<p class="jove_content"&gt; RN מומן בחלקו על ידי מענקי Marie Curie שילוב מחדש אירופי (ERG) מתכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי, מספר פרויקט 268,324.</p&gt;

1. בידוד של PMNs דם אנושי על ידי צנטריפוגה הצפיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר 5 9 צינורות מ&quot;ל של דם ורידי heparinized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Ficoll הדרגתיים שכבה כפולה (4 הדרגתיים לדם 5 צינורות) באופן הבא: יוצקים 12 מ&quot;ל של פתרון צפיפות 1.119 גרם / מיליליטר Ficoll בצינור 50 מ&quot;ל ובזהירות שכבה 10 מ&quot;ל של פתרון צפיפות 1.077 גרם / מיליליטר Ficoll על העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הדם עם נפח שווה של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת הדם המדולל בזהירות על שיפוע Ficoll השכבה הכפול; 20-25 מ&quot;ל לשיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 20 דקות ב 396 XG ברוטור נדנוד דלי, 22 ° C ללא בלימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן RPMI קר המכיל 0.05% אנוש סרום אלבומין (RPMI-HSA). כמו כן להכין מיליליטר סטרילי deionized H 2 O. 9 טרום מגניב גם RPMI וH 2 O על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את השכבה העליונה המכילה Ficoll פלזמה (בצבע צהוב) וPBMC, והשכבה השנייה של Ficoll (בצבע לבן) עם השימוש במשאבת ואקום (לשים על קצה פיפטה סטריליתפיפטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את PMNs בצינורות 50 מ&quot;ל באמצעות פיפטה פלסטיק קטנה (צינור 1 לשברי PMN של כל 2 הדרגתיים), ומניח אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף קר RPMI-HSA להיקף כולל של 50 מ&quot;ל ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 249 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את supernatant עם השימוש במשאבת ואקום ומערבולת גלולה בעדינות (אריתרוציטים וPMNs). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף H 2 O deionized סטרילי מ&quot;ל 9 ולהתחיל את הטיימר. לעצור את ההלם האוסמוטי Hyper אחרי 30 שניות בדיוק, על ידי הוספת 1 מ&quot;ל 10 פעמים PBS המרוכז. הערה: 30 שניות הן קריטיות מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף קר RPMI-HSA להיקף כולל של 50 מ&quot;ל ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 249 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את supernatant עם השימוש במשאבת ואקום ולאסוף את כדור PMN בצינור 1 עם נפח מוגדר (1-2 מ&quot;ל) RPMI-HSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכמות של תאים ולהתאים את הריכוז ל1.10 7 תאים / מ&quot;ל. בהתאם לתורם, התשואה של PMNs מבודד תהיה betwex 10 6 ו 3 10 7 PMNs en 5 x מצינור כל מ&quot;ל של דם 9 </li></ol> 2. Assay תזרים cytometric להערכה של גיוס הסיד בPMNs אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי עומס (5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל) עם 2 מיקרומטר Fluo-3-AM בRPMI-HSA ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר נדנדה לאט, באמצעות למשל נדנדה פלטפורמה שייקר, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים להכין דילול סדרתי (למשל פי 3) של הגירוי בריכוז הסופי 10x. PSMα3 נעשה שימוש בפרוטוקול זה, אך כל גירוי GPCR הפועל על נויטרופילים מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מעכב מרוכז 10x של הקולטן בRPMI-HSA. כאשר המעכב פועל על הגירוי (HDL למשל בPSMα3) גירוי μl מראש דגירה 25 עם נפח שווה של מעכב למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים על ידי הוספת 10 מ&quot;ל של RPMI-HSA ו צנטריפוגות במשך 249 XG בטמפרטורת חדר. תאי Resuspend עד 5 X10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגע לפני הניסוי, לדלל את התאים ל2x10 6 תאים / מ&quot;ל בRPMI-HSA ולהוסיף 200 תאי μl לכל צינור FACS. PMNs המדולל הם מאוד שבירים. שמירה על אותם זמן רב מדי בריכוז זה תוביל להפעלה אוטומטית; אותו מחזיק לטלטול נמרץ או pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את הצינור לcytometer הזרימה, לחכות 3 שניות ולהתחיל רכישה. לאחר פרק זמן קבוע (לדוגמא 8 שניות), תוריד את הצינור במהירות ולהוסיף 50 גירוי μl למדגם. מייד לצרף מחדש את הצינור על בעל המדגם ולהמשיך ברכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם סוף הנמוך ביותר ועם הריכוז הגבוה ביותר של גירוי. שטוף את מחט זרימת cytometer באופן קבוע אחרי כל סיבוב עם RPMI-HSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נתונים עם תוכנת ניתוח cytometry זרימה. השווה את אות הקרינה הממוצעת לפני תוספת של הגירוי לכי לאחר תוספת של הגירוי ולהשתמש בפקדים החיוביים ושליליים המתאימים כדי לחשב את ACכוח tivation עבור כל דילול שנמדד. </li></ol> לחלופין, כאשר המעכב פועל על קולט מראש דגירה תאים עם המעכב. 3. ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הביטוי של GFP חיידקים לאחר phagocytosis ידי PMNs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ס זני סטפילוקוקוס המכילים מבנה כתב עניין במשך הלילה במרק (עם אנטיביוטיקה כאשר נדרשים לשמור על כתב פלסמיד). במקרה זה מתח MW2 המכיל משמש מבנה כתב GFP PSMα 10, גדל בצינור פלסטיק 50 מ&quot;ל עם 5 מ&quot;ל של מדיום תרבות LB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את כל GFP מביטוי O / N, לדלל את התרבויות לOD 660 0.01 ולגדול לקוטר חיצוני 0.1 660. Redilute 01:30 תרבות זו, ולעקוב אחר צמיחה עד התרבות מגיעה OD 660 של 0.1. לאסוף את החיידקים על ידי צנטריפוגה ולשטוף פעם בDPBS. Resuspend ב1:10 הנפח המקורי כדי להשיג 660 OD של 1.0 או rקירוב 5.10 8 CFU / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את החיידקים (1.10 7 / מ&quot;ל) עם PMNs המבודדים טרי (1.10 6 / מ&quot;ל) בRPMI-HSA (יחס 10:01) בmicrotube 1.5 מ&quot;ל ולהוסיף סרום אנושי ונקווה לריכוז סופי של 10%. לנער על פלטפורמה רועדת במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לעורר phagocytosis. לדלל את PMNs עמוסי חיידקים ל5.10 5 PMNs / מ&quot;ל וμl פיפטה 250 לתוך באר של להחליק את מכסה קבורים גם 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תדמית PMNs עם חיידקים במיקרוסקופ. מיקרוסקופ ההפוכה מצוידות אובייקטיבי NA 40X/0.85 עובדת טוב וצריכה להיות עטוף בתא סביבה חשוך כדי לשמור על הסביבה ביציבות על 37 ° C. לרכוש תמונות למספר התפקידים מוגדרים מראש באמצעות המצלמה בכל 5-10 דקות בשניהם בשדה הבהיר וערוץ ה-GFP לעקוב ייצור ה-GFP בזמן. </li></ol>

<ol>
	<li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections.">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils.">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li><li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus.">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li><li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557 (2010).</li><li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus:+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic.">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li><li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus.">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7, 463 (2010).</li><li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+(FPRL1)+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+(FPRL1+inhibitory+protein)+that+inhibits+FPRL1+and+FPR.">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li><li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1.">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li><li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus,+a+bacterial+antiinflammatory+agent.">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles.">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination:+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages.">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409 (2008).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis.">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , (2013).</li><li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System:+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus.">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150 (2008).</li><li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo.">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בשיטות שתוארו כאן כמה צעדים הם מאוד קריטיים. אנו ידגישו אלה כאן. לבידודה של נויטרופילים ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות זה חשוב לא להפריע לשכבות במהלך או לאחר את צעדי צנטריפוגה. כאשר aspirating את הנויטרופילים באמצעות פיפטה פלסטיק, לוודא ש...

נויטרופילים (PMNs) הם phagocytes המקצועי שמשחקים תפקיד מפתח בתגובה החיסונית המולדת נגד Staphylococcus aureus 1. המאבק המתמיד בין מארח והחיידק הוביל למירוץ חימוש של שניהם. לאחרונה, קהילה הקשורים (CA) זנים של meticillin עמיד ס aureus (MRSA) צמחו נראה שכדי להיות יעיל מאוד בעקיפה של נויטרופילים הרג 2,3. ייצור יתר פנול מסיס modulin (PSMs) של CA-MRSA נקשר עם ארסיות גבוהה יותר 4,5. נויטרופילים אדם יכולים לזהות PSMs אלה באמצעות FPR2 אשר להוביל להפעלה של ה-G-חלבון זה יחד 6 קולט. אחד האירועים הראשונים הוא ההתגייסות של חנויות תאיות של סידן (Ca 2 +). Ca 2 + משמש כשליח משני עבור מגוון רחב של פונקציות, כולל מפעיל של PMNs degranulation וphagocytosis 7. לכן Ca 2 + הוא אינדיקטור רגיש מאוד שליכולת התפקודית של PSMs להפעיל PMNs. כדי לחקור את ההשפעות של PSMs על נויטרופילים, נויטרופילים טריים מבודדים ועמוסים בצבע, כי מאיר על גיוס סיד. בניסוי זרימת cytometry ניתן למדוד התגייסות מהירה זה. באמצעות שיטה זו, ניתן ללמוד את ההשפעות הישירות של רעילים ורכיבים אחרים על נויטרופילים, ולקבוע את הריכוז הנמוך ביותר שבם הם פעילים. עבורנו, זה הוא כלי שימושי מאוד כדי לחקור את ההשפעה של חלבונים רבים המיוצרים על ידי ס aureus מעורב בהעלמה חיסונית, כגון חלבון מעכב FPR2 (FLIPr) 8, FLIPr כמו 7, וחלבון מעכב Chemotaxis של סטפילוקוקוס (שבבים) 9. כל החלבונים האלה הוכחו לעכב את גיוס הסיד בנויטרופילים באמצעות קשירה לקולט הכרת אגוניסט. לאחרונה, הקבוצה שלנו שתארה PSMs תפקודי מעוכבת על ידי יפופרוטאין בסרום 10 &lt;/ Sup&gt;. יפופרוטאינים אלה הם שפע נוכחי בתוך הדם והרקמה אנושית, מה שמעיד שPSMs להפעיל את תפקידם בעיקר בסביבה תאית. הזמינות של assay גיוס הסיד אפשרה לנו למדוד את ההשפעה של ליפופרוטאין בסרום דווקא על הפעלה של נויטרופילים ידי PSMs, שמסומנת על ידי העיכוב הניכר בריכוזים נמוכים מאוד של סרום. מאז PSMs תפקודי מעוכבים על ידי סרום, שערנו כי יש תפקיד חשוב לPSMs כרעלים תאיים. לכן אנו מבקשים לקבוע את תפקידו של PSMs לאחר phagocytosis. כדי לחקור את הביטוי של PSMs במרחב אינטר, בנינו fusions הכתב של האמרגן של אופרון psmα ל-GFP. כשכתב זנים אלה של ס &#39; aureus היה phagocytosed ידי נויטרופילים, האינדוקציה של ביטוי הייתה להבחין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 10. ברור, זה טקhnique מאפשר הלימוד של הביטוי של מספר רב של גנים בס aureus או פתוגנים אחרים לאחר phagocytosis. מאחר לס aureus לשרוד בנישה בין התאית הוא מאוד חשוב כדי להתגבר על מערכת החיסון המולדת 11 10 12, לומד את התפקיד של גנים מופעלים בנישה זו היא רלוונטי ביותר להבנת ביטוייה שונים.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3, AM</td>
			<td>Molecular Probes / Life Technologies</td>
			<td>F-1241</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5442-03</td>
			<td>density 1.077 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11191</td>
			<td>density 1.119 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>contains 25 mM HEPES and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, The Netherlands</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td>objective: HCX PL APO 40X/0.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy

אנו מציגים שיטות כדי לחקור את ההשפעה של modulins פנול מסיס (PSMs) ורעלים אחרים המיוצר ומופרש על ידי סטפילוקוקוס על נויטרופילים. כדי לחקור את ההשפעות של PSMs על נויטרופילים אנחנו מבודדים נויטרופילים טריים באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות. נויטרופילים אלה נטענים עם צבע שמאיר על גיוס סיד. ההפעלה של נויטרופילים ידי PSMs יוזמת גידול מהיר וחולף בריכוז הסידן התוך התאי ללא תשלום. בניסוי זרימת cytometry התגייסות מהירה זו ניתן למדוד על ידי ניטור הקרינה של צבע טעון מראש שמגיב לריכוז המוגבר של Ca 2 + ללא תשלום. באמצעות שיטה זו אנו יכולים לקבוע את ריכוז PSM הצורך להפעיל נויטרופילים, ולמדוד את ההשפעות של מעכבים ספציפיים וכלליים של הפעלת נויטרופילים. כדי לחקור את הביטוי של PSMs במרחב תאי, Wדואר בנה fusions הכתב של האמרגן של אופרון PSMα ל-GFP. כשכתב זנים אלה של ס &#39; aureus הם phagocytosed ידי נויטרופילים, יכולה להיות שנצפה האינדוקציה של ביטוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

assay תזרים cytometric להערכה של גיוס הסיד בPMNs אדם דוגרים נויטרופילים עם סדרת ריכוז PSMα3 סינטטי וכתוצאה מההפעלה מהירה כפי שהיא נמדדת על ידי שטף סידן, המוצג על ידי גידול באות בFL-1. טרום דגירה של PSMα3 הסינטטי עם 0.01%, 0.1% או 1% בסרום אנושי עכבות היכ?...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy at JoVE.com

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

אנו מציגים שיטות כדי לחקור את ההשפעה של PSMs ורעלים אחרים המופרשים על ידי<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; בנויטרופילים באמצעות cytometry הזרימה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי.

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

studying-interactions-staphylococcus-aureus-with-neutrophils-flow

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

13.0K Views.  University Medical Center Utrecht. אנו מציגים שיטות כדי לחקור את ההשפעה של PSMs ורעלים אחרים המופרשים על ידי סטפילוקוקוס בנויטרופילים באמצעות cytometry הזרימה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Video: Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1 Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached to a surface.2 Biofilm formation and development are commonly studied in the laboratory using batch systems such as microtiter plates or flow systems, such as flow-cells. These methodologies are useful for screening mutant and chemical libraries (microtiter plates)3 or growing biofilms for visualization (flow cells)4. Here we present detailed protocols for growing Staphylococcus aureus in two additional types of flow system biofilms: the drip flow biofilm reactor and the rotating disk biofilm reactor.
Drip flow biofilm reactors are designed for the study of biofilms grown under low shear conditions.5 The drip flow reactor consists of four parallel test channels, each capable of holding one standard glass microscope slide sized coupon, or a length of catheter or stint. The drip flow reactor is ideal for microsensor monitoring, general biofilm studies, biofilm cryosectioning samples, high biomass production, medical material evaluations, and indwelling medical device testing.6,7,8,9
The rotating disk reactor consists of a teflon disk containing recesses for removable coupons.10 The removable coupons can by made from any machinable material. The bottom of the rotating disk contains a bar magnet to allow disk rotation to create liquid surface shear across surface-flush coupons. The entire disk containing 18 coupons is placed in a 1000 mL glass side-arm reactor vessel. A liquid growth media is circulated through the vessel while the disk is rotated by a magnetic stirrer. The coupons are removed from the reactor vessel and then scraped to collect the biofilm sample for further study or microscopy imaging. Rotating disc reactors are designed for laboratory evaluations of biocide efficacy, biofilm removal, and performance of anti-fouling materials.9,11,12,13

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Protocols for utilizing open system flow biofilms with drip flow reactors and rotating disk reactors are presented in detail.

השימוש זרימה טפטוף ו כורים דיסק סיבוב עבור Staphylococcus aureus Biofilm ניתוח

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the United States. Among soft-tissue infections, myositis, pyomyositis, and necrotizing fasciitis have been increasingly reported in association with MRSA arising from the community. To understand the interplay between MRSA and host immunity leading to more severe infection, the availability of animal models is critical, permitting the study of host and bacterial factors. Several infection models have been introduced to assess the pathogenesis of S. aureus during superficial skin infection. Here, we describe a subcutaneous infection model that examines the skin, subcutaneous, and muscle pathologies.

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Murine skin and soft tissue infection model is utilized for assessing the virulence function of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the host immunological responses. Here, we presented a subcutaneous infection model for skin and soft tissue infection.

זיהום תת עורי של סטפילוקוקוס אוראוס עמיד Methicillin (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

פשוט ויעילה שיטה לגילוי הפעלת פקטור גרעינית בנויטרופילים אדם על ידי זרימת cytometry

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

genotyping של<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; על ידי ריבוזומלי Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

מתודולוגיה לחקר ההעברה האופקית ג&#39;ין<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

בידוד, אפיון, טיהור של מקרופאגים רקמות מושפעות על ידי דלקת הקשורות להשמנת יתר

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

חקר אינטראקציות של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video