Name: rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NIH המענק R00 CA160574 (SFB) ועל ידי מענק של תכנית רטגרס ביוטכנולוגיה ההדרכה (לSMM).

נוהל זה אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת רטגרס, אוניברסיטת ניו ג&#39;רזי המדינה. טופלו עכברים בהתאם למדריך NIH לטיפול והשימוש בחי מעבדה. מדענים צריכים להתייעץ ארגוני בעלי החיים הלאומיים ומוסדיים שלהם להנחיות שנקבעו ואושרו. לפני תחילת, להכין את הפתרונות מפורטים בטבלה 1. בידוד תא 1 B והפעלה להרדים עכבר באמצעות CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. מקם את העכבר כל כך בצד השמאל של הגוף הוא למעלה ולרסס את העכבר עם אתנול 70% עד הפרווה לחה. לנתח את הטחול ומניחים בצלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ עם חיץ לשטוף 2 מ&quot;ל. בזרימה למינרית, בעדינות לשבור את הטחול בצלחת תרבית רקמה באמצעות הקצה השטוח של מזרק 5 מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס רשת ניילון 70 מיקרומטר ל50צינור מ&quot;ל ולהעביר את דגימת הטחול ב2 מ&quot;ל חיץ לשטוף לרשת הניילון. בעדינות לשבש את הטחול ברשת באמצעות הקצה השטוח של המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הגב של המזרק וצלחת 35 מ&quot;מ עם 8 מ&quot;ל של חיץ לשטוף ולסנן דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק supernatant וresuspend גלולה ב 3 מ&quot;ל של חיץ תמוגה ACK. פיפטה למעלה ולמטה לזמן קצר לשבש גושים ודגירה של 5 דקות. הוסף 10 מ&quot;ל של חיץ לשטוף ו צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק supernatant ו resuspend את הכדור על ידי הקשה על החלק התחתון של הצינור ולאחר מכן על ידי pipetting ב 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף. הוסף 50 μl של מיקרו חרוזים אנטי CD43 MACS ולדגור על קרח למשך 30 דקות. הוסף 10 מ&quot;ל של חיץ לשטוף, מערבב בעדינות, וצנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. הוסף 10 מ&quot;ל של חיץ לשטוף, מערבב בעדינות, וצנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר אתMini-MACS טור על ידי הצבת עמודה על מגנט MACS. מקם צינור חרוטי 15 מ&quot;ל שכותרת מתחת לעמודה. הוסף 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף לעמודה ולאפשר לרוץ דרך צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant וגלול ב 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף. טען את המדגם בעמודה לאחר לשטוף החיץ יש להפעיל דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי המדגם לרוץ דרך העמודה, להוסיף למאגר לשטוף 1 מ&quot;ל לשטוף את העמודה. הוסף 7 מ&quot;ל של חיץ לשטוף ישירות למדגם שנאסף בצינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות hemocytometer. העבר את הנפח הנדרש של תאים דרושים ל5,000,000 תאים / היטב לתוך צינור 50 מ&quot;ל. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. בינוני תא B מוסף עם 1 LPS: 500 וIL4 1: 1,000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולהוסיף הנפח המתאים של מדיום תא B בתוספת הדרושה לריכוז סופי של 1,000,000 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים ב6 צלחות גם עם 5 מ&quot;ל של תאים ב1,000,000 תא / מ&quot;ל ​​והמקום בhumidifiתרבית תאי חממת ed על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> קיבוע תא .2 B <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של colcemid לC גם מכיל 5 מ&quot;ל של תאי B (לריכוז סופי של 100 ng / ml) ו דגירה שעה 1 ב37 מעלות. 75 פתרון מ&quot;מ KCl Prewarm באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. העבר את תאי B לצינור 15 מ&quot;ל שכותרת. כסה את התווית עם קלטת ו צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant עוזב 1 מ&quot;ל בצינור וresuspend גלולה ידי pipetting. הוסף 5 מ&quot;ל של ירידת KCl prewarmed על ידי ירידה בזמן הקשה או פועם במערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של KCl ומערבבים על ידי היפוך. דגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הוסף 5 טיפות של מקבע ותערובת טריות על ידי היפוך. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. לשאוב supernatant עוזב 1 מ&quot;ל בצינור וresuspend גלולה ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של טיפה מקבע טרי על ידי ירידה בזמן הקשה או פועם בvorטקס. הוספה נוסף 10 מ&quot;ל של מקבע ודגירת 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. לשאוב supernatant עוזב 1 מ&quot;ל בצינור וגלול על ידי pipetting. הוספת 14 מ&quot;ל של מקבע ו צנטריפוגות הטריים XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.7 עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 14 מ&quot;ל של מקבע טרי. חותם את הכובעים עם Parafilm ולאחסן לילה בשעה -20 מעלות צלזיוס. </li></ol> .3 הכנת ממרחי כרומוזום Metaphase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר תא סביבתי מוסדר ל22.9 ° C ו52% לחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה קבועה תאי B XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. לשאוב מקבע עוזב 70 μl בצינור והגלול על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות שכותרתו בתא לחות בזווית 35 °. זרוק 35 μl של תאי B resuspended לשקופית ושחרר שתי שקופיות לדגימה. אפשר השקופיות לייבוש בתא לחות למשך 30 דקות לאחר מכן לאחסן את השקופיותבתיבת שקופיות על 37 C °. </li></ol> FISH .4 הטלומרים הרשות הפלסטינית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Probe <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוראמיד deionized טרום חם ל37 מעלות צלזיוס. לערבב 2 μl של בדיקה הרשות הפלסטינית הטלומרים עם פוראמיד מראש חימם 7 μl deionized ולדגור על 37 ° C עם רעד במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת אב FISH טרום חמה ל37 מעלות צלזיוס. להוסיף 7 μl תערובת אב FISH מראש חיממה לתערובת משלב 4.1.1 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל תערובת הבדיקה במשך 8 דקות על 80 מעלות צלזיוס. טרום לחשל את החללית לשעה 1 ב37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול מקדים של שקופיות כרומוזום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם צנצנת שקופית מכתימה זכוכית המכילה 50 מ&quot;ל של 0.01 M HCl ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות מקום בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית שונה המכילה 2x SSC למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של מניית פפסין לצנצנת שקופית המכתימה הזכוכית מחוממת מראש ומערבבים על ידי היפוך. העברת שקופיות sl זכוכית זהצנצנת ide-מכתים ודגירה 90 שניות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות 2x בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית שונה המכילה 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד בטמפרטורת חדר, רועדת. לאחר מכן לשטוף את השקופיות עבור 5 דקות ב1x PBS / MgCl 2 בטמפרטורת חדר, רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השקופיות לצנצנת שקופית מכתימה זכוכית המכילה פורמלדהיד 1% המוכנים טרי / 1x PBS / MgCl 2 ל10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עבור 5 דקות בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית שונה המכילה 1x PBS בטמפרטורת חדר, רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרת התייבשות אתנול על ידי בעל צנצנות שקופית מכתימה זכוכית נפרדת המכילות 70%, 90%, ו100% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השקופיות לכל צנצנת במשך 3 דקות, מתחילה עם 70% אתנול, ולאחר מכן 90% אתנול, ולאחר מכן 100% אתנול. מניחים צנצנות אתנול ב -20 מעלות צלזיוס, כאשר סיימו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות לייבוש באוויר על ידי הקשה אתנול עודף על מגבת נייר והשעין שקופיות בזווית 35 °. ברגע שיבש, maRK אזור 18 x 18 מ&quot;מ להכלאה על הגב של השקופיות באמצעות עט יהלומים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Denaturation של שקופיות לדגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פוראמיד 120 μl 70% deionized / 2X SSC לcoverslip 24 x 60 מ&quot;מ. לגעת בשקופיות לcoverslip. לפגל שקופיות על 80 מעלות צלזיוס על פלטה חשמלית ל90 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות ובזהירות להחליק את coverslip ולמקם את השקופית באתנול 70% קרים כקרח במשך 3 דקות, ואחריו 90% אתנול, ו100 אתנול% כל אחד במשך 3 דקות. אפשר שקופיות לייבוש באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא לח על ידי המצפה קופסא פלסטיק עם מכסה הדוק ונייר טישו רטוב. הנייר צריך להיות לח, אבל לא רווי במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתא לח, להחיל את תערובת בדיקה-מרותק מראש מצעד 4.1.3 לאזור המסומן בשקופית, מכסה בכיסוי מ&quot;מ תלוש 18 x 18 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוחצת הודעה דגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוראמיד 50% טרום חם / 2x SSC, 1x SSC, ו4x SSC / 0.1% Tween-20 ב45 °; C אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את coverslips ולשטוף את השקופיות ב50% פוראמיד דקות 3xfor 5 / 2x SSC מראש חימם כל אחד בחושך ורועד. שטוף את השקופיות בSSC 1x מראש חימם 3xfor 5 דקות כל אחד, רועדים. לבסוף, לשטוף את השקופיות במחוממים מראש 4x SSC / 0.1% דקות Tween-20 3xfor 5 כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם השקופיות עבור 3 דקות בDAPI בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית אור מוגנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עבור 5 דקות ב2x SSC, רועדים. החל 35 μl של הרכבה בינונית Mowiol, מכסה ב24 x 60 coverslips מ&quot;מ ולאחסן את השקופיות ב 4 ° C.. </li></ol></li></ol> .5 ניתוח מיקרוסקופי של כרומוזומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את שקופיות metaphase באמצעות מיקרוסקופ עלית הקרינה סטנדרטי. השתמש בפלטפורמת הדמיה עם שלב אוטומטי כגון פלטפורמת MetaSystems Metafer כדי להשיג תוצאות הטובות ביותר. לכל התפשטות metaphase, לאסוף תמונה אחת לקרינת DAPI לדמיין כרומוזומים, ותמונה אחת לאות הניאון מp הטלומריםגלימה. (לדוגמא, fluors האחר Cy3- זמין ולעבוד באותה מידה גם.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי התמונות עם תכנית ניתוח תמונה ולנתח. </li></ol>

<ol>
	<li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints.">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li><li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells,+ageing+and+cancer.">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks.">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+IgH-TCRalpha/delta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG.">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70.">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis.">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells.">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).</li><li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping.">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li><li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences.">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li><li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations.">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18.">Chapter 18.</a> Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

אי לנו אינטרסים מנוגדים.

ואילו לימפוציטים מסוג B מופעלים מתאימים במיוחד להכנת ממרחי כרומוזום mitotic, יכולים לשמש גם סוגי תאים אחרים. לימפוציטים מסוג T חולקים הרבה מהיתרונות של תאי B, כפי שהם יכולים להיות מטוהרים מבלוטות הטחול או לימפה, ויש לי מדד גבוה המיטוטי כאשר מגורה על ידי צמיחה במדיום המכיל ...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

הסרטן נגרמים על ידי ההצטברות של מוטציות המשפיעות על גנים המווסתים את גדילת תאים נורמלית. מוטציה היא תוצאה של שינויים במבנה וברצף של הגנום שנגרם נזק לדנ&quot;א. נזק לדנ&quot;א יכול להתרחש באמצעות מגוון רחב של תהליך, כולל סוכנים אקסוגניים כגון קרינה מייננת, וכתוצר לוואי של חילוף חומרים בתאים נורמלים, כגון deamination הספונטני של בסיסי נוקלאוטיד או נזק המתרחשים על ידי מגע עם מיני חמצן תגובתי 1. למרות שתאי יונקים יש מגוון של פעילויות תיקון שיכול להפוך נזק לדנ&quot;א או לשחזר את הרצף באתרי הפסקה, מוטציות בכל זאת לצבור לכל אורך חייו של תא. נזק לדנ&quot;א יכול יתר על כן תורם להזדקנות ואובדן העוצמה של תאי גזע, שני תהליכים הקשורים למחלות הקשורות להזדקנות 2. הבנת התיקון של נזק לדנ&quot;א לכן חשיבות מרכזית בהתמודדות שני סימןנושאי ificant בבריאות הציבור. ראיות מצביעות על כך שהגדלת מסלולי תיקון דנ&quot;א של יונקים יכולים לתרום להתפתחות של הגנום של התאים הסרטניים 3,4, מה שהופך את זה אפילו יותר הכרחי כדי להבין את התהליכים מעורבים בדיכוי מוטציה ברמה המולקולרית. להדמיה ישירה של סטיות כרומוזום היא אמצעי רב עוצמה וכמותי של קביעת ההיקף של חוסר יציבות גנומית בסוג תא מסוים. כרומוזומים תמצית מהתאים בmetaphase יכולים להיות מבודדים ובדקו באמצעות אור או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גישות ציטוגנטית כאלה כבר בפועל במשך כמה עשורים וניתן להשתמש בו כדי להדגים את המראה של טרנסלוקציות או סוגים מסוימים של סטיות כרומוזום קשורות לאובדן של פעילות תיקון DNA. הפרוטוקול משאיל את עצמו לכמה סיומות אפשריות: יכולים להיות מתויג כרומוזומים עם בדיקות לkaryotyping רפאים (SKY) או ניאון ססגוניות הכלאה באתר(MFISH) לזהות טרנסלוקציות 5,6. טכניקות אלו מאפשרות גם את התדירות של טרנסלוקציות כרומוזום והמבנה של טרנסלוקציות כרומוזום המורכבת שייקבע, אשר מספק מידע נוסף מעבר למה שאפשרי עם פרוטוקול זה. לחלופין, יכולות להיות שנוצרו בדיקות רצף ספציפי ומשמשות לבדיקת התדירות של שבירת הדנ&quot;א באתרים הגנומי נבחרו 7. בפרוטוקול זה, אנו מתארים הכנה של כרומוזום metaphase מתפשטת מלימפוציטים מסוג B. בדיקה פפטיד fluorescently שכותרתו חומצות גרעין (PNA) לחזרות telomeric משמשת, אשר יעילות מסמנת הטלומרים בכרומוזום metaphase מתפשט פרוטוקול זה יש מספר יתרונות. יכולים להיגרם תאי B לצמוח במדד המיטוטי גבוה, כך שאופן עקבי ניתן להפיק מרווחים גבוהה באיכות. תאי B מעכברים גנטי שונה הם הרבה פחות סביר שיכילו מוטציות גנטיות משניים שיכול לבלבל את הניתוח של התרומה גםשל גנים ספציפיים לשלמות הגנום. גישת PNA-FISH ניתן להשלים ביום אחד, ומאפשרת ניקוד מדויק יותר של הפסקות כרומוזום. על ידי שימוש בגישה זו, במיוחד בשילוב עם ציוד ספציפי שתואר בפרוטוקול זה, ניתן לייצר מרווחים מאוד עקביים, באיכות גבוהה ובמהירות לנתח את השיעור והסוג של חוסר יציבות גנומית.

<table><tbody><tr><td>50% Dextran sulfate</td><td>Intergen</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>Ambion</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin (5 g)</td><td>Sigma</td><td>P 6887&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>LPS (100 mg)</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 (5 &amp;mu;g)</td><td>Sigma</td><td>I1020</td><td></td></tr><tr><td>PNA Telomere Probe</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td><td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Roche</td><td>295892</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381-50g</td><td></td></tr><tr><td>CD43 (ly-48_) micro-beads</td><td>Miltenyl Biotec.</td><td>130-049-801</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E800</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioImager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td><td>Thermotron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

תיקון DNA פגום מוביל לחוסר יציבות גנומית מוגבר, המהווה את סיבת השורש של מוטציות המובילות ליצירת גידולים. ניתוח של התדירות והסוג של סטיות כרומוזום בתאים מסוגים שונים מאפשר פגמים במסלולי תיקון DNA לא הובהרו. ביולוגיה תיקון דנ&quot;א של יונקים הבנה כבר סייעה רב בייצור של עכברים עם knockouts בגנים מסוימים. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת חוסר יציבות גנומית בB עכבר לימפוציטים. תיוג של הטלומרים באמצעות בדיקות PNA-FISH (חומצות גרעין פפטיד - ניאון הכלאה באתר) מאפשר ניתוח המהיר של חוסר יציבות גנומית במרווחי כרומוזום metaphase. יש לי תאי B יתרונות ספציפיים ביחס לפיברובלסטים, כי יש להם ploidy נורמלי ומדד המיטוטי גבוה יותר. תרבות לזמן הקצר של תאי B ולכן מאפשרת מדידה מדויקת של חוסר יציבות גנומית באוכלוסיית תא ראשונית שעשויה להיות מוטציה גנטית משנית פחותים יותר ממה שהוא נמצא בדרך כלל בfibroblasts הפך או שורות תאי חולה.

כרומוזומים Metaphase נגזרים מתא אחד צריכים ליצור אשכול דיסקרטי המכיל 40 הכרומוזומים (אם שימוש בתאי עכבר) (איור 1 א). לכל כרומוזום centromere בקצה אחד, שהוא נראה כמו כדור אור כחול. בכרומוזומים רגילים, שני אותות הטלומרים נראים בסוף chromatids ושני אותות על ידי כל אחד centromere. גרעי...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

מסלולי תיקון DNA חיוניים לתחזוקה של שלמות הגנום ומוטצית מניעה וסרטן. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת חוסר יציבות גנומית על ידי תצפית ישירה של סטיות כרומוזום בmetaphase מתפשט מתאי B עכבר באמצעות ניאון הכלאה באתר (FISH) לחזרות דנ&quot;א telomeric.

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

rapid-analysis-chromosome-aberrations-mouse-b-lymphocytes-pna

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.9K Views.  Rutgers, the State University of New Jersey.  מסלולי תיקון DNA חיוניים לתחזוקה של שלמות הגנום ומוטצית מניעה וסרטן. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת חוסר יציבות גנומית על ידי תצפית ישירה של סטיות כרומוזום בmetaphase מתפשט מתאי B עכבר באמצעות ניאון הכלאה באתר (FISH) לחזרות דנ"א telomeric. 

Video: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. To assess the impact of PM on nuclear genetic integrity, structural chromosomal aberrations are scored in the metaphase spreads of mouse RAW264.7 macrophage cells. PM is collected from ambient air with a high volume total suspended particles sampler. The collected material is solubilized and filtered to retain the water-soluble, fine portion. The particles are characterized for chemical composition by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Different concentrations of particle suspension are added onto an in vitro culture of RAW264.7 mouse macrophages for a total exposure time of 72 hr, along with untreated control cells. At the end of exposure, the culture is treated with colcemid to arrest cells in metaphase. Cells are then harvested, treated with hypotonic solution, fixed in acetomethanol, dropped onto glass slides and finally stained with Giemsa solution. Slides are examined to assess the structural chromosomal aberrations (CAs) in metaphase spreads at 1,000X magnification using a bright-field microscope. 50 to 100 metaphase spread are scored for each treatment group. This technique is adapted for the detection of structural chromosomal aberrations (CAs), such as chromatid-type breaks, chromatid-type exchanges, acentric fragments, dicentric and ring chromosomes, double minutes, endoreduplication, and Robertsonian translocations in vitro after exposure to PM. It is a powerful method to associate a well-established cytogenetic endpoint to epigenetic alterations.

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

This protocol describes techniques for the quantification and characterization of chromosomal aberrations in vitro in RAW264.7 mouse macrophages after treatment with ambient air particulate matter.

ניתוח של סטיות כרומוזומליות Matter הנגרמת חלקיקי אמביינט שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Genetics

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (mFISH) ו ספקטרלית Karyotyping (SKY) בעכברים מוקרנים

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis 

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a cohort generated by assisted reproduction technology (ART). This selection may be required because of familial monogenic disease (e.g. cystic fibrosis), or because one partner carries a chromosome rearrangement (e.g. a two-way reciprocal translocation). PGD is available for couples who have had previous affected children, and/or in the case of chromosome rearrangements, recurrent miscarriages, or infertility. Oocytes aspirated following ovarian stimulation are fertilized by in vitro immersion in semen (IVF) or by intracytoplasmic injection of an individual spermatozoon (ICSI). Pre-implantation cleavage-stage embryos are biopsied, usually by the removal of a single cell on day 3 post-fertilization, and the biopsied cell is tested to establish the genetic status of the embryo. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on the fixed nuclei of biopsied cells with target-specific DNA probes is the technique of choice to detect chromosome imbalance associated with chromosome rearrangements, and to select female embryos in families with X-linked disease for which there is no mutation-specific test. FISH has also been used to screen embryos for spontaneous chromosome aneuploidy (also known as PGS or PGD-AS) in order to try and improve the efficiency of assisted reproduction; however, the predictive value of this test using the spreading and FISH technique described here is likely to be unacceptably low in most people's hands and it is not recommended for routine clinical use. We describe the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to PGD in a clinical setting.

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

This article describes the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to pre-implantation genetic diagnosis (PGD) in a clinical setting.

FISH לאבחון גנטי טרום השרשה

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

Medicine

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

מודל דגי זברה של גרורות נוירובלסטומה

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Cancer Research

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: איתור של שינוי המספרי מבני 24 כרומוזומים כל אדם בו זמנית באמצעות Assay רומן דגים OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Biology

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Analysis of Somatic Hypermutation in the JH4 intron of Germinal Center B cells from Mouse Peyer's Patches

Within the germinal centers of lymphoid organs, mature B cells alter their expressed immunoglobulin (Ig) by introducing untemplated mutations into the variable coding exons of the Ig heavy and light chain gene loci. This process of somatic hypermutation (SHM) requires the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID), which converts deoxycytidines (C), into deoxyuridines (U). Processing the AID-generated U:G mismatches into mutations by the base excision and mismatch repair pathways introduces new Ig coding sequences that may produce a higher affinity Ig. Mutations in AID or DNA repair genes can block or significantly alter the types of mutations observed in the Ig loci. We describe a protocol to quantify JH4 intron mutations that uses fluorescence activated cell sorting (FACS), PCR, and Sanger sequencing. Although this assay does not directly measure Ig affinity maturation, it is indicative of mutations in Ig variable coding sequences. Additionally, these methods utilize common molecular biology techniques which&#160;analyze&#160;mutations in Ig sequences of multiple B cell clones. Thus, this assay is an invaluable tool in the study of SHM and Ig diversification.

Presented here is an assay to quantify somatic hypermutation within the immunoglobulin heavy chain gene locus using germinal center B cells from mouse Peyer&#8217;s patches.

ניתוח של היפרמוטציה סומטית באינטרון JH4 של תאי מרכז נגרינל B מן המדבקות של עכבר פייר

Within the germinal centers of lymphoid organs, mature B cells alter their expressed immunoglobulin (Ig) by introducing untemplated mutations into the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and T lymphocytes. Studies of zebrafish lymphopoiesis are difficult because antibodies recognizing D. rerio cell surface markers are generally not available, complicating isolation and characterization of different lymphocyte populations, including B-lineage cells. Transgenic lines with lineage-specific fluorophore expression are often used to circumvent this challenge. The transgenic lck:eGFP line has been used to study D. rerio T cell development, and has also been utilized to model T cell development and acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Although lck:eGFP fish have been widely used to analyze the T-lineage, they have not been used to study B cells. Recently, we discovered that many zebrafish B cells also express lck, albeit at lower levels. Consequently, lck:eGFP B cells likewise express low levels of GFP. Based on this finding, we developed a protocol to purify B-lineage cells from lck:eGFP zebrafish, which we report here. Our method describes how to utilize a fluorescent-activated cell sorter (FACS) to purify B cells from lck:eGFP fish or related lines, such as double-transgenic rag2:hMYC; lck:eGFP fish. In these lines, B cells, particularly immature B cells, express GFP at low but detectable levels, allowing them to be distinguished from T cells, which express GFP highly. B cells can be isolated from marrow, thymus, spleen, blood, or other tissues. This protocol provides a new method to purify D. rerio B cells, enabling studies focused on topics like B cell development and B lymphocyte malignancies.

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Transgenic lck:eGFP zebrafish express GFP highly in T lymphocytes, and have been used to study T cell development and acute lymphoblastic leukemia. This line can be used to study B cells, which express lck at lower levels. This protocol describes purification of malignant and non-malignant B cells from lck:eGFP zebrafish.

בידוד Malignant ותאי B Non-Malignant מ lck:eGFP דג זברה

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ניתוח של סטיות כרומוזומליות Matter הנגרמת חלקיקי אמביינט שימוש

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה