המחברים מבקשים להודות לגב &#39;אלכסיה סונדרס וגב&#39; מישל McPhedran לסיוע ניסיוני; גב &#39;הלן פנג עבור ייצור אלקטרודה, ד&quot;ר פני אלן ד&quot;ר יונתן וYeoh לסיוע כירורגית; צוות של העין ואוזן הוויקטוריאני המלכותית של בית החולים ביולוגיים מרכז מחקר לטיפול בבעלי החיים, פרופ &#39;רוב שפרד להדרכה כללית בכל רחבי; וד&quot;ר Bryony Nayagam ומר רונלד ליונג להערות ביקורתיות על טופס טיוטה של ​​כתב היד. עבודה זו בוצעה במכון Bionics ובית החולים סנט וינסנט, מלבורן. מימון ניתן על ידי קרן איאן פוטר, הנאמנויות בג&#39;ון ריד T הצדקה, והמועצה למחקר האוסטרלי באמצעות היוזמה המחקר המיוחדת שלה במענק הטכנולוגיה מדע הביוני חזון וראייה לביוני אוסטרליה (בוא). Bionics המכון מכיר בתמיכה שהיא מקבלת מהממשלה ויקטוריאני באמצעות תכנית התמיכה בתשתית התפעולית שלה.

1. Enucleation ולאחר קיבוע פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה כי הנושא כבר מושתל באופן חד צדדי עם מערך אלקטרודות suprachoroidal. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות postfix להכין בבקבוקי זכוכית שוט. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון מקבע של דוידסון, 2x 100 מ&quot;ל <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מיליליטר פורמלין (37% פורמלדהיד) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומצה אצטית קרחונים 10 מ&quot;ל (99.7%) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 35 מ&quot;ל אתנול (98%) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים מזוקקים 53 מ&quot;ל </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50% אתנול, 2x 100 מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70% אתנול, 2x 100 מ&quot;ל </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transcardially perfuse נושא עם חמימים (37 מעלות צלזיוס) מלח heparinized ואחריו קר (4 מעלות צלזיוס) ניטראלי שנאגרו פורמלין (10%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור את התפרים בימבוס מעולה (או מיקום שהוא רחוק ממערך suprachoroidal) של שתי העיניים - בקנה אחד עם שריר Rectus, לשמש כנקודת ציון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיני Enucleate, שמירה על כל הפניות חיצוניות מהעין המושתלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח EACשעות העין ב100 מ&quot;ל של הפתרון מקבע של דוידסון ולהשאיר לפוסט לתקן בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 18-36 שעות במקבע של דוידסון, להעביר לאתנול 50% (טמפרטורת חדר) עבור 6 - 8 שעות, ולבסוף לאתנול 70% (טמפרטורת חדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרר דגימות על 4 מעלות צלזיוס ובחנות עד לנתיחה. </li></ol> גלובס עיניים תמימים והדחוס כבר מאוחסן באופן זה לתקופה של עד 3 חודשים, מבלי להשפיע לרעה על תוצאת היסטולוגיה. 2. זיהוי ומיפוי רקמות פרוטוקול הקיבעון לעיל (שלב 1) הפך את לובן העין השקופה והמערך הוא כעת גלוי - לרבות באתרי אלקטרודה הבודדים (איור 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העולם המושתל מאתנול ולקצץ משם בזהירות רקמה עודפת, כולל הלחמית והכמוסה של המחבר. חתוך עצב ראייה ל2 - 3 מ&quot;מ אורך (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות צבע מרקין היסטולוגיתגרם תכנית, תווית את האלקטרודות עם קוד צבע מוגדר מראש, נזהרת שלא להכתים את הצבע. </li></ol><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו בחרנו חבילה זמינה מסחרי של צבע היסטולוגית מיוחד (ראה נספח). כמויות קטנות של הצבע יושמו בזהירות עם מברשת צבע קנס היטה (גודל Roymac 00) לרקמות ואפשרו לייבוש באוויר לתקופה של עד 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לענייננו, יש לנו נבחרו: ירוק לאלקטרודה הפעילה (ים) שהייתה (היו) מגורה מקסימאלי, ברמות suprathreshold, למשך תקופת המחקר; אדום עבור אלקטרודות פעילה אחרות; צהוב על האלקטרודות תשואת הקוטר גדולה יותר, ו כחול למדריכים ו / או סימנים למרחקים אנטומיים (איורים 3 ב ו 3 ג) נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסוי והטעייה חלקם עשויים להידרש כדי למצוא צבע שהוא יציב לאורך כל השלבים הבאים. לדוגמה, באיור 4, ניתן לראות שהצבע הירוק היה עמיד יותר מהצבע האדום. דילול הצבע ב 70% אתנול מסייע לשפר penet שומנים בדםמנה וציפוי רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה שימושי לשרטט או לצלם את העולם הצבוע לשימוש עתידי. </li></ul><ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל 70% אתנול לייבש את הצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.1 לגלובוס שליטת unimplanted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתפרים מהשלב 1.3, ליישר את העין השליטה ועין המושתלת כזוג שיקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בתבנית סיליקון (עם אותם הממדים כמו המערך אלקטרודות) במיקום השיקוף על העין השליטה כמו השתל ממוקם בעין המושתלת (נ.ב. בלובן עין השקוף וסימוני הצבע מהשלב 2.2 לאפשר הדמיה מוכנה של מערך העמדה המושתלת ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים 2.2 ו -2.3 לעין השליטה, כך שכל אתר האלקטרודה מושתל יש זוג שליטה במיקום אנטומית דומה (כלומר המראה המתאים שווה ערך). </li></ol> 3. נתיחה והטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מערך השתל מהעין ולהסיר את החלק הקדמי של העין(כולל קרנית, קשתית העין ועדשה). הסר את נוזל זגוגית העין מהכוס הנותרת (קאמרי אחורי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העין המושתלת לרצועות יציגים מרובות (~ 2 מ&quot;מ עובי) המכיל כל אחד מהם קבוצת משנה של אזורי הצבע המסומנים (איור 3D). שים לב שהנטייה של הרצועות צריכה להיות שנבחרה כדי לסייע בהערכת היבטים שונים של תגובת הרקמות לשתל 7. </li></ol> זה שימושי, לשימוש עתידי, כדי להפוך את שיא של אזורי שצבע נמצאים בכל רצועה ומיקומים היחסיים שלהם (וצבעים). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרצועה על צדו לתוך בריכת רדודה של אגר הנוזלי (4%; 80 - 90 מעלות צלזיוס) עם הצד להיחתך פונה כלפי מטה ראשון (איור 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאגר קבע, לחתוך סביב הדוגמא והמקום לקלטת רקמה נתמכת על ידי מוסיף קצף (איור 3F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1-3.3 לעין השליטה - takטיפול ing לנתח בהתאמת מראה רצועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את כל הקלטות באמצעות טכניקת עיבוד פרפין הסטנדרטי (אוטומטית לילה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ רקמת מעובד בפרפין עם הצד להיות לחתוך כלפי מטה מול ראשון. </li></ol> 4. חיתוך וצביעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים לקוביות פרפין 5 סעיפים המתייחסים באופן קבוע מיקרומטר לביאורים מהשלבים 2 ו -3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף חלקים מכל אחד מאזורים הצבועים והר בשקופיות. </li></ol> כעת ניתן להעריך את האזור מייד בסמוך לכל נקודה צבועה של לובן העין בביטחון שזה היה בקרבה הקרובה ביותר לאלקטרודה המקבילה במערך (איור 4). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם או לבצע immunofluorescence המועדפים. כתמי דוגמה ואימונוהיסטוכימיה מוצגות באיור 5 הם: H &amp;E; Luxol המהיר כחול (LFB); סגול cresyl; Trichrome הכחול של האסון; החומצה שיף התקופתי (PAS); כחול הפרוסים sta &#39;פרלסב; synthetase אנטי גלוטמין (GS); חלבון אנטי neurofilament (NF); חלבון אנטי גליה fibrillary חומצי (GFAP) ו4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתמים רגילים ומיוחדים בוצעו כמפורט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעת H &amp; E בוצעה לפי הפרוטוקול המסופק על ידי לייקה multistainer אמבטיה מערך ST5020 (לייקה Biosystems). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגולה LFB וcresyl (שונה מ11): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dewax ב3 שינויים של קסילן (2 דקות 3x) ו -2 שינויים של אתנול (100%, 100%) (2x 1 דקות) ולשטוף במים ברז (45 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי מימה עד 95% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בפתרון LFB 11 ב 37 - 42 מעלות צלזיוס (לילה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את עודפי כתם עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ביתיום קרבונט לדלל (8%) (כמה שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבדיל באתנול 70% (כמה שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על צעדים ל4.4.2.6 4.4.2.8, במידת צורך, עד שבackground הוא חסר צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בפתרון עובד אצטט סגול cresyl על 37 מעלות צלזיוס (10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין לשטוף במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליבש ב3 שינויים של אלכוהול מוחלט (1x 30 שניות, 2x 20 שניות) ו3 שינויים של קסילן (1x דקות 30 שניות 1, 2x דקות 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר וcoverslip עם dpx. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של אסון Trichrome הכחול (שונה מ11): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dewax לפי 4.4.2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא חלקים למים (2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם הגרעינים באמצעות ברזל haematoxylin של Weigert (2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במים ברז, יש לשטוף במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם בתמיסת fuchsin ארגמן חומצת Biebrich (5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבדיל בחומצה phosphomolybdic-phosphotungstic עד קולגן הוא ורוד בהיר (6 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain באנילין הכחול (1 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב ב1% חומצה אצטית (1 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים, הר וcoverslip כעמ &#39;אה 4.4.2.12 ו4.4.2.13. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PAS (שונה מ11): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dewax לפי 4.4.2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמצן ב1% חומצה תקופתית (15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במים זורמים ואז מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם במגיב של שיף (15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במים (5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain עם האריס haematoxylin דקות (1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לשטוף במים ברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבדיל ב0.5% אלכוהול חומצה (מח&quot;ש 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב במים ברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכחול במים ברזו של סקוט (1 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים, הר וcoverslip לפי 4.4.2.12 ו4.4.2.13. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &#39;פרלס הפרוסי כתם כחול כפי שמתואר ב11. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים immunofluorescence בוצע כמפורט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dewax לפי 4.4.2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף במים מזוקקים (2x 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע אחזור אנטיגן באמצעות 0.01% חיץ ציטרט, 6 pH ב 75 - 80 ° C (20 דקות)ד להתקרר ב0.01% פתרון חיץ ציטרט (20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים לשטוף בופר פוספט (PBS) (2x 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize קרום התא בפתרון חיץ לשטוף (10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בפתרון לחסום סרום (2 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפים בנוגדן ראשוני חד דילול במדלל נוגדנים (% serum/0.1 עז נורמלי טריטון X-100/PBS 10%) (הלילה במקרר). Titre של כל נוגדן ראשוני משמש מוצג בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה הלילה, לשטוף את החלקים בפתרון חיץ לשטוף (3 דקות 5x). מנקודה זו ואילך, לשמור על חלקים בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפים בנוגדנים משני המקביל בtitre של 1:500 לזמן מסוים (ראה טבלת מס &#39;1 לפרטים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים בפתרון חיץ לשטוף (5 דקות 3x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפים בDAPI (1:25,000 / PBS) (30 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים בפתרון חיץ לשטוף (5 דקות 3x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההר וcoverslip באמצעות לזרוחתקשורת הרכבה NT. </li></ol></li></ol> דגימות בדיקה ודגימות בקרה מוכנות להשוואת pairwise.

<ol>
	<li>Santos, A., Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+the+inner+retina+in+retinitis+pigmentosa.">Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa.</a> Arch. Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).</li><li>Humayun, M. S., Weiland, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+perception+in+a+blind+subject+with+a+chronic+microelectronic+retinal+prosthesis.">Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis.</a> Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).</li><li>Roessler, G., Laube, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiographic+findings+folowing+tack+fixation+of+a+wireless+epiretinal+retina+implant+device+in+blind+RP+patients.">Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).</li><li>Chow, A. Y., Chow, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+artificial+silicon+retina+microchip+for+the+treatment+of+vision+loss+from+retinitis+pigmentosa.">The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa.</a> Arch. Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).</li><li>Zrenner, E., Bartz-Schmidt, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+electronic+chips+allow+blind+patients+to+read+letters+and+combine+them+to+words.">Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words.</a> Proc. R. Soc. B. 278, 1489-1497 (2011).</li><li>Fujikado, T., Kamei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+of+semichronically+implanted+retinal+prosthesis+by+suprachoroidal-transretinal+stimulation+in+patients+with+retinitis+pigmentosa.">Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4726-4733 (2011).</li><li>Villalobos, J., Allen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+surgical+approach+for+a+wide-view+suprachoroidal+retinal+prosthesis:+evaluation+of+implantation+trauma.">Development of a surgical approach for a wide-view suprachoroidal retinal prosthesis: evaluation of implantation trauma.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 250, 399-407 (2012).</li><li>Latendresse, J. R., Warbittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+testes+and+eyes+using+a+modified+Davidson's+fluid:+comparison+with+Bouin's+fluid+and+conventional+Davidson's+fluid.">Fixation of testes and eyes using a modified Davidson's fluid: comparison with Bouin's fluid and conventional Davidson's fluid.</a> Toxicol. Pathol. 30, 524-533 (2002).</li><li>Agrawal, R. N., He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+proliferative+vitreoretinopathy.">In vivo models of proliferative vitreoretinopathy.</a> Nat. Protoc. 2, 67-77 (2007).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 233, 366-370 (1995).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histological techniques. , (2008).</li><li>Horobin, R. W., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Troubleshooting histology stains. , (1998).</li><li>Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamante+in+some+retinal+neurons+is+derived+solely+from+glia.">Glutamante in some retinal neurons is derived solely from glia.</a> Neuroscience. 60, 355-366 (1994).</li><li>Lewis, S. E., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+phosphorylated+variants+of+the+high+molecular+mass+subunit+of+neurofilaments+in+axons+of+retinal+cell+neurons:+characterization+and+evidence+for+their+differential+association+with+stationary+and+moving+neurofilaments.">Multiple phosphorylated variants of the high molecular mass subunit of neurofilaments in axons of retinal cell neurons: characterization and evidence for their differential association with stationary and moving neurofilaments.</a> J. Cell Biol. 107, 2689-2701 (1988).</li><li>Ruiz-Ederra, J., Garc&#237;a, M., Hicks, D., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+three+neurofilament+subunits+within+pig+and+human+retinal+ganglion+cells.">Comparative study of the three neurofilament subunits within pig and human retinal ganglion cells.</a> Mol. Vis. 10, 83-92 (2004).</li><li>Bringmann, A., Pannicke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).</li><li>Seo, J. M., Kim, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+polyimide+microelectrode+array+for+retinal+stimulation.">Biocompatibility of polyimide microelectrode array for retinal stimulation.</a> Mater. Sci. Eng. C. 24, 185-189 (2004).</li><li>Gerding, H., Benner, F. P., Taneri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+implantation+of+epiretinal+retina+implants+(EPI-RET)+with+an+IOL-type+receiver+unit.">Experimental implantation of epiretinal retina implants (EPI-RET) with an IOL-type receiver unit.</a> J. Neural Eng. 4, S38-S49 (2007).</li><li>Majji, A. B., Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+histological+and+electrophysiological+results+of+an+inactive+epiretinal+electrode+array+implantation+in+dogs.">Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 2073-2081 (1999).</li><li>Walter, P., Szurman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+implantation+of+electrically+inactive+epiretinal+microelectrode+arrays+in+rabbits.">Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits.</a> Retina. 19, 546-552 (1999).</li><li>Pardue, M. T., Stubbs, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+studies+of+the+retina+following+long-term+implantation+with+subretinal+microphotodiode+arrays.">Immunohistochemical studies of the retina following long-term implantation with subretinal microphotodiode arrays.</a> Exp. Eye Res. 73, 333-343 (2001).</li><li>Gekeler, F., Szurman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+subretinal+prostheses+with+extra-ocular+parts+designed+for+human+trials:+successful+long-term+implantation+in+pigs.">Compound subretinal prostheses with extra-ocular parts designed for human trials: successful long-term implantation in pigs.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 245, 230-241 (2007).</li><li>Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+materials+implanted+into+the+subretinal+space+of+Yucatan+minipigs.">Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).</li><li>Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+materials+implanted+into+the+subretinal+space+of+Yucatan+minipigs.">Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).</li><li>Ray, A., Colodetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+retinal+neurons+under+electrical+stimulation.">Immunocytochemical analysis of retinal neurons under electrical stimulation.</a> Brain Res. 1255, 89-97 (2009).</li><li>Nakauchi, K., Fujikado, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+suprachoroidal-transretinal+stimulation+current+resulting+in+retinal+damage+in+rabbits.">Threshold suprachoroidal-transretinal stimulation current resulting in retinal damage in rabbits.</a> J. Neural. Eng. 4, S50-S57 (2007).</li><li>Shepherd, R. K., Murray, M. T., Houghton, M. E., Clark, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+chronically+stimulated+platinum+intracochlear+electrodes.">Scanning electron microscopy of chronically stimulated platinum intracochlear electrodes.</a> Biomaterials. 6, 237-242 (1985).</li><li>Villalobos Villa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Safety of a Wide-Field Suprachoroidal Retinal Prosthesis. , (2012).</li><li>Nayagam, D. A. X., Allen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pre-Clinical+Model+for+Chronic+Electrical+Stimulation+of+the+Retina+via+Suprachoroidal+Electrodes.">A Pre-Clinical Model for Chronic Electrical Stimulation of the Retina via Suprachoroidal Electrodes.</a> , (2012).</li><li>Nayagam, D. A. X., Villalobos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suprachoroidal+Retinal+Prosthesis+is+Safe+in+a+Chronic+Implantation+Model.">A Suprachoroidal Retinal Prosthesis is Safe in a Chronic Implantation Model.</a> in Vision and Ophthalmology Annual Meeting., Vol. 4928/A327. , (2011).</li><li>Cicione, R., Shivdasani, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+cortex+responses+to+suprachoroidal+electrical+stimulation+of+the+retina:+effects+of+electrode+return+configuration.">Visual cortex responses to suprachoroidal electrical stimulation of the retina: effects of electrode return configuration.</a> J. Neural Eng. 9, 036009 (2012).</li><li>Schuettler, M., Stiess, S., King, B. V., Suaning, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+implantable+microelectrode+arrays+by+laser+cutting+of+silicone+rubber+and+platinum+foil.">Fabrication of implantable microelectrode arrays by laser cutting of silicone rubber and platinum foil.</a> J. Neural Eng. 2, S121-S128 (2005).</li><li>Morimoto, T., Kamei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+implantation+of+newly+developed+suprachoroidal-transretinal+stimulation+prosthesis+in+dogs.">Chronic implantation of newly developed suprachoroidal-transretinal stimulation prosthesis in dogs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6785-6792 (2011).</li><li>Bron, A. J., Tripathi, R. C., Tripathi, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Wolff's anatomy of the eye and orbit. , (2001).</li><li>Stein, J. J., Johnson, S. A., Berson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+coverage+of+beta+cells+in+the+cat+retina.">Distribution and coverage of beta cells in the cat retina.</a> J. Comp. Neurol. 372, 597-617 (1996).</li><li>Dagnelie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychophysical+evaluation+for+visual+prosthesis.">Psychophysical evaluation for visual prosthesis.</a> Annu. Rev. Biomed Eng. 10, 339-368 (2008).</li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

הערכת הבטיחות של השתל היא שיקול עיקרי למחקרים פרה. לפני תותב רשתית יכולה להיות מושתל בבני האדם הוא חיוני כדי לוודא שזה לא יגרום כל נזק. זה דורש הערכה של שניהם biocompatibility שתל 17-23 וכן כל נזק פוטנציאלי שיכול להיגרם על ידי גירוי חשמלי כרוני 24-26. ניסיון עם תותבות עצביות דומות, כגון שתל השבלול, מספק תובנה על מגוון הרחב של גירויים, ופיסיים, פרמטרים שאינם גורמים נזק לרקמות 27. עם זאת, יש לו את רשתית מאפיינים שונים לאתרים אחרים השתלה ומגבלות בטיחות ולכן מדויקות (כגון צפיפות מטען המרבית) לא ניתן להניח ממחקרים קודמים במערכות אחרות. צפיפויות טעינה הן הגבוהים ביותר באתרי אלקטרודה הפעילים וזה מתכתב עם הפוטנציאל הגדול ביותר לנזק. לכן שיטה לאיתור את הרקמה הסמוכה ישירותלאלקטרודות הפעילים הבודדות יהיה להגדיל באופן משמעותי את השימושיות של מחקרים אלה. הרקמות הסמוכות לאזורים ספציפיים של השתל יכולה גם להיות מודגשות לבדיקה מדוקדקת יותר. גישה ממוקדת זו מאפשרת סעיפים פחות להיות מנותחים, תוך שמירה על ביטחון, כי &quot;תרחיש המקרה הגרוע ביותר&quot; נבדק. שיטת לוקליזציה צבע scleral המתוארת כאן נבדקה בהרחבה עם סיליקון ביד בצורה והיצוק / אלקטרודה arrays Pt 28-30. זה כבר נעשה שימוש במערכי סרט דק פוליאמיד 7,31 וגם סרט דק סיליקון / Pt מערכים 32. כמה מחקרים תותבים רשתית מועסקים אלקטרודות &quot;כדור בצורת&quot; עם implantations intrascleral 33. הטכניקה הנוכחית צריכה להיות יעילה להערכת סוג של אלקטרודה arrays זה. עיניים חתוליות עם לובן העין (עובי דק בקוטב אחורי 90-200 מיקרומטר) אפשרו להדמיה של אלקטרודות בודדות במערך. עם זאת, גם אם אדם אלקטרוdes לא היו גלוי לעין, את עמדותיהם אפשר להסיק בקלות שימוש בתבנית סיליקון, כאשר ניתן לראות את קווי המתאר של המערך (בדומה לזה המשמש בשלב 2.6). מיפוי הצבע מגביל את הצורך בקבלת חלקי רקמות שאינם רלוונטיים כסעיפים רק עם הווה הצבע מתקבלים. היכולת להסיק עמדת האלקטרודה במדויק לא רק מאפשרת ניתוח histopathological רלוונטי וכוח סטטיסטי רב יותר, אך יש לו השפעה גדולה על זמן וניהול עלויות על ידי הפחתת כמות השקופיות ולהבים בשימוש, כמו גם את עלות העבודה. השימוש בצבע שהוא חסיד והוא יכול לעמוד עיבוד רקמות בזמן גם להיות גלוי בחלקי רקמות בלא כתם הוא שיקול חשוב ראשוני. ידע של המיקום של הצבע והכיוון של הרקמות בנתיחה ובמהלך ההטמעה מסייע בתהליך החיתוך. זה כולל כראוי orientating הבלוק כדי להשיג קטע שאינו אלכסון לגזור ונותן representati מלאעל של הרקמה. לכן חשוב שהאדם המבצע את החיתוך הוא נוכח בזמן של צבע יישום, לנתיחה והטבעה. הפרוטוקול הכולל הוא איתן לשינוי קל, במיוחד עם תזמוני קיבעון. עם זאת, לנתיחה העין וצעדים לציון צבע הם פעולות עדינות הנהנים ממיומנות ידנית טובה כדי למנוע פגיעה בדגימה. בעוד מקבע של דוידסון הוכיח עצם כיעילה להפחתת ניתוק artifactual של הרשתית ליד שתל, זה לא מונע נזק מכאני ישיר במהלך נתיחה. המקבע של דוידסון לא היה תואם בקלות עם כמה נהלים היסטולוגית וimmunohistochemical מיוחדים. לכן לא היה צורך לשנות / לייעל את הפעולות הבאות, כמפורט לעיל. שינויים מצטברים בזמנים מכתים וריכוזים שנעשו עד לקבלת התוצאה האופטימלית הושגה - לקבלת פרטים נוספים, עיינו בחומרים המשלימים. כימות של רשתיתהיסטולוגיה נותרת בעייתית. הרשתית היא שאינן הומוגני וגם העובי וצפיפות תאים עם שינוי מרחק הולך וגדל מהאזור centralis 34,35. לכן, רקמות השכנות מושתלת בתוך העין לא יכולות לשמש להשוואות ועין שליטה מועסקת במקום. Pairwise ההתאמה של כל קטע עם העין השליטה נותנת לנו השוואה סטטיסטית חזקה יותר של שינויים פתולוגיים; תוצאות יעילות ובטיחות עם תותבות רשתית טובה יותר העריכה כאשר משווים את עיני חברים ב36 נושא. יש לנקוט באמצעי זהירות מיוחד כדי למזער את החיתוך אלכסוני כמו זה ישפיע על כימות. לסיכום, בשיטות שתוארו לעיל השתפרו ניתוח histopathological שלנו, אשר בתורו הוביל לזרימת עבודה יעילה יותר באופן משמעותי קלינית. התוצאות של מחקרים פרה באמצעות שיטות אלה הובילו ישירות לניסוי קליני בחולים ש3 RP כבר מושתלים בבטחה עם suprachoroiפרוטזות רשתית דאל. שיטות אלה הן רלוונטיות גם לגירוי ברשתית העין ושתלים אחרים שבו התגובה פתולוגית להשתלה לטווח ארוכה צריכה להיות מוערכת. שיטה זו סיפק יתרונות כדאיים לשמירה על cytoarchitecture והרישום של הפתולוגיה לאזורים של עניין על השתל. למרות שלא נבדק באופן ספציפי, שינוי של נהלים אלה עשויים לשמש במינים אחרים ובמקומות אנטומיים אחרים, במיוחד כאשר מערך הוא מושתל שטחי.

פרוטזות רשתית עשויות להפוך בקרוב התערבויות קליניות שימושיות לטיפול בצורות שונות של אובדן ראייה חמור. בתנאים מסוימים, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה (RP), מביאים לניוון הנרחב של קולטני האור בעיניים, אלו הם תאי אחראי transducing אור לאותות עצביים. עם זאת, כמה תאים בשכבות אחרות של הרשתית יישארו והם יעדים פוטנציאליים לגירוי חשמלי עם 1 תותב רשתית. תוצאות מוקדמות של ניסויים קליניים בבני אדם כבר מבטיחות למערכי אלקטרודה המושתלים ב2,3 epiretinal, subretinal 4,5, וintrascleral 6 מקומות. מכשירים אלו עשויים מחומרים שונים עם צורות שונות, אך כולם משתמשים בפולסים חשמליים כדי להפעיל את הנוירונים קיימא הנותרים של הרשתית על מנת ליצור תפיסות חזותיות. הקבוצה הגדולה יותר שלנו (Bionic החזון אוסטרליה) פיתחה שתל רשתית שיש Progressed למחקר פיילוט קליני עם 3 חולי RP מושתלים אלקטרודה עם מערכי suprachoroidal (מספר ניסויים קליני: NCT01603576). איור 1 א מציג תותב רשתית אב טיפוס suprachoroidal זה. בטיחות מטופל היא בעל חשיבות עליונה במחקרים קליניים, ולכן, לפני תחילת ניסויים בבני אדם, ביצענו בדיקות אקוטיות וכרוניות נרחבות במודלים פרה (איור 1). הערכות histopathological היו חיוניות כדי לחדד את ההליכים כירורגיים, לחזר דרך עיצוב אלקטרודה, וסופו של דבר לקבוע את הבטיחות של השתל. כדי לשמור על זרימת עבודה יעילה השתלבה עם שיטות פתולוגיה קליניות סטנדרטיות, טכניקת הטבעת פרפין הועסקה. גם זה היה רצוי לנצל הליכים מכתים השוואה לסטנדרטים קליניים, כגון haematoxylin ו eosin (H &amp; E), שמתפרשים בקלות על ידי פתולוגים. גם אנחנו רוצים טכניקה שיכולה להיות מותאמות לניתוחי immunohistochemical, בעל מנת להקל עוד יותר הערכה תאית של הרקמות. Biocompatibility של חומרי השתל, והבטיחות של גירוי חשמלי כרוני, צריך להיות מוערך בזהירות. זה חשוב להיות מסוגל לבחון histopathology של רקמת העין הסמוכה לאלקטרודות גירוי הבודדות בתוך המערך. עם זאת, את המערכים יש לסלקו קודם לעיבוד הדגימות, כדי שיוכלו להיבחן, ובגלל שהרכיבים המתכתיים שלהם לא היו יכולים להיות בקלות מחולק. כתוצאה מכך, הכנת הרקמה ומבוססת שלנו לא התירה לוקליזציה ומיפוי של רקמה ביחס לאלקטרודות המושתלות 7. בנוסף לחוסר שיטת לוקליזציה רקמות, הקיבעון מבוסס פורמלדהיד הסטנדרטי וטכניקות עיבוד הביאו לממצאים נרחבים וניתוק של רשתית עקב להצטמקות ההפרש של השכבות השונות של העין (איור 2). בשל אי - ההומוגניות של tהוא הרשתית, היה קשה לעשות השוואות תקפות עם רקמת שליטה, במיוחד עבור מדידות כמותיות. מגבלות אלה בשילוב מסובכת הערכות מדויקות של נזק האפשרי שנגרם על ידי המערכים המושתלים שלנו. כאן אנו מציגים טכניקות חדשניות להתגברות על מגבלות אלה. יש לנו שונה טכניקות קיבעון ועיבוד מיוחדות עיניים 8-10 כדי לשמור על תאימות עם היסטולוגיה המבוססת על הנפט. יש לנו שונה וכתמים היסטולוגית immunohistochemical רגילים לתת תוצאות דומות, המבוסס על משוב מפתולוגים קליניים. לאחר בצוע שקוף רקמת scleral, צבע קוד צבע מבוסס הועסק כדי לסמן את רקמת העין הצמודה לכל אלקטרודה בודדות, לפני הסרת המערך ממרחב suprachoroidal. על ידי סימון מערך האלקטרודה ואתרי אלקטרודה הבודדים, דגימות יכולה להיות שנאספו מדויקת מהאזורים סמוכים אלקטרודה. דגימות תאמו יכולה להיות שנאספו מההעין שליטה אלקטרונית על מנת להקל על השוואות pairwise.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Davidson marking system</td>
			<td>Bradley Products</td>
			<td>1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>1:1500, overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB302</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0142</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>1:25,000 30 min incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost 90&#176; yellow</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>SF41299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEX IHC Microscope Slides</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>10% serum/0.1% Triton X-100/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
 			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Non-Standard Solution Preparation for Special Stains
			1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution
			<ul>
				<li>Cresyl violet 1 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Cresyl Violet Acetate Working Solution
			<ul>
				<li>1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml</li>
				<li>Distilled water 51 ml</li>
				<li>10% acetic acid 0.5 ml</li>
			</ul>
			Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution
			<ul>
				<li>1% Beihrich scarlet 90 ml</li>
				<li>1% acid fuchsin 10 ml</li>
				<li>Glacial acetic acid 1 ml</li>
			</ul>
			Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution
			<ul>
				<li>Phosphomolybdic acid 2.5 g</li>
				<li>Phosphotungstic acid 2.5 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Aniline Blue Solution
			<ul>
				<li>Aniline blue 2.5 g</li>
				<li>Glacial acetic acid 2 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Solutions for Immunohistochemistry
			Wash Buffer Solution
			<ul>
				<li>0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS)</li>
			</ul>
			Serum Block Solution
			<ul>
				<li>10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS</li>
			</ul>
			SUPPLEMENTARY MATERIAL
			Luxol Fast Blue
			The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml.
			Periodic Acid Schiff
			The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining.
			Masson&#8217;s Trichrome Blue
			The principle of the Masson&#39;s trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson&#39;s fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required.
			Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody
			Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and M&#252;ller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da.
			Neurofilament-200 antibody
			Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons.
			Glutamine Synthetase (GS) antibody
			Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of M&#252;ller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis

עם ההתפתחות האחרונה של תותבות ברשתית, חשוב לפתח טכניקות אמינות להערכת הבטיחות של מכשירים אלה במחקרים פרה. עם זאת, הקיבוע סטנדרטי, הכנה, והליכי היסטולוגיה אוטומטיים הם לא אידיאליים. כאן אנו מתארים נהלים חדשים להערכת סיכון של הבריאות של הרשתית ישירות הסמוכה לשתל. פרוטזות רשתית כוללות מערכי אלקטרודה במגע עם רקמות העין. שיטות קודמות לא הצליחו מרחבית למקם את רקמת העין הסמוכה לאלקטרודות בודדות בתוך המערך. בנוסף, עיבוד היסטולוגית סטנדרטי לעתים קרובות תוצאות ניתוק artifactual ברוטו של שכבות הרשתית בעת הערכת עיניים מושתלות. כתוצאה מכך, זה כבר קשה להעריך נזק מקומי, אם קיים, שנגרם על ידי השתלה וגירוי של מערך האלקטרודה מושתל. לכן, פיתחנו שיטה לזיהוי ואיתור רקמות העין הסמוכות לדואר מושתלlectrodes באמצעות ערכה (בצבעים) צבע סימון, ואנחנו שונה טכניקת קיבוע העין כדי למזער את היפרדות רשתית artifactual. שיטה זו גם הפכה את לובן העין שקופה, המאפשרת ללוקליזציה של אלקטרודות בודדות וחלקים ספציפיים של שתל. לבסוף, השתמשנו בביקורת מותאמת כדי להגדיל את כוחו של הערכות histopathological. לסיכום, שיטה זו מאפשרת אפליה אמינה ויעילה והערכה של cytoarchitecture הרשתית בעין מושתל.

איור 4 מראה סעיף נציג המתקבל מחיתוך המדגם המתואר באיור 3. הקטע נחתך בעובי 5 מיקרומטר ומוכתם עם H &amp; E על פי הפרוטוקולים שתוארו לעיל. הצורה הגולמית של רצועת המדגם נשמרה עם ממצאי רקמות דיפרנציאלי מינימאליים (איור 4 א). שני סימוני הצבע נראו על לובן העין, למרות שהצבע הירוק היה עמיד יותר מאשר האדום (איור 4). שכבות הרשתית לא היו מנותקות artifactually ומורפולוגיה הרשתית נשמרה (4C איור). רקמת הרשתית בסמוך לסימוני הצבע, שמתאים למיקום של האלקטרודות במערך, ניתן לזהות בקלות. איור 5 מראה כתמים ואימונוהיסטוכימיה נציג מיוחדים של קטעי רקמה שהוכנו על פי הפרוטוקול הנוכחי. עיין באיור 5 captioחומרי n ונוספות לפרטים נוספים על הכתמים הספציפיים ואת השינויים שבוצעו לשימוש שלהם. לאחר השינוי, כתמים אלה ואימונוהיסטוכימיה היו שווי ערך לאמות מידה שנקבעה - כפי שאומתו על ידי פתולוגים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סוג של נוגדנים וtitre העיקריים (בסוגריים) </td><td> GFAP (1:1500) </td><td> NF200 (1:100) </td><td> GS (1:100) </td></tr><tr><td> סוג של נוגדנים וtitre המשני (בסוגריים) </td><td> אלקסה פלואוריד 594 </td><td> אלקסה פלואוריד 488 </td><td> אלקסה פלואוריד 488 </td></tr><tr><td> משך הדגירה של נוגדנים משני </td><td> שעה 1 </td><td> 2 שעות </td><td> 45 דקות </td></tr></tbody></table> טבלת מס &#39;1. סוג הנוגדן, titre ומשך של תיוג. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig1.jpg" /> איור 1. Suprachoroמערך אלקטרודות אבטיפוס idal. תצלום מאקרו) של מערך יצוק כיתה קלינית. ב &#39;) Photomicrograph של מערך קליני בעבודת יד. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig2.jpg" /> איור 2. היסטולוגיה רשתית לשעבר. שיטות היסטולוגית סטנדרטיות שמשו להכנתם, H &amp; E מוכתמת, חלקי העין המושתלת עם מערך אלקטרודות suprachoroidal.) סעיף אורתוגונלי דרך חלל מערך אלקטרודות (מתואר על ידי כוכבים). הרשתית מנותקת מרקמות העין החיצונית. הדבר בולט במיוחד מתחת לאזור המושתל (חץ). אי אפשר לקבוע איזה חלק של רשתית היה צמוד לכל אלקטרודה בודדות של המערך. Scalebar = 1 מ&quot;מ. ב &#39;) ההגדלה גבוהה יותר של האזור התאגרף בלוח. ישנם כמה, במרווחים קבוע, חפצים בLaye הרשתיתRS (חיצים), כמו גם ניתוק גדול מהשכבה tapetal (השכבה רעיוני בעיניים של חתולים). Scalebar = 100 מיקרומטר. ג) ההגדלה גבוהה יותר של האזור התאגרף בלוח ב &#39;. החץ הצביע על מגזרים החיצוניים של קולטני האור, כמו גם את האפיתל pigmental, שנותר על כנן, טוען כי הניתוק היה תופעת לוואי artifactual של העיבוד, בניגוד לנגרם על ידי טראומה בvivo או פתולוגיה. Scalebar = 20 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig3.jpg" /> איור 3. לוקליזציה וDissection של אלקטרודה-סמוך רקמות. לספירה) תמונות טווח דינמיים גבוהות המאקרו של העין enucleated, עם מערך אלקטרודות suprachoroidal באתרם.) הודעה קבועה עם המקבע של דוידסון, ולפני הסרת מערך, בלובן העין השקוף מאפשרת הדמיה שלהאלקטרודות הבודדות במערך (דוגמה אחת מסומנת בחץ). ב &#39;) האלקטרודות המסומנים בצבע צבע מוגדר מראש. C) סימוני צבע במרווח קבוע מציוני הדרך אנטומיים משמשים כדי לשמור על עקביות לאורך ניסויים. ד&#39;) לאחר ההסרה של מערך, העין היא גזור ביד לדוגמא רצועות. חצים צבעוניים מציינים שניים מהאתרים הסמוכים אלקטרודה על לובן העין. קו מקווקו צהוב מציין מטוס של חתך. ה) מקרו תצלום של רצועת מדגם מוטבעת בתוך בלוק. אגר F) צילום מאקרו ברצועה אגר להטביע מדגם E מהלוח, לגזור והניח בקלטת הטבעה נתמכת על ידי כריות ביופסיה קצף כדי למזער את התנועה של הקטע במהלך עיבוד. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig4.jpg" /> איור 4. היסטולוגיה רשתית חדשה. </s<html> טרונג&gt; רצועת המדגם לעיל (מאיור 3D), המכילה את כיס אלקטרודה, היה פרפין מוטבע, מחולק ב 5 מיקרומטר ומוכתם H &amp; E.) ירוק ואזורים צבועים באדום (מסומן בחצים, כמו איור 3D) נראים ב לקח את סעיף ברמה של הקו המקווקו הצהוב באיור 3D. בר סולם = 1,000 מיקרומטר. הרשתית אינה מנותקת, לא מתחת לכיס המערך ולא מרחוק. ב &#39;) באזור התאגרף מלוח עם צבע אדום וירוק נראה מצויינים על ידי חיצים, והרשתית שלמה לאורך כל הדרך. בר סולם = 500 מיקרומטר. C) האזור התאגרף מהלוח ב &#39;, המציג את שלמות, מצורפת, רשתית הסמוכה לצבע הירוק. בר סולם = 50 מיקרומטר. ידיעת שהמיקום של הצבע מציין את המיקום של האלקטרודה, אנחנו יכולים בביטחון להעריך את רקמת הרשתית בסמוך לנזק, אם בכלל, שנגרם על ידי גירוי חשמלי. ve_content &quot;עבור: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig5.jpg" /> איור 5. דוגמאות לcytohistochemistry רשתית שונה באמצעות כתמים וimmunofluorescence מיוחדים. השימוש במקבע של דוידסון, בניגוד לטכניקות סטנדרטיות פורמלין קיבעון, שינויים נדרשים בפרוטוקולי הצביעה הרגילים, כפי שתוארו בפרוטוקול הטקסט הראשי. הפתולוגים אישרו כי שינויים אלה הביאו לצביעה שווה ערך.) H &amp;E; haematoxylin כתמים סגולים גרעיני תא תוך הציטופלסמה תא כתמי eosin, קולגן ורקמות תומכים גוונים שונים של ורוד. ב &#39;) LFB כתמים כחולים המיאלין בעוד counterstain הסגול cresyl יכול לשמש כדי . לזהות תאי הגנגליון על ידי צביעת גופי Nissl בתוך perikaryon הכחול ומדגיש את תאי הלווין המקיפים את תאי C) Trichrome הכחול של האסון; Biebrich ארגמן חומצת fuchsin פתרון כתמי השריר FiBers אדום, ואילו את הכתמים הכחולים אנילין קולגן, במקרה זה בלובן העין, הכחול D) PAS;. רכיבי גליקופרוטאין של קרום במרתף ומרכיבי רקמת חיבור מגואלות סגולים, בעוד haematoxylin counterstains תא דואר גרעינים סגול) &#39;פרלס כחול הפרוסים. באתר של דימום, היווצרות של haemosiderin מתאי דם אדומים מושפלים ושחרור של קומפלקסי ברזל מייצר צבע סגול ואילו התוספת של צבעי כתם אדומים ניטראליים lysosomes אדום F) GS;. האנזים המשפיל הזה מוליך עצבי שנמצא בתאי מולר 13 (ירוק ), ניתן לראות הרחבת בשני הכיוונים עם גופי תא מולר בשכבת הגרעין הפנימי וendfeet תא מולר יוצר את הקרום הפנימי הגבלת G) NF-200;. השרשרת כבדה חלבון cytoskeletal (ירוק) שנמצאה בסומה התא ותהליכים , Crosslinks עם neurofilaments אחר כדי לשמור על המבנה של תאי עצב 14,15. גנגליוןתאים והאקסונים שלהם ניתן לראות בשכבת תא גנגליון ושכבת סיבי עצב, ואילו האקסונים של תאים אופקיים הממוקמים בדייר החיצוני של שכבת הגרעין הפנימית ברשתית של החתולים, הם גם הדגישו. Counterstaining עם DAPI (כחול) מאפשר הדמיה של שכבות רשתית H) GFAP;. חלבון cytoskeletal זה (אדום) התרבו בתאים והאסטרוציטים מולר במהלך דבק 16, ניתן לראות בתור שכבת סיבי העצב עם תאי מולר להרכיב דקות הרחבות דרך פנימי שכבות רשתית חיצוניות. Counterstaining עם DAPI (כחול) מאפשר הדמיה של שכבות הרשתית. בר סולם = 50 מיקרומטר בכל הלוחות. הרשתית הפנימית מוצגת בחלק העליון של כל תמונה; הרשתית החיצונית מוצגת בחלק התחתון של כל תמונה, לא כולל לוח E, אשר מציגה תגובת subscleral.

Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis at JoVE.com

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

טכניקות להדמית cytoarchitecture רשתית ישירות בסמוך לאלקטרודות בודדות בתוך ממריץ רשתית.

טכניקות לעיני עיבוד השתלה תותבת רשתית לניתוח Histopathological מרוכזות

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

techniques-for-processing-eyes-implanted-with-retinal-prosthesis-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

19.7K Views.  Bionics Institute. טכניקות להדמית cytoarchitecture רשתית ישירות בסמוך לאלקטרודות בודדות בתוך ממריץ רשתית.

Video: Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

ביצוע ועיבוד FNA של Pad שומן Anterior עבור עמילואיד

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

כיצד למדוד מתקפל קליפתיים מתמונות MR: מדריך שלב אחר שלב כדי לחשב מדד Gyrification מקומי

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be considered one of the most important signaling molecules produced in our body, regulating essential functions including but not limited to regulation of blood pressure, immune response and neural communication. Therefore its accurate detection and quantification in biological matrices is critical to understanding the role of NO in health and disease. With such a short physiological half life of NO, alternative strategies for the detection of reaction products of NO biochemistry have been developed. The quantification of relevant NO metabolites in multiple biological compartments provides valuable information with regards to in vivo NO production, bioavailability and metabolism. Simply sampling a single compartment such as blood or plasma may not always provide an accurate assessment of whole body NO status, particularly in tissues. The ability to compare blood with select tissues in experimental animals will help bridge the gap between basic science and clinical medicine as far as diagnostic and prognostic utility of NO biomarkers in health and disease. Therefore, extrapolation of plasma or blood NO status to specific tissues of interest is no longer a valid approach. As a result, methods continue to be developed and validated which allow the detection and quantification of NO and NO-related products/metabolites in multiple compartments of experimental animals in vivo. The established paradigm of NO biochemistry from production by NO synthases to activation of soluble guanylyl cyclase (sGC) to eventual oxidation to nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-) may only represent part of NO's effects in vivo. The interaction of NO and NO-derived metabolites with protein thiols, secondary amines, and metals to form S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), and nitrosyl-heme respectively represent cGMP-independent effects of NO and are likely just as important physiologically as activation of sGC by NO. A true understanding of NO in physiology is derived from in vivo experiments sampling multiple compartments simultaneously. Nitric oxide (NO) methodology is a complex and often confusing science and the focus of many debates and discussion concerning NO biochemistry. The elucidation of new mechanisms and signaling pathways involving NO hinges on our ability to specifically, selectively and sensitively detect and quantify NO and all relevant NO products and metabolites in complex biological matrices. Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of nitrite and nitrate by HPLC as well as detection of free NO in biological samples using in vitro ozone based chemiluminescence with chemical derivitazation to determine molecular source of NO as well as ex vivo with organ bath myography.

The endogenous production of nitric oxide (NO) regulates a wide variety of biological functions. It is becoming increasingly clear that disruption or dysregulation of NO based signaling is involved in many human diseases. Methods to quantify relevant NO metabolites may provide novel diagnostic or prognostic biomarkers for human disease.

טכניקות אנליטיות עבור assaying bioactivity תחמוצת החנקן

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

עיבוד של הפחתה מאמופלסטית אדם ורקמות כריתה לתא תרבות

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

טכניקות לעיני עיבוד מושתלים בתותב רשתית למותאם למקום Histopathological ניתוח: חלק 2 Epiretinal שתלים עם נעצי רשתית

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks performed by the RPE are phagocytosis and processing of outer photoreceptor segments through lysosome-derived organelles. These degradation products, stored and referred to as lipofuscin granules, are composed partially of bisretinoids, which have broad fluorescence absorption and emission spectra that can be detected clinically as fundus autofluorescence with confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO). Lipofuscin accumulation is associated with increasing age, but is also found in various patterns in both acquired and inherited degenerative diseases of the retina. Thus, studying its pattern of accumulation and correlating such patterns with changes in the overlying sensory retina are essential to understanding the pathophysiology and progression of retinal disease. Here, we describe a technique employed by our lab and others that uses cSLO in order to quantify the level of RPE lipofuscin in both healthy and diseased eyes.

The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy.

כמותי הפונדוס autofluorescence עבור הערכת מחלות רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

צעד אחר פרוטוקול שלב לכירורגיה subretinal בארנבונים

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

מתודולוגיה Sputum אינדוקציה ועיבוד מעבדה

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

לומד סוכרת דרך העיניים של דג: Microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:EGFP) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...