על 1.1-1.5 משתנה בהתאם לסוג של גן הועבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של רקמת צלקת על אתר craniotomy על ידי שילוב של פינצטה, אזמל, וrongeurs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לדמיין את פתיחת הגולגולת, לזהות שילוב של רקמת המוח הקטן ונותר צלקת מעל DCN. השתמש 5 יניקה צרפתית כדי לשאוב המוח הקטן שמעליה / רקמת צלקת (בדומה לשאיפת המוח הקטן הקודמת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות שאיפה, מצפה דימום נוסף, ב CSFuild-אפ, וחתיכות הנותרות של המוח הקטן. במהירות להציג מלוח לפתיחת הגולגולת כדי למנוע קרישת דם. השתמש בשילוב של ספיגה עדינה שיניים נקודה ויניקה כדי לנקות את הנתיב להדמיה ישירה של DCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב פני השטח של DCN. לבצע ניסויי פיזיולוגיה מבוסס optogenetics כDCN נגיש כעת. להציג את גירוי אור, למשל עם סיב אופטי (איור 2), לנהוג ניסוי מבוסס optogenetics. </li></ol> 5. היסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מסקנה של ניסויים, להרדים את העכבר עם מנת יתר של קטמין. Perfuse העכבר עם מלח רגיל ואחריו paraformaldehyde 4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את גזע המוח מהגולגולת ופוסט-התיקון לשעה 2. Cryoprotect גזע המוח בסוכרוז 30% במשך 24-48 שעות. סעיף גזע המוח באמצעות cryostat סטנדרטי באמצעות 60 מיקרומטר חלקים. </li></ol>

<ol>
	<li>Lalwani, A., Mhatre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+gene+therapy.">Cochlear gene therapy.</a> Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).</li><li>Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+issues+in+cochlear+gene+transfer.">Current issues in cochlear gene transfer.</a> Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).</li><li>Jero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+gene+delivery+through+an+intact+round+window+membrane+in+mouse.">Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).</li><li>Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+microinjection+and+its+effects+upon+auditory+function+in+the+guinea+pig.">Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig.</a> Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).</li><li>Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+in+vivo+gene+therapy+for+hearing+disorders:+introduction+of+adeno-associated+virus+into+the+cochlea+of+the+guinea+pig.">Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig.</a> Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).</li><li>Wareing, M., Lalwani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+gene+therapy:+current+perspectives.">Cochlear gene therapy: current perspectives.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 (49), 27-30 (1999).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene+expression+in+the+guinea+pig+cochlea+mediated+by+a+lentivirus-derived+gene+transfer+vector.">Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector.</a> Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).</li><li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy.">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).</li><li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway.">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li><li>Adamantidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+interrogation+of+dopaminergic+modulation+of+the+multiple+phases+of+reward-seeking+behavior.">Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior.</a> J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+mimicry+of+the+transient+activation+of+dopamine+neurons+by+natural+reward+is+sufficient+for+operant+reinforcement.">Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement.</a> PloS One. 7 (4), e33612 (2012).</li><li>Britt, J., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+interrogations+of+the+neural+circuits+underlying+addiction.">Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).</li><li>Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+c1+and+retrotrapezoid+nucleus+neurons+causes+sleep+state-dependent+cardiorespiratory+stimulation+and+arousal+in+rats.">Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats.</a> Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).</li><li>Carter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+arousal+with+optogenetic+modulation+of+locus+coeruleus+neurons.">Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).</li><li>Darrow, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+central+auditory+neurons.">Optogenetic control of central auditory neurons.</a> Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).</li><li>Shimano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+AAV-mediated+expression+of+channelrhodopsin-2+and+halorhodopsin+in+brainstem+neurons+mediating+auditory+signaling.">Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling.</a> Brain Res. 1511, 138-152 (2013).</li><li>Doucet, J., Ryugo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+the+ventral+cochlear+nucleus+to+the+dorsal+cochlear+nucleus+in+rats.">Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats.</a> J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).</li><li>Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commissural+axons+of+the+mouse+cochlear+nucleus.">Commissural axons of the mouse cochlear nucleus.</a> J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).</li><li>Verma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+responses+to+electric+and+infrared+neural+stimulation+of+the+rat+cochlear+nucleus.">Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus.</a> Hear Res. 310, 69-75 (2014).</li><li>Taberner, A. M., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+properties+of+single+auditory+nerve+fibers+in+the+mouse.">Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse.</a> J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).</li><li>Rolls, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+disruption+of+sleep+continuity+impairs+memory+consolidation.">Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).</li><li>Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttraining+optogenetic+manipulations+of+basolateral+amygdala+activity+modulate+consolidation+of+inhibitory+avoidance+memory+in+rats.">Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats.</a> Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).</li><li>Stortkuhl, K., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Smell+of+Blue+Light:+A+New+Approach+toward+Understanding+an+Olfactory+Neuronal+Network.">The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network.</a> Front Neurosci. 5 (72), (2011).</li><li>Hira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+optogenetic+stimulation+for+functional+mapping+of+the+motor+cortex.">Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex.</a> J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).</li><li>Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+light-based+mapping+of+motor+cortex+by+photoactivation+of+channelrhodopsin-2+transgenic+mice.">Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).</li><li>Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

מאמר זה מתאר את הטכניקה של הדמיה הישירה של DCN במודל העכברי למניפולציה של מערכת השמיעה המרכזית. הגישה המתוארת של הדמיה ישירה מספקת יתרונות משמעותיים על פני החלופה המרכזית, שהם גישות stereotaxic. בעיקר, להדמיה ישירה של DCN מאפשרת לאישור מיידי של האתר של גזע המוח, ואילו גישות ster...

Virus-mediated gene transfer to reverse hearing loss has largely been focused on the peripheral auditory system.1 Targeting the cochlea, investigators have examined a host of delivery routes, including osmotic minipump infusion2, vector-transgene complex-soaked Gelfoam&#174;2 or gelatin sponge3, direct microinjection4; numerous gene transfer vectors, including adeno-associated viral vectors5,6, lentiviral vectors7, and cationic liposomes2; and the dissemination of gene transfer vectors beyond the target tissue2. Most recently, adeno-associated virus (AAV)-1 has been introduced in the cochlea in order to treat deafness in mice due to loss of vesicular glutamate transporter-3.8 Further, the application of optogenetics in peripheral auditory system has recently been described.9
Few studies, however, have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem contain second order neurons of the auditory pathway. While gene transfer techniques in the cochlear nucleus (CN) may be utilized for a host of investigations, gene transfer of opsins, light-sensitive proteins, to the DCN may also be utilized to enable optogenetics-based experimental techniques. Following virus-mediated gene transfer delivery of an opsin, such as channelrhodopsin-2 (ChR2), the neurons of the DCN becomes sensitive to light stimuli. Optogenetic gene transfer has been previously attempted in several brainstem regions, including the rat retrotrapezoid nucleus, mouse locus coeruleus, monkey superior colliculus, and mouse ventral tegmental area.10-14
Recently, investigators have examined the use of optogenetics in the DCN.15,16 The DCN is the location of placement of auditory brainstem implants in humans, making it an attractive part of the auditory system to study for translational studies on auditory neuroprostheses. However, given the location of the DCN, surgical exposure is challenging. The technique described herein provides a protocol for maximal exposure of the DCN via posterior fossa approach to enable viral vector gene transfer and optogenetics-based experiments in a murine model. Previous studies used stereotactic microinjection into the DCN with channelrhodopsin-2.16 Stereotaxic injections, however, are potentially less accurate than injections made by direct visualization, especially in a nucleus as small and deep along the brainstem as the DCN. Transgenic mice expressing tissue specific proteins in the CN are also an attractive option and would obviate the need for gene transfer. Our protocol for exposure of the DCN would also work in transgenic mice as the DCN would need to be directly exposed for optical stimulation. This technique for surgical exposure of the DCN is adapted from previous protocols involving recordings from the auditory nerve and cochlear nucleus in mice and rat models.15,17-20
The overall goal of the protocol is to provide direct exposure to the CN to allow for gene transfer techniques. More specifically, the approach is compatible with both acute and survival surgery and the preparation can be repeated in the same animal for subsequent neurophysiological testing. The direct exposure of the DCN protocol has implications for optogenetics- and virus-mediated gene transfer-based experimentation in other nuclei of the brainstem.

<table><tbody><tr><td>Stereotaxic holder</td><td>Stoelting</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>Homeothermic blanket</td><td>Harvard</td><td>507214</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade #11</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissor</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>5 French suction</td><td>Symmetry Surgical</td><td>2777914</td><td></td></tr><tr><td>Dental Points</td><td>Henry Schein</td><td>100-8170</td><td></td></tr><tr><td>Bone rongeur</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>16020-14</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;l Hamilton syringe</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>34 gauge, needle</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td>207434</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr></tbody></table>

direct visualization of the murine dorsal cochlear nucleus for optogenetic stimulation of the auditory pathway

חקירת השימוש בהעברת גני וירוס בתיווך לעצור או להפוך אובדן השמיעה במידה רבה נדחקה למערכת השמיעה ההיקפית. מחקרים מעטים בחנו העברת גנים למערכת השמיעה המרכזית. גרעין גב השבלול (DCN) של גזע המוח, המכיל נוירונים מסדר שני של המסלול השמיעתי, הוא אתר פוטנציאל להעברת גנים. בפרוטוקול זה, טכניקה לחשיפה ישירה ומקסימלי של DCN העכברי באמצעות גישה הפוסות אחורי מודגמת. גישה זו מאפשרת לאף אחד מניתוח אקוטי או הישרדות. בעקבות הדמיה ישירה של DCN, מארח של ניסויים אפשריים, כולל הזרקה של opsins לתוך גרעין השבלול ולאחר מכן על ידי הגירוי של סיבים אופטיים מצמידים את אור לייזר כחול. ניסויי נוירופיזיולוגיה אחרים, כגון גירוי חשמלי והעתקי מזרק עצביים הם גם אפשריים. רמת visualization ואת משך הזמן של גירוי השגה להפוך גישה זו ישימה למגוון רחב של ניסויים.

חלקית המוח הקטן שאיפה מדגימה גישה לגרעין השבלול לאחר העור והשרירים שמעל הגולגולת יוסרו, ציוני דרך פני גולגולת, כגון קווי תפר העטרה ומדא, מדגים את הלוקליזציה המשוערת של פתיחת הגולגולת. בעקבות פתיחת גולגולת עם rongeurs, המוח הקטן ?...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway at JoVE.com

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

הדמיה ישירה של Murine הגבי שבלול Nucleus לoptogenetic גירוי של הנתיב השמיעתי

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

direct-visualization-murine-dorsal-cochlear-nucleus-for-optogenetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K Views.  Harvard Medical School. The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model. 

Video: Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) has been shown to be a useful approach to local drug delivery into the inner ear. The goal of this article is to describe, in detail, the surgical techniques involved in canalostomy in both adult and neonatal mice. As indicated by fast-green dye and adeno-associated virus serotype 8 with the green fluorescent protein gene, the canalostomy facilitated broad distribution of injected reagents in the cochlea and vestibular end-organs with minimal damage to hearing and vestibular function. The surgery was successfully implemented in both adult and neonatal mice; indeed, multiple surgeries could be performed if required. In conclusion, canalostomy is an effective and safe approach to drug delivery into the inner ears of adult and neonatal mice and may be used to treat human inner ear diseases in the future.

Here we describe canalostomy procedure which allows local drug delivery into the inner ears of adult and neonatal mice through the semicircular canal with minimum damage to hearing and vestibular function. This method can be used to inoculate viral vectors, pharmaceuticals, and small molecules into the mouse inner ear.

Canalostomy כמו הגישה כירורגי של משלוח סמים מקומי לתוך האוזן הפנימית של עכברים בוגרים ו Neonatal

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Genetics

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

Photostimulation לייזר לסריקת של מעגלים מוח קדמי ממוקדים Optogenetically

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Biology

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

מדריך ל<em&gt; בשנת vivo</em&gt; הקלטה חד-יחידה מקליפת המוח המעכבת interneurons המזוהות Optogenetically

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Medicine

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Wedge Brain Slices to Visualize Auditory Neurons

Source: Fischl, M. J. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/61664">In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates the process of preparing wedge-shaped brain slices in a laboratory setting. Using a vibratome, a wedge-shaped slice from a mouse&#39;s brain is crafted with varying thickness. This slice contains the auditory nerve root positioned on the thicker end, while the hearing-related neurons are located on the thinner end.

הכנת פרוסות טריז במוח כדי להמחיש נוירונים שמיעתיים

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Brain ...

הדמיה ישירה של Murine הגבי שבלול Nucleus לoptogenetic גירוי של הנתיב השמיעתי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video