עבודה זו נתמכה על ידי מימון לRAW מבין האפשרויות הבאות: המכון הלאומי לבריאות מעניק K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; מרס של # הפרס מענק של 5 FY12-75 הפרוטות הזיל אוקונור Starter Scholar; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעים ביולוגיים; ומתנה נדיבה לאוניברסיטת נוטרדאם מאליזבת ומייקל גלאגר מטעם משפחת גלאגר לטפח מחקר בתאי גזע. היו לי המממנים שום תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם, או ההכנה של כתב היד. אנו מודים לצוותות של המחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטרה דאם למסירות היוצאות מן הכלל שלהם בטיפול והרווחה של המושבה דג הזברה שלנו. לבסוף, אנו מודים לחברים של מעבדת המחקר שלנו להערות, דיוניהם ותובנות על עבודה זו.

יש לי המחברים אין לחשוף.

הנה, יש לנו תארנו שיטות המאפשרות ההדמיה של רכיבי קטע נפרון בדג הזברה המבוגר. ההזרקה של conjugates dextran ניאון מאפשרת תיוג PCT מועדף בשל מאפייני endocytic של תאי אבובית הפרוקסימלי אלה 30,38. שיטה זו יכולה להתבצע עם גמישות רבה בשל קיומו של dextrans שניתן להשיג עם להקה של conjugates ניאון שונה. בנוסף, השימוש בdextrans יזין-ניתן לתקן הוא דרך נוחה במיוחד לתייג PCT מגזרים, כפי שנהלי תיוג משניים אינם נדרשים. זה מאפשר זיהוי אות פשוט יחסית והוא תואם עם הרבה מדבקות אחרות ניאון, immunolabeling, ושימוש בקווי כתב מהונדסים. תיוג phosphatase אלקליין גם מסמן את אבובית הפרוקסימלי, עם תגובתיות חזקה בPCT ותגובתיות מעט חלשה יותר בPST. לבסוף, מכתים DBA מאפשר סימון של קטעי אבובית דיסטלי, המציגים characteristic מסועף מורפולוגיה. מולקולות לקטינים שונות, אשר מחייב חלבוני סוכר ממוצא nonimmune, נעשו שימוש נרחב להבחין מגזרי נפרון היונקים 47. זה מעניין, כי DBA בדג הזברה בקורלציה עם מגזרי אבובית דיסטלי, כפי שהוא מנוצל לציון צינורות איסוף בכליות של יונקים 47. יחדיו, יכולות להיות מנוצלים בשיטות אלה בצירופים שונים כדי לתעד הרכב ובתפקוד כליות. מאחר וכל השיטות הללו ניתן להשתמש בתכשירי כליה שלמים, הם מספקים כלים להערכת מבנה נפרון ותפקוד לאורך האיבר ללא כל הסתמכות על השימוש של יותר זמן רב, שיטות מייגע, למשל, עבודת cryosection וimmunolabeling. עם זאת, הכתמים מתוארים במאמר זה הם שיטות קיימא בcryosection. ניתוח cryosection מייצר דגימות (בהשוואה להר שלם) שהם מתאימים יותר לאימונוהיסטוכימיה כדי לזהות pepti הספציפיdes, אם כי כמובן זה סוג של ניתוח דורש הזמינות של נוגדנים ראשוניים מתאימים. למרבה הצער מגבלה העיקרית אחת בעבודה עם מודל החיה דג הזברה נשארת עניה הזמינות של נוגדנים. כך המאחלים נשאר בשימוש נרחב ביותר, כלומר, &#39;ללכת ל, &quot;הליך לניתוח של ביטוי גנים. מאחל באמצעות תגובות מצע BCIP, NBT, ו / או INT לייצר משקעים סגולים או אדומים אינו תואם עם מכתים ניאון על cryosections. אפשרות אחת תהיה להפעיל את השימוש בזיהוי מאחלי ניאון, הליך שעבר אופטימיזציה עבור דגימות עוברי דג הזברה ויכול להיות מותאם לשימוש עם הכליה הבוגרת. התיאור של השיטות במאמר זה וידאו צריך לאפשר לניסויים נוספים עם טכניקות כמו מאחלי ניאון בשילוב עם קווי דג הזברה מהונדסים שבו קטעים בודדים מסומנים עם כתב כגון eGFP או mCherry. לחלופין, השיטות שתוארו כאן could להיבדק בשילוב עם צבעים אחרים חיוניים, למשל, לקטינים אחרים. לפיכך, הסתגלות והרחבת השיטות שתוארו כאן עוד יכולים להיות מופעלת כדי שיתאימו לצרכימים של החוקר להכנות הר שלמים בכליות וניתוח. ככזה, יש להם שיטות אלה פוטנציאל רחב ליישום עם מודל דג הזברה ללימודי התחדשות מתמשכים וגם בדוגמנות מחלה גנטית. יש צורך דחוף במחקר חדשני וטיפולים לייסורי כליות. מיליוני אנשים סובלים מצורה כלשהי של מחלת כליות בכל שנה כתוצאה מגורמים מולדים, אקוטיים, ו / או כרוניים. יתר על כן, השכיחות של מחלת כליות ממשיכה לעלות ברחבי העולם, מה שהופך את המחלות הללו נושא בריאות הציבור עולמי 14,15. טיפולים כגון המודיאליזה זמינים לפי מכונת דיאליזה חיצונית משמשת ללהיפטר הדם של מטופל של פסולת מטבולית אם הכליות שלהם אינן מסוגלות לבצע את התפקיד הזה. לרוע המזל, יש התערבות זו מגבלות, כטיפול מתמשך הוא הכרחי להישרדות. יתר על כן, חולי סופו של דבר דורשים השתלת כליה, אשר יכול לקחת שנים כדי לקבל פעם במטופל שוכבים על waitlist. גם לאחר קבלת להשתלת כליה, חולים רבים סובלים מתופעות לוואי כתוצאה מההליך וחייבים לקרב את ההשפעות הללו לשארית חייהם. קשיים אלה מדגימים את הצורך הרציני לפיתוח טיפולים חדשניים לאו לסייע במניעת מחלת כליות או כדי להגדיל את התחדשות רקמות 8,16,52,53 אולי. בהתחשב במגבלות האתיות הברורה של השימוש במבחן בבני אדם במעבדות ביו, מודלים של בעלי החיים הם חיוניים למחקר של היווצרות מחלה אנושית ועבור הבדיקות של טיפולים חדשים. כתוצאה מהדמיון האנטומי שלה וקרבה אבולוציונית, העכבר הפך המודל הנפוץ ביותר של מחלות בבני אדם 45. עם זאת, יש מגבלות מסוימות עם בעל חיים זה, including חוסר יכולת לחזות התפתחות איבר בגוף חי ומעשיות של השלמת מסכי גנטיים בקנה מידה גדולה. דג הזברה הוא אורגניזם מודל רלוונטי ושימושי ללימוד פיתוח איבר ומודלים למחלות אנושיות 45,46. בכל הקשור למחלות של בני אדם, homologs התפקודי בדג הזברה קיים עבור כמעט 70% מכל הגנים האנושיים 54,55. מחקר שנערך לאחרונה הדגיש את התועלת של דג הזברה לתחומים רבים של 31,37,56 מחקר כליות. מחקרים של התחדשות ותיקון בדג זברה לאחר AKI מצביעים על כך שהתחדשות אפיתל אבובית וneonephrogenesis הם שני תהליכים המתרחשים וחפיפה לאורך כל ההתחדשות timecourse 30,37. השימוש בגנטמיצין נקרא האנטיביוטיקה aminoglycoside נוצל כפרדיגמה פציעה אשר דרך ללמוד את התוצאות של AKI ב29,30,37 דג הזברה מבוגר. במהלך פציעה כשני שבוע תקופה שלאחר מגנטמיצין, טובול פרוקסימליes להתחדש, ובינתיים nephrons החדש להיווצר בכל רחבי האיבר 29,30,37. באופן כללי, המנגנונים המווסתים את התחדשות אפיתל יישארו שנויים במחלוקת. במנגנון מוצע אחד של תהליך התיקון, יש אירוע פציעה אקוטית הראשוני ואחריו השלת תאים מתים לתוך לומן. בשלב הבא, יש סדרה של דה בידול, התפשטות, ואירועי הגירה, לאחר שתאים חדשים לבדל, אכלוס מחדש את הקרום במרתף נפצע ושחזור פונקציה לאתר נפצע. לחלופין, מחקרים אחרים הראו כי תאים חלופיים נובעים מתאי גזע / אב המתגוררים בתוך צינוריות נפרון. באשר לתהליך של neonephrogenesis בדג זברה, אגרגטים הסלולר נצפו AKI הבא על ידי הזרקת גנטמיצין 29,30. אגרגטים אלה מאוחר יותר יבשילו לnephrons החדש שאנך לצינוריות כבר קיימות 29,30. החוט המקשר, המאחד התחדשות אפיתל נפרון וneonephrogenesis הוא גורם המסתורין המוחלט שלהם: כיום יש באופן אקספוננציאלי יותר שאלות על איך מעללי משובי הללו מתרחשים מאשר יש תובנות זמינות. עד כה, עם זאת, כמה שורות מרגשות של ראיות תומכות ברעיון שמחקר התחדשות כליות באמצעות דג הזברה אכן יכול לספק תובנות השוואתיות רלוונטיות לAKI האנושי שיכול להיות גם 56-58 פוטנציאל translational ישיר. הקרנה כימית לזהות מולקולות קטנות המגבירות את השגשוג של תאי אב כליות בעובר דג הזברה, הביא לאחרונה לזיהוי -butanoate מעכב deacetylase היסטון מתיל-4 (phenylthio) (m4PTB) 56,57. מנהל של תרכובת זו לזחלי דג הזברה עם AKI-Induced גנטמיצין גילה כי הישרדות זחל גדלה ושהשגשוג צינורי הכליות היה משופר 56,58. כאשר עכברים עם AKI-Induced איסכמיה המתון טופלו בm4PTB, ההתאוששות שלהם הואצה בassociation עם ירידה בשני מעצר הניוון ומחזור התא צינורי של תאים מתרבים צינורי כליות 58. ממצאים אלה מראים כי המסלולים אחראים להתפתחות תקינה של דג הזברה כליה ו / או תגובת משובי לאקי יהיו נשמרים עם יונקים 56. וכך, בעוד יש צורך במחקרים נוספים כדי להפריד את מנגנוני התחדשות, כלומר לזהות את מסלולי האיתות כי הם מעורבים ולהבין האינטראקציות-דג הזברה שלהם מספקת השדרה מבטיחה אחד להמשיך מטרה חשובה זו בתחום נפרולוגיה. כלים כגון תוויות תא נפרון המתוארות בפרוטוקול זה מייצגים קבוצה אחת של מבחני שיכולים להיות מנוצל כדי להעריך הרכב ופונקציונליות כליות במודלי AKI. יתר על כן, הם יכולים להיות מיושמים לאפיין מודלים מהונדסים של מחלת כליות ועשויים לספק דרכים לזיהוי תרופות כימיות מסוגלות לקדם שיקום של מבנה נפרון לאחר סכר הכליהגיל.

הכליות היא איבר מורכב המקיים מספר רב של פונקציות פיסיולוגיות בגוף. הפונקציה החשובה ביותר של הכליות היא הפרשת פסולת המטבולית, ומשימה זו כרוכה באופן הדוק עם השמירה על הומאוסטזיס נוזל. הכליות מבצעת עבודות אלה על ידי סינון הדם ויצירת שתן, ואילו במקביל ויסות לחץ דם, רמות אלקטרוליטים, ואיזון חומצה בסיס. צינוריות אפיתל מאוד מיוחדות הנקראות נפרונים לשמש כיחידה תפקודית הבסיסית של הכליות 1,2. בבעלי חוליות מבוגרות, nephrons מאורגן בדרך כלל בהסדר מותח ביותר המקיף את מערכת ניקוז מרכזית, ובכך מאפשר לצינוריות רבות לארוז לתוך האיבר קטן למדי. לדוגמא, כל כליה אנושית יכולה להכיל מעל 1 מיליון nephrons 3. יונקים אחרים כמו העכבר להחזיק על סדר 8-10,000 nephrons לכליות 4. מידת המורכבות של כליות שונות בין יונקים אלה וvert האחרebrates בשל שינויים במספר כולל נפרון והפריסה האדריכלית שלהם בתוך הכליות. מינים של בעלי חוליות בצורה רבות כמו שלושה מבנים רצופים בכליות במהלך פיתוח, וכל אחד מציג טופס הגדלת מורכבות בכל קשור לתרומת נפרון והסדר: pronephros, כליה בינים, וmetanephros. מבנה הכליות האחרון להישמר משמש ככליה מבוגרת איבר בדרך כלל כליה בינים או metanephros 2. כל טופס בכליות, לעומת זאת, יש לו הרכב מבוסס נפרון 2. נפרון הוא סוס העבודה של הכליות והוא אחראי על סינון דם יחד עם הפרשת המטבוליט וספיגה. Nephrons הם מבנים צינוריים פשוטים מורכבים מתאי אפיתל ויש לי ארגון מגזרי, שבו תחומים דיסקרטיים, מאוד מיוחדים האפיתלים מובחנים לבצע משימות ספציפיות. בצו של זרימת תסנין דרך נפרון, יש בדרך כלל שלושה חלקים עיקריים שcomprisדואר כל יחידה: (1) גופיף הכליה, (2) אבובית עם הפרוקסימלי, ביניים, ומגזרי דיסטלי, ו (3) צינור איסוף 1. אבובית הפרוקסימלי היא אחראית לספיגה החוזרת של מומסים אורגניים, בעיקר חומצות אמינו וגלוקוז 1. אבובית ביניים (או הלולאה של הנלה) היא אתר מרכזי של רגולציה מלח ומים 1. לבסוף, כוונון עדין של מלח ויונים אחרים מתרחש באבובית דיסטלי וצינור איסוף ומוסדר מאוד על ידי המערכת האנדוקרינית 1. משם, התסנין עובר דרך השופכן ושלפוחית ​​השתן, סופו של דבר לצאת מהגוף כתוצר פסולת 1. אובדן התפקוד הכלייתי יכול לנבוע ממספר רב של גורמים המונעים פעילות נפרון נורמלית. גורמים אלה יכולים להתרחש במהלך התפתחות כליות, למשל, מומים מולדים הגורמים לעיוות של nephrons 5, או גורמים מסוגים שונים של פציעה (שנובעים משני גנטי וenvironmeמקורות פתיחות opening סגירות closures). פציעות שנרכשו מסווגות רחב כפגיעה אקוטית בכליות (AKI) או פגיעה כרונית בכליות (CKD). AKI כרוך אובדן פתאומי של תפקוד הכלייתי, לעתים קרובות כתוצאה מאיסכמיה או רעלן החשיפה 6,7. ביונקים, תיקון אפיתל נפרון הוא אפשרי לאחר פציעות כגון 8, ואנשים רבים להציג שיקום מלא של תפקוד הכלייתי לאחר AKI. עם זאת, AKI קשור גם גבוהה תחלואה ותמותה שדווחו ברחבי 30 רחב - טווח שכיחות 70% 6,7. מחלת כליות כרונית, לעומת זאת, קשורה לאובדן הדרגתי של תפקוד כליות כתוצאה משנים של נזק ממושך, בדרך כלל קשור עם סיסטיק 8,9. יתר על כן, יחסי גומלין קיים בין AKI וCKD, כמו גם אחד יכול להטות מראש פרט ל10-12 האחר. לדוגמא, אלה שסבלו מAKI רגישים יותר למחלת כליות כרונית ואף למוות 13. השכיחות של מחלת כליות, גם בארה&quot;ב ובעולם, הגיעה epideפרופורציות ומיקרופון צפויים לעלות כאוכלוסייה בגילים מתרחבת-לכן יש צורך הולך וגדל לזהות התערבויות רפואת רגנרטיבית לכליות 14,15. למרות הידיעה שחולי AKI יכולים לשחזר, זה כבר זמן רב חשב כי הכליות הוא איבר ללא סמכויות משובי מולדים. השקפה מסורתית זו תוקן באופן דרמטי בשנים האחרונות 16. מחקרים חוקרים נזק כלייתי בעכברים וחולדות לאחר AKI הראו כי תאי אפיתל אבובית נפרון יכולים להתרבות ולבנות מחדש nephrons הפונקציונלי 17-20. למרות יונקים בעלי יכולת הסתגלות זה להתחדש nephrons, יש מגבלות בולטות ותגובות הסתגלות יכולה להיות מופעלות על אשר תוביל לסיסטיק כליות ומחלת הכליות כרוני 21. לדוגמא, מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי אבלציה תאי אפיתל החוזרת ונשנית בnephrons העכברי הייתה קשורה עם התחדשות מצומצמת וnephrons מרמז-סיסטיק כליות havea מוגבל סף התחדשות 22. אין ראיות לכך שהכליות של יונקים הבוגרים מהוות nephrons החדש כדי להחליף את אלה שאבדו או ניזוקו, ובכך ההרס שלהם מוביל לגירעון נפרון 8,9 קבוע. מעניין, כמה בעלי חוליות מגיבות לאקי על ידי התחדשות epithelia נפרון וגם על ידי הפקת nephrons החדש, תהליך המכונה neonephrogenesis או נפרון neogenesis 23. Neonephrogenesis מתרחש בדגים לאחר חשיפת רעלן או כריתה חלקית, ומודלי פציעה באופן הסטורי כללו את דג הזהב 24,25, אמנון 26, להחליק 27, medaka 28, ולאחרונה, דג הזברה 29,30. מתוכם, דג הזברה לספק מודל מחקר גנטי קיימא לגלות מסלולים התאיים ומולקולריים אחראים להתחדשות כליות. במאמר זה וידאו, אנו מדגימים כיצד לתייג מגזרי נפרון בדג זברה מבוגרת. ידע של האנטומיה נפרון, תכונות מולקולריות,ומאפיינים פונקציונליים חיוניים למחקרי כליות עתיד מוצלחים באמצעות דג הזברה. כליות דג הזברה מבוגרת היא מבנה כליה בינים והוא מטבעו פחות מורכב במונחים של מספר נפרון וארגון מאשר מבנה metanephros מצא ביונקים בוגרים, avians, וזוחלים ביום 31 ב. עם זאת, ארגון קטע נפרון דג הזברה הוא דומה ליונקים, ותועד לראשונה בכליה העוברית מבוססת על מחקרי ביטוי גני 31-35. nephrons עובר דג הזברה מכיל מקטעים ליניארי אבובית הכוללים הפרוקסימלי אבובית המפותלת (PCT), אבובית הפרוקסימלי ישרה (PST), דיסטלי המוקדם (DE), ודיסטלי מאוחר (DL) 31-35 (איור 1). nephrons המבוגר דג הזברה יש מגזרים צינורי דומים 30,31,36,37 (איור 1). PCT יכול גם להיות מזוהה על ידי פנוטיפ פונקציונלי: תאי האפיתל בPCT ישלבו תרכובות שכותרתו fluorescently dextran (10-70 KDA בגודל) נוכחת בבמחזור, אשר שימוש בו בשתי כליות דג הזברה העוברית ובוגרות להעריך ספיגת endocytic על ידי התאים אלה אבובית הפרוקסימלי 38-41 (איור 1). הבדל אחד במגזרי נפרון בין דג הזברה ויונקים הוא שדג זברה חסר אבובית ביניים, או לולאה של Henle 30-37; מאז פונקציות מגזר זה ביונקים כדי לחסוך במים, ודג זברה הן מיני מים מתוקים בלי דחיפות להתרכז השתן שלהם, אין זה מפתיע שדג זברה חסר מגזר זה 32,33. לפיכך, הרכב נפרון הכולל נשמרת במידה רבה בין דג הזברה והכליות של יונקים 32,33. קווי דמיון אלה אפשרו דג הזברה להיות כלי מחקר יעילים כדי לחקור את הפונקציות של גנים הביעו כליות במהלך nephrogenesis התפתחותית 32-35,42 ולהדגים מחלות כליה רבות 43,44, ובכך מוסיף לרשימה המשמעותית של תנאים אנושיים שיכול להיות נחקר באמצעותדג הזברה 45,46. היום, בכליות דג הזברה מבוגרת היא מודל אטרקטיבי ללימודים השוואתיים של התחדשות כליות עקב tractability הגנטי שלו וחיך הרחבת של משאבים טכנולוגיים העומד לרשות לחקור את תפקוד גן ומסלולי איתות במין זה. מספר מחקרים השתמשו בכליה ביני דג הזברה כדי לחקור את המנגנונים של התחדשות לאחר AKI 29,30,37. למחקר AKI המשיך באמצעות כליות דג הזברה מבוגרת, זה הכרחי יש שיטות מעודנות לתייג אזורי נפרון שונים ושיטות סקר פונקציונלי נפרון. מספר שיטות לניתוח בכליות מבוגר הותאמו מפרוטוקולי כליה עובריים. זריקת intraperitoneal של dextran שכותרתו fluorescently בדג הזברה המבוגר תוויות האפיתל PCT בnephrons כליה בינים באמצעות אנדוציטוזה 30, כמו בעוברי דג הזברה 38-41 (איור 1). שיטה זו נעשתה שימוש כדי visualizדואר כאשר צינוריות הפרוקסימלי חזרה את רכושם reabsorbing הבאות AKI, המאפשר הערכה אחת של פונקציה פיזיולוגית המשוחזר 30 (איור 1). תכונה נוספת של אבובית הפרוקסימלי נפרון היא שתאי האפיתל במגזר זה יש גבול מברשת 37 שמראה רמות גבוהות של פעילות phosphatase אלקליין אנדוגני. לפיכך, האפיתל הפרוקסימלי יכול להיות מקומי חזותי בכליות דג הזברה מבוגרות תוך שימוש בטכניקת הקרינה מבוססת הידוע בשם (הקרינה אנזים שכותרתו) ELF- -97 47. כאן, אנו מתארים כיצד לבצע מבחני ספיגת dextran ניאון 30,48 בכליות דג הזברה מבוגרות, כדי להשיג הערכה תפקודית של אבובית הפרוקסימלית ולמפות את הגודל וקווי מתאר של קטע אבובית זה. בשלב הבא, אנו מתארים טכניקות לתייג אזורי אבובית הפרוקסימלי של נפרון המבוגר עם phosphatase אלקליין תווית הניאון. שלישית, אנו מציגים בפעם הראשונה שRhodאמין מתויג הקטינים Dolichos biflorus agglutinin (DBA), אשר שימש כסמן כללי של צינורות האיסוף בכליות של היונקים 49, מסמן את המבנים צינוריים של הכליה דג הזברה מבוגרת. כDBA הוא מוציאים לצביעת phosphatase אלקליין, תוויות אלה מספקים דרך להבחין מחבת-הפרוקסימלי לעומת מתיחות מחבת-הדיסטלי של נפרון דג הזברה המבוגר באופן רחב. אורך יישום כתמי ניאון אלה בשני הר שלם וסעיפים היסטולוגית cryostat, אנו לתאם תוויות אלה עם תחומים ביטוי של גני טרנספורטר המומס כי לזהות כל מגזר נפרון. לכן פרוטוקול זה מכיל גם מדריך לנהלים שונה רקמת עיבוד להר שלם רקמות בוגרות בכלאה באתר ניתוח (לוואי) המבוססים על פרוטוקול מאחלי העובר שלנו 50. נהלים אלה יכולים להיות o משמשים בשילובים שונים (איור 2) לתיעוד תכונות מורפולוגיות ותפקודיותnephrons הכליה דג הזברה המבוגר f. כך, יכולים להיות מיושמים בפרוטוקולים אלה ללימודי התחדשות, האפיון פנוטיפי של מודלים מחלת כליות אחרים, ואפילו בשימוש ללמוד היווצרות של הכליה מבוגרת.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

מודל דג הזברה התפתח כמערכת רלוונטית ללימודי פיתוח בכליות, התחדשות ומחלה. שני כליות דג הזברה העוברית ובוגרות מורכבות מיחידות פונקציונליות הידוע בשם nephrons, אשר שמורות ביותר עם חוליות אחרות, לרבות יונקים. מחקר בדג הזברה הוכיח לאחרונה כי שתי תופעות ייחודיות להתרחש לאחר nephrons המבוגר להיגרם נזק: ראשון, יש התחדשות חזקה בתוך nephrons הקיים המחליף את תאי האפיתל אבובית נהרסו; שני, nephrons החדש לחלוטין המיוצר מאבות כליות בתהליך המכונה neonephrogenesis. בניגוד לכך, נראה שבני אדם ויונקים אחרים יש יכולת מוגבלת בלבד להתחדשות אפיתל נפרון. נכון להיום, את המנגנונים אחראים לתופעות התחדשות כליות אלה יישארו הבינו היטב. מאז כליות דג הזברה מבוגרות לעבור שתי התחדשות אפיתל נפרון וneonephrogenesis, הם מספקים סעיף ניסיוני מצטייןdigm ללמוד את האירועים הללו. יתר על כן, יש מגוון רחב של כלים גנטיים ותרופתיים זמינים במודל דג הזברה, שניתן להשתמש כדי להתוות מנגנונים התאיים ומולקולריים המווסתים את התחדשות כליות. היבט חיוני אחת של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר קבוצה של טכניקות תיוג כי ניתן להשתמש כדי לאמוד את הרכב כליות ופונקציונליות נפרון המבחן בכליות דג הזברה המבוגר. לפיכך, שיטות אלה הן נרחב החלים על האפיון פנוטיפי העתיד של פרדיגמות מבוגרות דג הזברה פגיעה בכליות, אשר כוללות, אך אינם מוגבלות, למשטרי חשיפת nephrotoxicant או שיטות גנטיות של מוות של תאים ממוקדים כגון טכניקת אבלציה תא nitroreductase בתיווך. יתר על כן, ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי ללמוד הפרעות גנטיות בהיווצרות כליה מבוגרת ויכולות להיות מיושמות גם כדי להעריך את מצב כליות במהלך דוגמנות מחלה כרונית.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

הכליות מבוגרות דג הזברה היא מערכת מצוינת ללימודי התחדשות ומחלת כליות. היבט חיוני של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות שניתן ליישם על מנת להעריך הרכב אבובית נפרון ולהעריך את ספיגה של כליות.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

43.9K Views.  University of Notre Dame.  הכליות מבוגרות דג הזברה היא מערכת מצוינת ללימודי התחדשות ומחלת כליות. היבט חיוני של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות שניתן ליישם על מנת להעריך הרכב אבובית נפרון ולהעריך את ספיגה של כליות. 

Video: Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

השתלה של תאים ישירות לתוך הכליה של דג הזברה למבוגרים

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

הדם אוסף של ניתוח ביוכימי דג הזברה למבוגרים בלבד

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging דג הזברה למבוגר

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...