אנו מודים לד&quot;ר מנג-צ&#39;ין לין וגב &#39;דונג יואן לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות HD053767 (קבלנות משנה לNLW), ועל ידי קרנות מהמחלקה לפיסיולוגיה ומשרד המשנה לנגיד למחקר, אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג&#39;לס (NLW).

1. נתיחה של מוח מהמבוגרים Medaka <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי מבוגר זכר או נקבה (איור 1 א) על ידי טבילה ב5 מיליליטר MS-222 (150 מ&quot;ג / ל &#39;, pH 7.4); לחכות כמה דקות אחרי תנועות זימים הפסיקו לפני עריפת הראש. כל ההליכים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג&#39;לס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את הדגים במלח דגים בסוף הזנב של operculum עם מספריים בצלחת פטרי בקוטר של 60 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ראש דג לצלחת פטרי בקוטר 35 מ&quot;מ, חצי מלא בדגים מלוחים ומרופד בSylgard שיש לו דיכאון בזה כדי למקם ולאבטח את הראש לנתיחה המוח. עמדה ולאבטח את הגב בצד הראש עם סיכות חרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך בזהירות את החלק הגבי של הגולגולת מסביב שלה עם מספריים עדינים ובעדינות להסיר אותו עם מלקחיים, חושף חלק הגבי של המוח כולל את החלק הקדמי של חוט השדרה לחלוטין. </li> &lt;li&gt; הרם את חוט השדרה בעדינות עם מלקחיים עדין קצה ולנתק את עצבי חיבור בין שתי המדינות במספריים קנס שקצהו: עצבים גולגולת, עצבים בעמוד השדרה, ואת עצבים ראייה בצד הגחוני של המוח, ואת עצבי חוש הריח בחלק הקדמי של המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המוח גזור באופן מלא בצלחת פטרי טרי מלאה מלוח דגים, ולבדוק בזהירות מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח את המוח כולו הוא ללא פגע (כולל בלוטת יותרת המוח), ללא חתכים או נקבים. מוח שנפגע אינם משמש לניסויים. </li></ol> 2. ההרכבה המוח בתא הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום טיפה קטנה של cyanoacrylate או דבק מהיר משחק אחר עם מחט לתוך מרכז חדר ההקלטה ולהפיץ את הדבק על 1 ס&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר להעביר את המוח ואותו הדבק בעמדה עד הגחון בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של תמיסת מלח דגים, כך שהוא ממלא את חדר ההקלטה ומכסה את המוח. ברציפות perfuseהמוח עם מי מלח דגי מוגזים בשיעור של לפחות 200 μl / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קצה מלקחיים עדין להסיר את קרומי המוח בזהירות מעל פני השטח של אזור ההקלטה של ​​המוח. </li></ol> 3. Electrophysiology <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטת תיקון רופפת של ירי פוטנציאל פעולה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microelectrodes הזכוכית (6-10 MΩ) בנויים מpipettes זכוכית ורוסיליקט (1B150F-4, מכשירי עולם Precision) באמצעות חולץ אלקטרודה (למשל סאטר P-87), ומילא חזרה עם פתרון ההקלטה רופף-התיקון בחץ הדרך למעלה האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף עם מכשיר תשלום מצמיד מקורר (CCD) מצלמה, למצוא את ה-GFP-לבטא TN-GnRH3 הנוירונים באמצעות 10x (איור 1), ולאחר מכן מטרות טבילה במים 40X (איור 1 ג). הם ממוקמים ליד או על פני השטח הגחון של נורות חוש הריח, רק הקדמיים לtelencephalon. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לצג וידאו שמספקתמונות בזמן אמת ממיקרוסקופ כדי לאתר את TN-GnRH3 נוירון האשכול (איור 1 ג&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את microelectrode לאמבטיה, כך שהקצה של האלקטרודה הוא מעל ליעד נוירון. להפעיל לחץ חיובי קל מתמיד microelectrode כך שזה לא ייסתם, ומתקרב בעדינות נוירון היעד עם הקצה של האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק ולפקח על התנגדות האלקטרודה במצב מתח מהדק באמצעות תוכנת AxoGraph ומגבר Axoclamp 200B עם תוכנת Axograph (אקסון מכשירים). כאשר אתה יכול לראות מהצג וידאו שהקצה של האלקטרודה הוא על פני השטח של תא העצב ומתצוגת AxoGraph שההתנגדות משתנה במקצת, שחרר את הלחץ החיובי ולהפעיל לחץ שלילי קל אם יש צורך לעשות חותם על התנגדות נמוכה נוירון (&lt;100 MΩ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למצב נוכחי, מהדק, ולהקליט את מתח הקרום ברציפות ללא כל קלט נוכחי, כדי להתאים את קנה המידהשל מתח וקצב ההקלטה במידת צורך. הנתונים שנאספו ונותחו על ידי תוכנת Powerlab (ADInstruments Inc). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעילות שיא הבסיס חשמלית בתמיסת מלח דגים רגיל לכ -5 דקות לפני כל טיפול (איור 2 א). זלוף אמבט של תרופות, הורמונים, פפטידים, וכו &#39;. הוסיף מלח לדגים ממשיך בשיעור של 200 μl / דקות, ואחרי תקופה בכישלון רגיל דגים מלוחים 5, 6, 11. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטת תא שלמה של פוטנציאל הממברנה ההליך כולו מהדק תיקון תא electrophysiology הוא זהה לזה של הליך ההקלטה רופף-תיקון תאי שתואר לעיל, משלבים 3.1.1 - 3.1.4. ואז את ההליכים לסטות בהתאם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק ולפקח על התנגדות האלקטרודה במצב מתח מהדק. כאשר אתה יכול לראות מהצג וידאו שהקצה של האלקטרודה הוא על פני השטח של תא העצב ומאוסצילוסקופ כי שינויי ההתנגדות מעט, שחררו את חיובייםלחץ ולהחיל לחץ שלילי קטן כדי להפוך את חותם עמידות גבוהה בנוירון (~ 3 גיגה Ω). החל שאיבה עדינה דרך פה לקרע קרום הטלאים, אתה תראה ירידה פתאומית של ההתנגדות לכ 120-250 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למצב נוכחי, מהדק, ולהקליט את מתח הקרום ברציפות ללא כל קלט נוכחי, כדי להתאים את קנה המידה של מתח וקצב ההקלטה במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעילות חשמלית בסיסית בשיא מלוח דגים רגילים לכ -5 דקות לפני כל טיפול, כפי שתוארה לעיל ב3.1.7 (איור 2). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotrophin-releasing+hormone+(GnRH)+in+the+animal+kingdom.">Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom.</a> J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).</li><li>Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+cues+from+conspecifics+alter+electrical+activity+of+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+the+terminal+nerve+via+visual+signals.">Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).</li><li>Abe, H., Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+neuromodulation+by+a+nonhypophysiotropic+GnRH+system+controlling+motivation+of+reproductive+behavior+in+the+teleost.">Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost.</a> 57 (6), 665-674 (2011).</li><li>Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrodotoxin-resistant+persistent+Na++current+underlying+pacemaker+potentials+of+fish+gonadotrophin-releasing+hormone+neurones.">Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones.</a> J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).</li><li>Zhao, Y., Wayne, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Kisspeptin1+on+Electrical+Activity+of+an+Extrahypothalamic+Population+of+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Neurons+in+Medaka.">Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka.</a> PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).</li><li>Wayne, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+electrophysiology+of+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+that+express+green+fluorescent+protein+in+the+terminal+nerve+of+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes).">Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).</li><li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+gonadotropin-releasing+hormone+neuronal+development:+insights+from+transgenic+medaka+and+the+relevance+to+X-linked+Kallmann+syndrome.">Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome.</a> Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).</li><li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+form+of+gonadotropin-releasing+hormone+in+the+medaka,+Oryzias+latipes.">A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).</li><li>Ramakrishnan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+spontaneous+electrical+activity+during+embryonic+development+of+gonadotropin-releasing+hormone-3+neurons+located+in+the+terminal+nerve+of+transgenic+zebrafish+(Danio+rerio).">Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).</li><li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gonadotropin-releasing+hormone-3+neuron+ablation+in+zebrafish:+effects+on+neurogenesis,+neuronal+migration,+and+reproduction.">Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction.</a> Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).</li><li>Wayne, N. L., Kuwahara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-endorphin+alters+electrical+activity+of+gonadotropin+releasing+hormone+neurons+located+in+the+terminal+nerve+of+the+teleost+medaka+(Oryzias+latipes.">Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).</li><li>Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+gonadotrophin-releasing+hormone+neurones+and+steroid-sensitive+sexually+dimorphic+kisspeptin+neurones+in+teleosts.">Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts.</a> J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).</li><li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

GnRH 3: דגים מהונדסים GFP לספק מודלים ייחודיים כדי לחקור את המנגנונים שבבסיס neurophysiological אינטגרציה ורגולציה בשליטה מרכזית של התנהגויות שהן גם ישירות ובעקיפין מעורבות ב3 רבייה, 8-10 עצביים. אחד היתרונות המשמעותיים של מערכת מודל זה הוא שהרבה GnRH3 נוירונים להביע GFP קר?...

<table><tbody><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>BX50W (Upright)</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Axoclamp 200B </td></tr><tr><td>A-D converter</td><td>Computer Interference Corp.</td><td></td><td>Digidata ITC-18 </td></tr><tr><td>Cooled CCD camera</td><td>PCO Computer Optics</td><td></td><td>Sensicam</td></tr><tr><td>Xenon lamp</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP filter set</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Software</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td>Slidebook software </td></tr><tr><td>Electrophysiology Data Acquisition Software</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Axograph software </td></tr><tr><td>Electrophysiology Data Acquisition Software</td><td>AD Instruments Inc.</td><td></td><td>PowerLab </td></tr><tr><td>Headstage for electrophysiology</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>CV 203BU </td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Recording Chamber Platform</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td></td><td>P1 </td></tr><tr><td>Recording Chamber</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td></td><td>RC-26G </td></tr><tr><td>Electrode Puller</td><td>Sutter instruments</td><td></td><td>P87 </td></tr><tr><td>Filament for electrode puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>FB330B</td><td>3.0 mm wide trough filament</td></tr><tr><td>1.5 mm glass capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150-4</td><td>Micr&amp;#8211;lectrode for recording</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>309586</td><td>3 ml</td></tr><tr><td>MS-222 </td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td></tr><tr><td>Fish saline</td><td></td><td></td><td>mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 1.2 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 10 HEPES </td></tr><tr><td>Electrode solution (loose-patch) </td><td></td><td></td><td>mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 1.3 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 10 HEPES; 10 glucose </td></tr><tr><td>Electrode solution (whole-cell patch) </td><td></td><td></td><td>mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 1 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine </td></tr></tbody></table>

recording electrical activity from identified neurons in the intact brain of transgenic fish

הבנת הפיסיולוגיה של התא של מעגלים עצביים המווסתים את ההתנהגויות מורכבות היא מאוד משופרת באמצעות מערכות מודל שבו ניתן לבצע את העבודה הזאת בהכנת מוח שלמה שבו המעגלים העצביים של מערכת העצבים המרכזית נשארים שלמים. אנו משתמשים בדג מהונדס שבי גונדוטרופין משחרר הורמון (GnRH) נוירונים מתויגים גנטי עם חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי במוח שלם. יש דגי אוכלוסיות מרובות של נוירונים GnRH, והפונקציות שלהם הן ​​תלויות במיקומם במוח ובגן GnRH שהם מביעים 1. יש לנו התמקדנו בהפגנה שלנו GnRH3 נוירונים הממוקמים בעצבי המסוף (TN) בקשר לנורות חוש הריח באמצעות המוח שלם של דגי medaka מהונדס (איור 1B ו-C). מחקרים מראים שנוירונים TN-GnRH3 Medaka הם neuromodulatory, מתנהגים כמו משדר של מידע מהסביבה החיצונית למערכת העצבים המרכזית; לאהיי לא משחק תפקיד ישיר בויסות תפקודי יותרת המוח, האשכים, כפי שעושה נוירונים ההיפותלמוס GnRH1 הידועים 2, 3. דפוס טוניק של ירי פוטנציאל פעולה הספונטני של תאי עצב TN-GnRH3 הוא מאפיין מהותי 4-6, התדירות מתוכם הוא מווסת על ידי רמזים חזותיים מקונספציפים 2 ו kisspeptin 1 5 נוירופפטידים. בסרטון הזה, אנו משתמשים בקו יציב של מהונדס medaka בי נוירונים TN-GnRH3 להביע transgene המכיל את האזור המקדם של Gnrh3 קשור לחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר 7 להראות לך איך לזהות ולעקוב אחר פעילות נוירונים החשמלית שלהם במוח כולו הכנת 6.

דוגמה של אשכולות בין שתי המדינות של ה-GFP שכותרתו GnRH3-TN נוירונים מהמוח של דגים נכרת medaka מוצגת ב1B 1C ודמויות. כל אשכול מכיל כ 8-10 נוירונים GnRH. את הפעילות העצבית הספונטנית של יעד TN-GnRH3 נרשמה במצב נוכחי מהדק (אני = 0) עם שיעורי ירי טיפוסיים של 0.5-6 הרץ. הדפוס של ירי פוטנצי?...

Watch this Scientific Journal Video about Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish at JoVE.com

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

בסרטון הזה, נדגים כיצד להקליט פעילות חשמלית מתא עצב בודד שזוהה בכל הכנת מוח, השומרת על מעגלים עצביים מורכבים. אנו משתמשים בדג מהונדס שבי גונדוטרופין משחרר הורמון (GnRH) נוירונים מתויגים גנטי בחלבון פלואורסצנטי לזיהוי בהכנת המוח השלמה.

הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

recording-electrical-activity-from-identified-neurons-intact-brain

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K Views.  University of California, Los Angeles. בסרטון הזה, נדגים כיצד להקליט פעילות חשמלית מתא עצב בודד שזוהה בכל הכנת מוח, השומרת על מעגלים עצביים מורכבים. אנו משתמשים בדג מהונדס שבי גונדוטרופין משחרר הורמון (GnRH) נוירונים מתויגים גנטי בחלבון פלואורסצנטי לזיהוי בהכנת המוח השלמה.

Video: Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

מותאמים הצמד תיקון הקלטות מ-מוטור נוירון שרירים יעד השלד דג הזברה

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

הקלטת אלקטרו מוח קדמי בזחל דג זברה

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Biology

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain activity from freely moving fish would advance research on the neural basis of fish behavior considerably. Moreover, precise control of the recording location in the brain is critical to studying coordinated neural activity across regions in fish brain. Here, we present a technique that records wirelessly from the brain of freely swimming fish while controlling for the depth of the recording location. The system is based on a neural logger associated with a novel water-compatible implant that can adjust the recording location by microdrive-controlled tetrodes. The capabilities of the system are illustrated through recordings from the telencephalon of goldfish.

A novel wireless technique for recording extracellular neural signals from the brain of freely swimming goldfish is presented. The recording device is composed of two tetrodes, a microdrive, a neural data logger, and a waterproof case. All parts are custom-made except for the data logger and its connector.

הקלטה אלקטרופיסיולוגית של הנוירונים על ידי להזזה Tetrodes בחינם שחייה דגים

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...

In Vivo Confocal Fluorescence Imaging of Neural Activity Induced by Sensory Stimulation in Partially Restrained Larval Zebrafish

Zebrafish larvae are a promising vertebrate model system for studying the neural mechanisms of behavior. Their translucence and relatively simple neural circuitry facilitate the use of optogenetic techniques in cellular analyses of behavior. Fluorescent indicators of in vivo neural activity, such as GCaMP6s, have been widely used to study the neural activity associated with simple behaviors in larval zebrafish. Here, we present a protocol for detecting sensory-induced activity in semi-restrained zebrafish larvae using the transgenic line Tg(elav3:GCaMP6s). In particular, we use the chemical agent allyl isothiocyanate to induce a robust, reproducible fluorescent response in a brain region at the border of the hindbrain and spinal cord. We discuss the potential uses of GCaMP6s for optical monitoring of neural activity during a range of behavioral paradigms and the limitations of this technique. Our protocol outlines an accessible approach for monitoring dynamic, behavior-related in vivo neural activity in the larval zebrafish brain.

Here, we present a detailed protocol to examine neural activity in brain regions of transgenic zebrafish that express GCaMP calcium indicators using confocal microscopy.

Zebrafish larvae are a promising vertebrate model system for studying the neural mechanisms of behavior. Their translucence and relatively simple neural ...

Analyzing the Prey-Evoked Neuronal Activity in a Transgenic Zebrafish Larva

Source: Muto, A. et al.,&#160; <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57485">Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the method for studying visual prey detection in transgenic zebrafish larvae using calcium indicator-based fluoresce imaging with their neurons expressing fluorescent calcium indicator complexes.

ניתוח הפעילות העצבית המעוררת טרף בזחל דג זברה מהונדס

1. Ablation of a Subpopulation of Neurons Using a Two-photon Laser Microscope
NOTE: If users plan on performing Ca imaging following ablation, use the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Stimulation and Modulation Techniques

Adult Zebrafish Electrophysiology: A Method to Measure the Extracellular Electrical Activity of Neurons In Vivo

Source: Johnston, L., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/51065/" target="_blank">Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish</a>. &#160;J. Vis. Exp. (2013)
The protocol describes the procedure to perform electrophysiology in adult zebrafish. This method can be used for measuring neural activity in vivo.

אלקטרופיזיולוגיה של דגי זברה בוגרים: שיטה למדידת הפעילות החשמלית החוץ-תאית של תאי עצב ב-Vivo

Source: Johnston, L., et al. Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish. &#160;J. Vis. Exp. (2013)
The protocol describes the ...

הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video