המחקרים שנתמכו על ידי NIH HL75503 לתהליך קימברלי.

כל הניסויים שבוצעו בבעלי חיים כפי שאושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת טנסי למדעי בריאות במרכז. 1. Tubing תכשירים מרוססים עכברוש ריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מערכת צינורות עם צינורות Tygon (# 18) לזלוף דם כפי שמוצג באיור 1. חבר מתמרים ללחץ (P23XL) ולמקם את צינורות על הבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת טמפרטורת אמבט מים עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את כניסת הריאות ולשקע באופן זמני עם צינור Tygon. </li></ol><img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51552/51552fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. צינורות טפטוף דם. סכמטית מציגה את התקנת צינורות המשמשת למחזור הדם דרך הכנת ריאות המבודדת. כמו כן ציינו הם הרכיבים הקשורים שדרכו אני צינורותשל מנותב. סכמטי של הלב והריאות כלול להראות אתרים של חיבור בין צינורות ועורק ריאה (הרשות הפלסטינית), והשאיר את פרוזדורי צינורית (LA) (כחול קווים מקווקווים). 2. הכנת ריאות חולדה מבודדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי חולדות (חולדות זכרים ספראג-Dawley; 250-300 גר &#39;) עם קטמין (80-100 מ&quot;ג / קילוגרם) ועם xylazine (5-10 מ&quot;ג / קילוגרם). לאחר שווידאת מטוס של הרדמה כירורגית, מקום חי במצב שכיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ההנשמה, הכנס צינורית לקנה הנשימה (PE-90) ובטוח עם תפר כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות הפרין (100-200 U) ללב על ידי לנקב לב (21 מחט פרפר G), לחכות ל60 שניות ודם לגרום לדימום מחודש (~ 12-15 מיליליטר דם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שתי קנולה (צינור Tygon, בקוטר 3 מ&quot;מ; ארוכה 4 סנטימטר; מתרחבת בקצה אחד) ולמלא עם מי מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע פתיחת בית החזה. עושה חתך (3 מ&quot;מ) בחדר ממני והחלק את הסוף התלקח של צינורית לתוך החתך לכיוון הריאותעורק. Secure צינורית לעורק ריאה עם תפרים כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך (3 מ&quot;מ) את שיאו של החדר השמאלי והחלק את הקצה התלקח של הצינורית השנייה לתוך החתך. להנחות את הצינורית לתוך אטריום השמאל. Secure צינורית לחדר השמאלי עם קלטת טבור (2 מ&quot;מ רוחב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את כל רקמת חיבור, ולהסיר את הריאות ולב, יחד עם קנולה המצורפת. הנח ריאות ולב בצלחת פטרי. למקם מחדש את הריאות, כך שמשטח סרעפתי הוא על העליונה. שלוש קנולה לצריכה להתמודד לאותו כיוון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכנת הריאות בשלב שניתן להשפיע בכיווני XY. כל שלב שמגיע עם מיקרוסקופ יכול להיות שונה כדי להחזיק את צינורות או שלב מחוייט שנבנה, במידת הצורך. </li></ol> 3. זלוף הדם של ריאות חולדה מבודדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את דם exsanguinated עם אלבומין שווה נפח (5%) פתרון ולהוסיף למאגר. הפעל את משאבת peristaltic ולהגדיר זרימת rאכלתי ל14 מיליליטר / דקה. מאפשר לדם למלא את צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם המחלף פתוח, להסיר את מחבר כניסה-לשקע ריאות הזמנית. צרף את עורק הריאה וצינורית פרוזדורי שמאל לכניסת הריאות ולשקע, בהתאמה. ודא שאין בועות אוויר בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הצינורית לקנה הנשימה למתמר לחץ שלישי (P23XL). לנפח את הריאות בחמצן 30% באמצעות הצינורית לקנה הנשימה ולשמור על לחץ ב5 סנטימטר H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את המחלף עם מהדק להתחיל זלוף ריאות. לשמור על עורק ריאה ולחצי פרוזדורי שמאל ב ~ 10 ו3 ס&quot;מ H 2 O, בהתאמה. </li></ol> 4. הכנת ריאות לכלי דם עירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את חלקו האחורי של צינור הארכה לקטטר מעל לרמה של הריאות ומאובטחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צנתר עירוי על ידי הוספה כ 30 סנטימטר של צינורות PE10 ארוכים 40 סנטימטר לתוך צינורות PE90 ~ ארוכים 30 סנטימטר. חבר את הקצה החשוף של צינורות PE10 למחט (30 G) בשעהtached למזרק (1 סמ&quot;ק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את שילוב קטטר לתוך חלק אחורי המורם של צינור הארכה. מדריך שילוב הצנתר דרך אטריום השמאל ולתוך הריאות עד שהוא פוגש את ההתנגדות. ואז, לדחוף את הקטטר PE10 לבד יותר לתוך הריאות עד שהוא פוגש את ההתנגדות. שים לב שהפעלת כוח מופרז בעת החדרת הצנתר תפגע הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את מזרק 1 סמ&quot;ק עם הפתרון של רינגר ולצרף למשאבת מזרק. הגדרת קצב עירוי ל10 μl / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר עירוי יהיה חיוור בהשוואה לשאר הריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללחלח את הריאות עם מי מלח ולכסות את הריאות בניילון עם חור גדול מספיק כדי לעזוב את אתר העירוי נחשף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוגית קצת שומן ברזלים על החלק התחתון של O-Ring (מחוייט) ומקום coverslip זכוכית (# 1.5, 22 קוטר מ&quot;מ) בחלק התחתון של טבעת O-. בעדינות עמדת O-הטבעת עם coverslip באתר העירוי. אבטח את O-הטבעת עם חול מבחנה סטנדרטידר. Coverslip / שילוב טבעת O לא לעוות את מבני מכתשיים מתחתיו, כפי שדיווח לאחרונה 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם אובייקטיבי (20X) של מיקרוסקופ פלואורסצנטי מעל O-Ring ולהתמקד על פני הריאות. </li></ol> 5. ההדמיה פלורסנט Dextran מעבר דרך microvessels <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המיקרוסקופ לתפרחת FITC ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור להיות צילם ולרכוש תמונות בשיעור של 1/minute באמצעות תוכנת רכישת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל עירוי של 20 KD FITC-dextran (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר) באמצעות משאבת המזרק. הקרינה בכלי דם תעלה בהדרגה ולהגיע למקסימום. המשך עירוי ל60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז לעבור לעירוי של רינגר כדי לשטוף את הקרינה של אור. לשמור על עירוי במשך 10 דקות. המשך רכישת תמונה ב1/min במהלך לשטוף-off. </li></ol> 6. ניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ תמונת רכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורי מקוםשל ריבית על פני microvessels בתוך מסגרת התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגן את קובץ תמונת מסגרת לפי מסגרת ולהקליט את עוצמת הקרינה בכל אזור של עניין לכל המסגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את השינוי בעוצמת הקרינה לכל אזור של עניין כפונקציה של זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את עוצמת הקרינה המרבית ואת עוצמת הקרינה שיורית לאחר 10 דקות של washoff. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את היחס מרבי לעוצמת הקרינה שיורית בכל אזור של עניין כדי לקבל את מדד החדירות לmicrovessels הקשורים לאזור זה של ריבית. </li></ol>

<ol>
	<li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).</li><li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).</li><li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury.">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).</li><li>Parthasarathi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+mediates+spread+of+Ca2+-dependent+proinflammatory+responses+in+lung+capillaries.">Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries.</a> J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).</li><li>Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Acid+instillation+by+a+wedged-catheter+method+reveals+a+role+for+vascular+gap+junctions+in+spatial+expansion+of+Acid+injury.">Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury.</a> Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).</li><li>Gorin, A. B., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+permeability+of+endothelial+and+epithelial+barriers+to+albumin+flux.">Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).</li><li>Boutoille, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice:+comparison+with+125I-albumin.">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).</li><li>Thorball, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-dextran+tracers+in+microcirculatory+and+permeability+studies+using+combined+fluorescence+stereo+microscopy,+fluorescence+light+microscopy+and+electron+microscopy.">FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy.</a> Histochemistry. 71, 209-233 (1981).</li><li>Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+molecular+heterogeneity+of+pulmonary+endothelial+cells.">Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells.</a> Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).</li><li>Ofori-Acquah, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+barrier+function+in+the+lung+reflects+diversity+in+endothelial+cell+junctions.">Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions.</a> Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+endothelium-mediated+leukocyte+retention+in+LPS-treated+lung+microvessels.">Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels.</a> Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+induces+endoplasmic+store+Ca2+-dependent+inflammatory+responses+in+lung+microvessels.">Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels.</a> PloS One. 8, (2013).</li><li>Qiao, R. L., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+barrier+properties+of+the+pulmonary+microvascular+bed.">Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed.</a> J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).</li><li>Parthasarathi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+connexin43+mediates+acid-induced+increases+in+pulmonary+microvascular+permeability.">Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).</li><li>Wu, Y., Perlman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+methods+for+assessing+alveolar+mechanics.">In situ methods for assessing alveolar mechanics.</a> J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).</li><li>Kuebler, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+signaling+mechanism+between+gas+and+blood+compartments+of+the+lung.">A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung.</a> Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הכנת הריאות המבודדת-perfused הדם בשילוב עם הדמיה בזמן אמת מספקת כלי פשוט לקביעת שינויים בחדירות microvessels ריאה אחת. אנחנו מוחלים בשיטה זו כדי להגדיר שינויי חדירות בתגובה לחליטות של LPS. הנתונים שלנו מראים בבירור כי עירוי LPS גרם לעלייה בחדירות כלי הדם. יתר על כן, הנתונים גם מצב?...

חדירות כלי הדם מוגברות לריאות מובילה להתפתחות של בצקת מכתשיים וחילוף גזים שנפרצו והוא מאפיין עיקרי של פגיעה חריפה ריאות (עלי) 1-3. לפיכך, הערכות של חדירות כלי דם חשובות בהגדרת היקף פציעת ריאות ויעילות של התערבויות טיפוליות מוצעים. ניתוח gravimetric כגון יחס דם ריאה בחינם רטוב ליבשים ומקדם סינון כלי הדם נמצא בשימוש נרחב בשיטות להעריך 4,5 חדירות. שיטות אחרות כוללות כימותי השמירה של בדיקות רדיואקטיביים או ניאון ברקמת הריאה 6-8. עם זאת, השיטות הנ&quot;ל דורשות עיבוד postexperiment של דגימות רקמת ריאה לכיוון הבהרת נתוני חדירות. יתר על כן, מאחר שבעל חיים אחד יכול לשמש רק לפרוטוקול טיפול יחיד, ייתכן שיהיו צורך מספרי חיה גדולים למחקר מלא. מאפיין משותף של השיטות הנ&quot;ל הוא שהם קובעים את חדירות כלי דם הממוצעת שלכל כלי הדם בדגימת הרקמה. עם זאת, הוא מבוסס היטב כי כלי מאקרו מיקרו וריאה שונים 9 phenotypically. לפיכך, תגובות חדירות עשויות להיות הטרוגנית בין המגזרים השונים, כמו גם כלי 9,10. לפיכך, כימות חדירות ממוצעת של כל כלי ריאתי בדגימת רקמה עשוי שלא משקפת באופן נאות את ההטרוגניות הזאת. בהכנת ריאות perfused דם המבודדת, ניתן דמיינו כלי דם על פני השטח הריאה על ידי מיקרוסקופ זקוף 4,11,12. זה מאפשר תגובות אפיון בכלי אחד, ולכן, פונה ההטרוגניות כל בתגובות 13. בנוסף לכך, על ידי ניצול דימות פלואורסצנטי של microvessels, ניתן לשלב מבחני הקרינה מבוססת. יתר על כן, microcatheter פרוזדורי שמאל יכול לשמש כדי לספק סוכנים ובדיקות הקרינה לכלי דם 11,14. Microcatheter מגביל את המשלוח לאזור ריאות קטן, ובכך לשעברפוזות רק את כלי דם באזור לסוכנים וfluorophores רוויי. זה מאפשר אזורים קטנים מרובים בתוך אותה הריאה שישמשו לניסויים נפרדים, מה שמוביל לירידה כוללת בבעלים החיים הנחוצים למחקר. הדמיה בזמן אמת מאפשרת לכידה של שינויים דינמיים בכלי דם וקרינת extravascular של microvessels היחיד של הכנת הריאות המבודדת. לכן, עבור כל דם קטן בתוך שדה תמונה, שינויים בקרינה במהלך העירוי של fluorophores וwashoff יכולים להיות מוקלטים, ולכמת מחובר 14. שימוש בערכים של הקרינה כלי דם המרבית ושייר, ניתן לקבוע מדד חדירות לכל דם קטן בתחום ההדמיה. כדי לקבוע שינויי חדירות בתגובה לסוכנים דלקתיים או פוגעניים, הסוכן הרצוי יכול להינתן ראשון ולאחר מכן מדד החדירות נקבע. בנוסף, שדה התמונה ניתן להגדיר בכל מקום באזור הריאות רווי ידיmicrocatheter, ובכך מאפשר רמה גבוהה של גמישות בבחירת רשת כלי הדם הרצויה. לכן, ההכנה המבודדת-perfused דם הריאה בד בבד עם הדמיה בזמן אמת מספקת מודל ניסיוני אטרקטיבי לכמת חדירות בmicrovessels ריאה אחת.

<table><tbody><tr><td>Tygon Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>#18</td></tr><tr><td>Pressure Transducer</td><td>Data Sciences International</td><td>P23XL</td><td>Need quantity 3</td></tr><tr><td>Butterfly Needle</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450081</td><td>21 G</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Cole Parmer</td><td>Masterflex L/S</td><td></td></tr><tr><td>PE-90 tubing</td><td>Becton Dickinson</td><td>427421</td><td>30 cm needed</td></tr><tr><td>PE-10 tubing</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td>40 cm needed</td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS8000</td><td></td></tr><tr><td>O-ring</td><td></td><td></td><td>Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure O-ring to holder</td></tr><tr><td>Upright fluorescence microscope</td><td>Olympus America</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>Image Acquisition Software</td><td>Molecular Devices</td><td>Metamorph</td><td></td></tr><tr><td>FITC Dextran 20KD</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Serotype 0111:B4</td></tr></tbody></table>

quantifying single microvessel permeability in isolated blood-perfused rat lung preparation

הכנת ריאות perfused דם המבודדת נעשתה שימוש נרחב כדי לחזות ולהגדיר איתות בmicrovessels אחת. על ידי צימוד הכנה זו עם הדמיה בזמן אמת, הוא הופך להיות אפשרי כדי להבחין בשינויים בחדירות microvessels ריאה בודד. במסמך זה אנו מתארים את שלבים לבודד את ריאות עכברוש וינקב אותם עם דם עצמי. לאחר מכן, אנו מתארים את צעדים להחדיר fluorophores או סוכנים באמצעות microcatheter לאזור ריאות קטן. שימוש בהליכים אלה תוארו, קבענו עליות חדירות בmicrovessels ריאות עכברוש בתגובה לחליטות של lipopolysaccharide חיידקים. נתוני המחקר מראה כי lipopolysaccharide מוגבר דליפת נוזל על פני שני מגזרי venular וmicrovessel נימים. לכן, שיטה זו מאפשרת להשוות בין מגזרי תגובות חדירות כלי דם ובכך, מגדיר את ההטרוגניות כל בתגובה. בעוד שיטות נפוצות המשמשות להגדרת חדירות ריאות דורשות postprocessing של דגימות רקמת ריאה,שימוש בהדמיה בזמן אמת מבטלת דרישה זו באה לידי ביטוי החל מהשיטה הנוכחית. לכן, הכנת הריאות המבודדת בשילוב עם הדמיה בזמן אמיתי מציעה מספר יתרונות על פני שיטות מסורתיות לקביעת חדירות כלי הדם ריאה, עדיין היא שיטה פשוטה כדי לפתח וליישם.

הכנת ריאות מבודדת-perfused דם המחובר לצינורות טפטוף והציוד נלווה מוצגת באיור 2. למטרות הדגמה, השתמשנו עכברוש ספראג Dawley, אם כי ההליכים המתוארים במסמך זה יכול לשמש עם כל מיני עכברים. חליטות דרך microcatheter פרוזדורי שמאל להגיע לאזור קטן בלבד של הריאות. האזור רווי יכול לה...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation at JoVE.com

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

הכנת ריאות perfused הדם המבודדת עושה את זה אפשרי לדמיין רשתות microvessel על פני הריאות. כאן אנו מתארים גישה לכמת חדירות של microvessels אחת ריאות מבודדות באמצעות דימות פלואורסצנטי זמן אמת.

כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

quantifying-single-microvessel-permeability-isolated-blood-perfused

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.4K Views.  The University of Tennessee Health Science Center.  הכנת ריאות perfused הדם המבודדת עושה את זה אפשרי לדמיין רשתות microvessel על פני הריאות. כאן אנו מתארים גישה לכמת חדירות של microvessels אחת ריאות מבודדות באמצעות דימות פלואורסצנטי זמן אמת. 

Video: Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Medicine

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ventilation. Up to now, the underlying mechanisms are not fully understood. The major vascular segment contributing to HPV is the intra-acinar artery. This vessel section is responsible for the blood supply of an individual acinus, which is defined as the portion of lung distal to a terminal bronchiole. Intra-acinar arteries are mostly located in that part of the lung that cannot be selectively reached by a number of commonly used techniques such as measurement of the pulmonary artery pressure in isolated perfused lungs or force recordings from dissected proximal pulmonary artery segments1,2. The analysis of subpleural vessels by real-time confocal laser scanning luminescence microscopy is limited to vessels with up to 50 &#181;m in diameter3.
We provide a technique to study HPV of murine intra-pulmonary arteries in the range of 20-100 &#181;m inner diameters. It is based on the videomorphometric analysis of cross-sectioned arteries in precision cut lung slices (PCLS). This method allows the quantitative measurement of vasoreactivity of small intra-acinar arteries with inner diameter between 20-40 &#181;m which are located at gussets of alveolar septa next to alveolar ducts and of larger pre-acinar arteries with inner diameters between 40-100 &#181;m which run adjacent to bronchi and bronchioles. In contrast to real-time imaging of subpleural vessels in anesthetized and ventilated mice, videomorphometric analysis of PCLS occurs under conditions free of shear stress. In our experimental model both arterial segments exhibit a monophasic HPV when exposed to medium gassed with 1% O2 and the response fades after 30-40 min at hypoxia.

Hypoxic pulmonary vasoconstriction (HPV) is an important physiological phenomenon by which at alveolar hypoxia lung perfusion is matched to ventilation. The major vascular segment contributing to HPV is the intra-acinar artery. Here, we describe our protocol for the analysis of HPV of murine pulmonary vessels with diameters of 20-100 &mu;m.

ניתוח וידאומורפומטרי של Vasoconstriction ריאתי היפוקסי של עורקים תוך ריאתי באמצעות מוריס דיוק לחתוך פרוסות ריאות

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. However, very few methods exist to date to investigate lung metastases in a dynamic fashion at the microcirculatory level, due to the difficulty to access the lung with a microscope. Here, an intravital microscopy method is presented to functionally image and quantify the microcirculation of superficial pulmonary metastases in rats, using a closed-chest pulmonary window and automated analysis of blood flow velocity and direction. The utility of this method is demonstrated to measure increases in blood flow velocity in response to pharmacological intervention, and to image the well-known tortuous vasculature of solid tumors. This is the first demonstration of intravital microscopy on pulmonary metastases in a closed-chest model. Because of its minimized invasiveness, as well as due to its relative ease and practicality, this technology has the potential to experience widespread use in laboratories that specialize on pulmonary tumor research.

A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

אוטומטי מדידה של microcirculatory זרימת דם ריאתי במהירות גרורות של חולדות

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured with independent control over pulmonary arterial flow rate, flow rate waveform, airway pressure and left atrial pressure. Pulmonary vascular resistance is calculated based on multi-point, steady pressure-flow curves; pulmonary vascular impedance is calculated from pulsatile pressure-flow curves obtained at a range of frequencies. As now recognized clinically, impedance is a superior measure of right ventricular afterload than resistance because it includes the effects of vascular compliance, which are not negligible, especially in the pulmonary circulation. Three important metrics of impedance - the zero hertz impedance Z0, the characteristic impedance ZC, and the index of wave reflection RW - provide insight into distal arterial cross-sectional area available for flow, proximal arterial stiffness and the upstream-downstream impedance mismatch, respectively. All results obtained in isolated, ventilated and perfused lungs are independent of sympathetic nervous system tone, volume status and the effects of anesthesia. We have used this technique to quantify the impact of pulmonary emboli and chronic hypoxia on resistance and impedance, and to differentiate between sites of action (i.e., proximal vs. distal) of vasoactive agents and disease using the pressure dependency of ZC. Furthermore, when these techniques are used with the lungs of genetically engineered strains of mice, the effects of molecular-level defects on pulmonary vascular structure and function can be determined.

The following protocol outlines the process of isolating, ventilating and instrumenting mouse lungs to measure steady or pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships in order to quantify the effects of blood flow, airflow, airway changes and vascular changes on right ventricular afterload.

אפיון מבודד, מאוורר ריאות, instrumented ועכבר perfused עם תזרים pulsatile

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

Shunt Surgery, Right Heart Catheterization, and Vascular Morphometry in a Rat Model for Flow-induced Pulmonary Arterial Hypertension

In this protocol, PAH is induced by combining a 60 mg/kg monocrotalin (MCT) injection with increased pulmonary blood flow through an aorto-caval shunt (MCT+Flow). The shunt is created by inserting an 18-G needle from the abdominal aorta into the adjacent caval vein. Increased pulmonary flow has been demonstrated as an essential trigger for a severe form of PAH with distinct phases of disease progression, characterized by early medial hypertrophy followed by neointimal lesions and the progressive occlusion of the small pulmonary vessels. To measure the right heart and pulmonary hemodynamics in this model, right heart catheterization is performed by inserting a rigid cannula containing a flexible ball-tip catheter via the right jugular vein into the right ventricle. The catheter is then advanced into the main and the more distal pulmonary arteries. The histopathology of the pulmonary vasculature is assessed qualitatively, by scoring the pre- and intra-acinar vessels on the degree of muscularization and the presence of a neointima, and quantitatively, by measuring the wall thickness, the wall-lumen ratios, and the occlusion score.

This protocol describes a surgical procedure to create a model for flow-induced pulmonary arterial hypertension (PAH) in rats and the procedures to analyze the principle hemodynamic and histological end-points in this model.

כירורגיה שאנט, צנתור לב ימני, וכלי הדם Morphometry במודל חולדה עבור נגרמת זרימה ריאתי עורקי יתר לחץ דם

In this protocol, PAH is induced by combining a 60 mg/kg monocrotalin (MCT) injection with increased pulmonary blood flow through an aorto-caval shunt ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Isolated Lung Perfusion System in the Rabbit Model

The isolated lung perfusion system has been widely used in pulmonary research, contributing to elucidate the lungs&#39; inner workings, both micro and macroscopically. This technique is useful in the characterization of pulmonary physiology and pathology by measuring metabolic activities and respiratory functions, including interactions between circulatory substances and the effects of inhaled or perfused substances, as in drug testing. While in vitro methods involve the slicing and culturing of tissues, the isolated ex vivo lung perfusion system allows to work with a complete functional organ making possible the study of a continuous physiological function while recreating ventilation and perfusion. However, it should be noted that the effects of the absence of central innervation and lymphatic drainage still have to be fully assessed. This protocol aims to describe the assembly of the isolated lung apparatus, followed by the surgical extraction and cannulation of lungs and heart from experimental lab animals, as well as to display the perfusion technique and signal processing of data. The average viability of the isolated lung ranges between 5-8 h; during this period, the pulmonary capillary permeability increases, causing edema and lung injury. The functionality of preserved pulmonary tissue is measured by the capillary filtration coefficient (Kfc), used to determine the extent of pulmonary edema through time.

The isolated rabbit lung preparation is a gold standard tool in pulmonary research. This publication aims to describe the technique as developed for the study of physiological and pathological mechanisms involved in airway reactivity, lung preservation, and preclinical research in lung transplantation and pulmonary edema.

מערכת זלוף ריאות מבודדת במודל הארנב

The isolated lung perfusion system has been widely used in pulmonary research, contributing to elucidate the lungs&#39; inner workings, both micro and ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video