רוב העבודה וכוח האדם המעורב נתמכו על ידי NIH מענק NS060677 ובחלקו על ידי מענקי NIH MH099559 וMH104069 (לBSK). חלק מהעבודה נתמכת גם על ידי קרן CHDI.

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים היו בהתאם למכוני בריאות הלאומי של ארה&quot;ב מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש ב- UCLA. 1.1) הכן טוען Micropipette וAAV2 / 5 וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש micropipettes זכוכית בורוסיליקט קנס על הזריקה של הנגיף. משוך את micropipette באמצעות תכנית מושכת בשני שלבים עם חולץ אנכי. פוע פיפטה בזווית של 40 מעלות על ידי שימוש במטחנת פיפטה. פיפטה כי הוא אידיאלי לשימוש תהיה בקוטר טיפ של 20 - 40 מיקרומטר ואורך שוק של 6 - 7 מ&quot;מ. החיטוי פיפטה ומכשירי ניתוח. התרגיל מעוקר על ידי מנגב עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הווירוס AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1.5 x 10 13 GC / ml), ב -80 מעלות צלזיוס ב 10 aliquots μl. רק לפני הניתוח, להוציא את aliquots מהמקפיא ולאחסן על קרח עד משמש למילוי הmicropipette דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את micropipette עם וירוס באמצעות משאבת מזרק. בחוזקה חבר קצה אחד של פיסת הצינור, דרך דחיסת צינורות בגודל מתאימה הולמת, למזרק זכוכית עם בוכנה מחוזקת. צרף micropipette autoclaved לקצה השני של פיסת הצינור דרך דחיסת מחט נשלף בגודל מתאים מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני טעינת וקטור ויראלי, להסיר בועות אוויר ממערכת השאיבה כולל צינורות, מזרק וmicropipette על ידי מילוי המערכת עם שמן מינרלים צבעוניים עם IV סודאן האדום (~ 1 מ&quot;ג / 50 מיליליטר) במזרק 1 מיליליטר עם מחט (27 G ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חתיכה נקייה של parafilm תחת זכוכית micropipette, ולוותר על 5 - 10 μl של וקטור ויראלי על parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למצוץ וקטור ויראלי על ידי הזזת הבוכנה של המזרק לאחור על 0.5 μl / דקה, ולסמן את הגבול בין הווקטור והשמן על פיפטה הזכוכית. </li></ol> 1.2) הרדמה, חיתוך שיער, HEAD קיבוע והכנה לCraniotomy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים עכבר (P49-63, C57BL / 6) לתוך התא מלא בN 2 O ו- O 2, וisoflurane 5%. להעריך את עומק ההרדמה על ידי אובדן של תנועה תכליתית ושיעור האטת נשימה (~ 60-90 / min). לגזור את שיער על הראש כאשר העכבר הוא הרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את העכבר במסגרת stereotaxic, עם הראש שלה מובטח בארים בוטים אוזן ואפה להציב לתוך מערכת הרדמה והנשמה. לשמור isoflurane הרציף של 2 - 3%. החל משחה דמעות מלאכותיות לשתי העיניים מאז עכברים לאבד רפלקס המצמוץ שלהם תחת הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהל 0.05 מיליליטר של עצירות (0.1 מ&quot;ג / מיליליטר) על ידי הזרקה תת עורית להקלה על כאב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזור נקי כירורגית עם 10% יוד povidone ושלוש פעמים אלכוהול 70%, לסירוגין בין שני הפתרונות ומתחיל עם יוד povidone. התחל מהחזית ולנגב לכיוון האחורי כדי להסיר את כל שערות כבר חתכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך בעור על o העליונהf הראש שמתחיל בין העיניים ומסתיים בין האוזניים. </li></ol> 1.3) Craniotomy וmicroinjections <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קרום העצם על ידי והעביר עם מקלון צמר גפן ולאחר מכן לייבש את פני השטח של הגולגולת עם כדורי צמר גפן שיניים. להטביע את חותמו סביב אתר ההזרקה, ולקדוח מסביב לקצה של הסימן באמצעות Burr פלדה קטן מופעל על ידי תרגיל במהירות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העצם ולנקות את השטח עם מי מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את פיפטה לתוך הגב עזב לרוחב סטריאטום עם הקואורדינטות הבאות (מ&quot;מ): 0.8 קדמי, אחורי, המדיאלי-צדדיות: 2.0, גב-הגחון מהשטח pial: -2.4 13. שים לב שהקואורדינטות אלה אומרת שקצה מחט microinjection יושב בדיוק מעל סטריאטום דורסולטרלי (איור 1 א, ב &#39;), מה שאומר שרק מעט חודר בתוך גרעין זה. הימנע מכלי דם מזיקים. אם פיפטה קורה להיות ממש על כלי דם, מעט להתאיםקואורדינטות על ידי ~ 0.1-0.2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הזרקה עם שיעור הזרקה נקבע על 0.2 μl / דקה, ובדרך כלל להזריק 1 עד 1.5 μl של וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את פיפטה במקום לאחר ההזרקה במשך 10 דקות, ולאחר מכן למשוך את פיפטה לאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיים על ידי סגירת פצע הניתוח עם תפר ניילון חיצוני תפר מתמשך. </li></ol> 1.4 שחזור) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את העכבר בכלוב נקי על כרית חימום למשך 24 שעות. אל תחזור עכבר שעבר ניתוח לחברתם של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש באופן מלא. אל תשאיר ללא השגחה העכבר עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור על שכיבה sternal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Trimethoprim Sulfamethoxiazole (5 מ&quot;ל לכל 500 מיליליטר מים, המכיל 40 trimethoprim מ&quot;ג ו -200 sulfamethoxiazole מ&quot;ג) במים במשך שבוע. לנהל עצירות שתי פעמים ביום לתקופה של עד 3 ימים לאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העכבר על מחזור אור-חושך 12 שעות, האכיל והשקה יומי,nd משוקלל פעם אחת ביום עד לעד 3 ימים לאחר ניתוח. ב 3 הימים האלה, כל עכבר להפסד של יותר מ -10% במשקל גוף נחשב כסכנה, ויהיה מורדמים במקום להיות נתון לניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד, לשנות את כלוב העכבר פעמיים בשבוע, ולפקח על בריאות כללית לפחות פעם ביום. בדרך כלל, העכבר משמש בתוך 2 - 3 שבועות לאחר microinjections stereotaxic. </li></ol> 2. חריף מוח Slice הכנת הדמיה 2 + Confocal Ca 2.1) עריכת חיתוך ופתרונות הקלטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיתוך פתרון כולל (מ&quot;מ): 194 סוכרוז, 30 NaCl, KCl 4.5, 10 D-גלוקוז, 1 MgCl 2, 1.2 לאא 2 PO 4, ו -26 NaHCO 3, רווי עם 95% O 2, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הקלטה הכולל (מ&quot;מ): 124 NaCl, KCl 4.5, 1 MgCl 2, 10 D-גלוקוז, 2 CaCl 2, 1.2 לאא 2 PO 4 </תת&gt;, ו -26 NaHCO 3; pH 7.3-7.4, 290-295 mOsm, רווי עם 95% O 2, 5% CO 2. כשמלא את כוס פרוסת המוח מחזיקה ביחד עם פתרון הקלטה, ולשמור אותו על 34 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2.2) חיתוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבועות עד שלושה שבועות לאחר microinjections stereotaxic, עמוק וסופנים להרדים את העכבר, ולאחר מכן לערוף אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את המוח, ולהשתמש בלהב כדי להסיר את האונה הימנית uninjected, והר נותר אחד על מגש vibratome באמצעות דבק סופר. מלא את מגש vibratome עם חיץ חיתוך קר כקרח, ולשמור להרוות אותו עם 95% O 2, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פרוסות מוח striatal העטרה או sagittal ב 300 עובי מיקרומטר. בדרך כלל, 4 - העטרה 5, או 6 - 7 פרוסות striatal sagittal ניתן לאסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הפרוסות לכוס מחזיקה פרוסה חיממה על 34 מעלות צלזיוס, ולשמור אותם שם למשך 30 דקות לפני אחסונם בטמפרטורת חדר למשך recordi הבאng. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את פרוסות המוח במאגר הקלטה מחומצן בטמפרטורת חדר למשך לפחות 30 דקות לפני ההדמיה i [Ca 2 +]. </li></ol> 3. אימונוהיסטוכימיה (IHC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבועיים לאחר הזרקת וירוס, תנקב את העכבר transcardially עם PBS ואחריו פורמלין 10% ב- PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר, לאחר לתקן לילה, וcryoprotect המוח בסוכרוז 30% שנאגרו במשך לפחות 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 40 מיקרומטר חלקים באמצעות microtome cryostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הסעיפים 3 פעמים עם PBS ב -10 מרווח דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפים עבור שעה 1 ב- PBS עם סרום עיזים 10% נורמלים ועם 0.5% Triton X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפי הלילה ב 4 ° C בנוגדן ראשוני שהוכן ב- PBS עם 0.5% Triton X-100. הנוגדנים העיקריים בשימוש היו כדלקמן: עוף אנטי GFP 1: 1,000, העכבר אנטי S100β 1: 400, עכבר אנטי NeuN 1: 600, synthetase אנטי-גלוטמין עכבר 1: 300. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את סעיפים 3 פעמים עם PBS על 10 מ &#39;במרווחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפים עם הנוגדנים משני שהוכנו ב- PBS עם 10% עזים בסרום נורמלי עבור שעה 2 בטמפרטורת חדר. הנוגדנים שני היו כדלקמן: עז אנטי עכבר Alexa546 1: 500, עז נגד עוף Alexa488 1: 500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את הסעיפים על שקופיות זכוכית, יבשות ולהחיל כמה טיפות של antifade הרכבה בינוני, ואז לכסות באיטיות את החלקים עם coverslip זכוכית. אחסן את השקופיות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות במיקרוסקופ confocal עם עדשת טבילת שמן 40X עם צמצם מספרי של 1.3. </li></ol> 4. Confocal הדמיה i [Ca 2 +] הערה: [Ca 2 +] i הדמיה נעשתה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם עדשה אובייקטיבית 40X טבילה במים עם צמצם מספרי של 0.8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין 1 ל 5 שעות לאחר חיתוך, פרוסה מקום בחדר ההקלטה וSuperfuse עם חיץ הקלטה מחומצן בטמפרטורת חדר עם קצב זרימה של 1 - 2 מ&quot;ל לדקות. ואז למקם את נבל פלטינה עם מיתרי ניילון על גבי הפרוסה כדי למזער את התנועה במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו ולאתר את סטריאטום הגב עם הארה שדה בהירה תחת מטרת טבילה במי 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לעדשה האובייקטיבית 40X טבילה במים, ולהפעיל את קו 488 ננומטר של לייזר ארגון. על ידי שינוי מישור המוקד, למצוא תאים הממוקמים כ -20 מיקרומטר מתחת לפני השטח הפרוסה, בו מוצגות הקרינה בסיסית בסומה, סניפים וbranchlets. שימו לב, תאים שנפגעו בדרך כלל להציג רמת הקרינה מעל הממוצע, אשר יש להימנע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצב &#39;סריקת מסגרת &quot;כדי להתחיל בסריקה. בדרך כלל, את עוצמת הלייזר המותאמת ל0.5-5% מהתפוקה המקסימלית די תמונה [Ca 2 +] i עם ציטומגלווירוס-GCaMP3. לניטור אני דינמיקה [Ca 2 +] בשטח של האסטרוציטים כל, &#39;סריקת המסגרת&#39; עם קצב סריקה של 1 שניות לכל מסגרת או מהיר יותר היא recommended, אבל זה צריך להיות החליט בהתאם לניסוי בשאלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, לתמונה [Ca 2 +] אני בתהליכים, להשתמש בהגדלה דיגיטלית של 2 - 3 פי לפקח 1 - 2 האסטרוציטים בכל שדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע מפיקסלים רוויים במהלך הקלטה, להשתמש במצב בדיקת &#39;חילו&#39; לPseudocolor התאים. תמיד להתחיל עם &quot;הקלטת פיילוט&quot; למשך כ -5 דקות, כדי לבדוק אם צבע אדום מופיע כאינדיקציה לרוויה. אם כך, להפחית את תפוקת לייזר הכח, או להקטין את PMT / רווח / קיזוז ערכים ולבצע הקלטת טייס אחרת על מנת לבחון את ערכי פיקסל הם בטווח בלתי רווי. בדרך כלל, בשילוב הפרמטרים המשמשים לastrocyte הדמיה [Ca 2 +] i בסטריאטום היא כדלקמן: פלט כוח לייזר 0.5-5% (10 mW), PMT 550-650 וולט, רווח 2.0 - 3.5x, ולקזז 0 - 5%. </li></ol>

<ol>
	<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromodulation+by+extracellular+ATP+and+P2X+receptors+in+the+CNS.">Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS.</a> Neuron. 76, 51-69 (2012).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li><li>Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+adenosine+and+A1+receptor+activity+contribute+to+sleep+loss-induced+deficits+in+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+in+mice.">Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice.</a> J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA1+channels+are+regulators+of+astrocyte+basal+calcium+levels+and+long-term+potentiation+via+constitutive+D-serine+release.">TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release.</a> J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).</li><li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains.">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+near+plasma+membrane+and+global+intracellular+calcium+dynamics+in+astrocytes.">Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes.</a> J Vis Exp. 26, (2009).</li><li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology:+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps.">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).</li><li>Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+investigating+astrocyte-to-neuron+communication.">New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li><li>Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+molecular+approaches+to+understanding+astrocyte+function+in+vivo.">Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo.</a> Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).</li><li>Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+astrocyte+activation+modulates+response+selectivity+of+visual+cortex+neurons+in+vivo.">Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo.</a> Nat Commun. 5, 3262 (2014).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).</li><li>Eid, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+glutamine+synthetase+in+the+human+epileptogenic+hippocampus:+possible+mechanism+for+raised+extracellular+glutamate+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Lancet. 363, 28-37 (2004).</li><li>Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+and+astrocytes--key+players+in+human+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).</li><li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington's+disease+model+mice.">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li><li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity:+an+underappreciated+topic+in+neurobiology.">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li><li>Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+transgene+expression+after+intrastriatal+pseudotyped+rAAV2/1,+rAAV2/2,+rAAV2/5,+and+rAAV2/8+transduction+in+the+rat.">Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat.</a> Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

השיטות שתוארו במסמך זה אפשרו לנו להביע את ציטומגלווירוס-GCaMP3 בהאסטרוציטים striatal in vivo להדמיה הבאה [Ca 2 +] i באתר. לשיטה זו יתרונות על פני שימוש במהונדס או עכברים לדפוק ב, כוללים ביטוי חזק של החלבון, המהירות ממוקדת וגמישות של יישום ניסיוני וספציפיות אנ?...

האסטרוציטים הם תאי גליה נמצאים בכל מקום ובשפע של המוח. היא מבוססת היטב כי האסטרוציטים לשמש תמיכה חיונית ותפקידים ההומיאוסטטית כוללים חציצה של K + ריכוז במרחב החוץ תאי, ספיגה של מוליכים עצביים כמו גם חומרים מזינים מתן. עם זאת, המחקרים אחרונים מראים שהם גם להציג אני אותות [Ca 2 +], אשר מתרחשים באופן ספונטני ועלו בפעילות עצבית 1. קיומו של astrocyte [Ca 2 +] איתות אני כבר חשב יותר ויותר כדי לעורר את התקשורת שלהם עם תאי עצב, ולפיכך, היה להתפרש כסוג של &quot;רגישות Ca 2 +&quot; בתוך האסטרוציטים. הנתונים הזמינים בשני העשורים האחרונים מצביעים על שתי הגדרות שבי האסטרוציטים ונוירונים רשאיות להתקשר, אולי באופן דו-כיווני. ראשית, האסטרוציטים מגיבים לעתים קרובות בעלייה ב[ Ca 2 +] i כאשר מופעלת על ידי נוירוטרנסמיטורים וneuromodulators שוחררה מתא העצב 2. שנית, [Ca 2 +] אני עולה בתוך האסטרוציטים לגרום לשחרור של מולקולות איתות מהאסטרוציטים שבתורו יכול להשפיע נוירונים וכלי דם. ראיות עולה כי מולקולות שוחררו מהאסטרוציטים להביא לשינויים בפונקציות של סינפסות, מעגלים וסופו של דבר התנהגות 3-5 באמצעות איתות astrocyte לנוירון. עם זאת, זה עדיין תחום מחקר המתפתח במהירות, וזה כבר טען שיש צורך בהבנה טובה יותר ומפורטת של astrocyte [Ca 2 +] i כדי לפתור חלק מאי הוודאות הנוכחי 6. בעבודה האחרונה, זה היה הראה כי טעינה בתפזורת של צבעי מחוון אורגניים Ca 2 + לתוך האסטרוציטים לא מצליחה לזהות באופן אמין [Ca 2 +] i אותות בתוך האסטרוציטים כל בתרבות ובאתרו 7-10. ממצאים אלה נדונו על ידינו ואחרים 6,11,12. Emerginתמונת g היא ש[ Ca 2 +] i אותות בתוך תהליכי astrocyte (למשל, ענפים וbranchlets), המהווים את האתרים העיקריים לאינטראקציות עם תאי עצב וכלי דם, כמעט שלא נחקר בפירוט. לאחרונה, השימוש באינדיקטורים מקודד גנטי סידן (GECIs) כגון GCaMP3 cytosolic, GCaMP5G וGCaMP6 וקרום פלזמה גרסאות קשורות (למשל, LCK-GCaMP3) התיר למחקר שלי אותות [Ca 2 +] בתאים קטנים של האסטרוציטים כזה רזים כמו תהליכים, ליד קרום הפלזמה ובתוך טריטוריות שלמות 7,8. עם זאת, יש לי GECIs חסרון אחד על פני צבעי מחוון אורגניים Ca 2 + וזה הדרישה לשיטות גנטיות כדי לספק את הגנים מקודדות באופן סלקטיבי לתאים כוכביים in vivo לתקופות של שבועות לGECIs להיות כראוי הביע. ביטוי in vivo מושגת בדרך כלל באמצעות עכברים מהונדסים, לדפוק בעכברים או באפליקצית משלוח מבוסס וירוסמקקים. במאמר יופיטר הנוכחי אנו מדווחים שיטות ונהלים מועסקים כדי לספק GECIs להאסטרוציטים striatal באמצעות adeno הקשורים וירוסים. אנו מתמקדים בציטומגלווירוס-GCaMP3 כדוגמא, אבל באותו ההליך בסיסי עובד עבור כל Geci אחר או כתב חלבון פלואורסצנטי מבוסס.

<table><tbody><tr><td>Syringe Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette grinder</td><td>Narishige</td><td>EG-40</td><td></td></tr><tr><td>pZac2.1 GfaABC&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;D.cyto-GCaMP3</td><td>Addgene</td><td>44331</td><td>a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>syringe needle</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>AAV2/5 virus</td><td>UPenn vector core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sudan red IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67386</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>CVS Pharmacy</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic instrument</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900LS</td><td></td></tr><tr><td>High Speed Rotary Micromotor Kit</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Krazy&amp;reg;Glue</td><td>KG925</td><td></td></tr><tr><td>Microslicer</td><td>Ted Pella</td><td>DTK-Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopes</td><td>Olympus</td><td>FV300 and FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>chicken anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-s100&amp;beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-glutamine synthetase</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse-Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-chicken-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

לביטוי ספציפי astrocyte של ציטומגלווירוס-GCaMP3 בסטריאטום, היינו וירוס adeno הקשורים (AAV) של סרוטיפ 5, ואמרגן D 1 GFAP GfaABC (איור 1 א), שהוכח בעבר לנהוג GCaMP3 חזק וגן הכתב ביטוי בהיפוקמפוס והאסטרוציטים בקליפת המוח 8,14. שבועיים לאחר microinjection הווירוס לסטריאטום העכבר, הע...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators at JoVE.com

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

ההדמיה תאית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בstriatal האסטרוציטים מעכברים בוגרים באמצעות אינדיקטורים סידן מבחינה גנטית מקודדים

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

imaging-intracellular-ca2-signals-striatal-astrocytes-from-adult-mice

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

14.7K Views.  University of California Los Angeles. The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ. 

Video: Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

סידן הדמיה תפקודית בפיתוח רשתות קליפתיים

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Biology

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-כמו האסטרוציטים מאתר באמצעות פרוטוקול AWESAM מהירה, פשוטה וזולה

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

דיסקציה של Ca מקומי2 + אותות בתאים בתרבית על ידי קרום, ממוקדות Ca2 + אינדיקטורים

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

הדמיה מיטוכונדריאלית Ca2 + ספיגה אסטרוציטים ונוירונים באמצעות אינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral (dorsal root ganglia) and central tissues (cortex, subventricular zone, organoid) that are dynamically studied in terms of calcium shifts. The model chosen to illustrate the results is the retina, a simple tissue with complex cellular interactions. Calcium is a universal messenger involved in most of the important cellular roles. We explain in a step-by-step protocol how retinal neuron-glial cells in culture can be prepared and evaluated, envisioning calcium shifts. In this model, we differentiate neurons from glia based on their selective response to KCl and ATP. Calcium permeable receptors and channels are selectively expressed in different compartments. To analyze calcium responses, we use ratiometric fluorescent dies such as Fura-2. This probe quantifies free Ca2+ concentration based on Ca2+-free and Ca2+-bound forms, presenting two different peaks, founded on the fluorescence intensity perceived on two wavelengths.

Cell calcium imaging is a versatile methodology to study dynamic signaling of individual cells, on mixed populations in culture or even on awakened animals, based on the expression of calcium-permeable channels/receptors that gives unique functional signatures.

הדמיה של שינויים במעגל נוירון-גליה בטכניקת הדמיית הסידן

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

ההדמיה תאית Ca

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video