Name: a human fallopian tube model for investigation of c. trachomatis infections
Uploaded: 2012-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי Cluster-DFG של אקסלנס &quot;דלקת ממשקים&quot; (RA-אם, RA-D). אנו אסירי תודה על הסיוע הטכני מצוין של קריסטין Wischnat.

1. הכנת מאגר כלמידיה Serovar trachomatis D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק confluent 175 ס&quot;מ 2 תאים התרבות בקבוק המכיל הלה-229 תאים עם 4 מ&quot;ל ג trachomatis פ SPG המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה למשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס במהלך הרעידות קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מ&quot;ל DMEM עם FCS 10% ו 240 Cycloheximide μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של חממה humidified עבור H 48 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל חרוזי זכוכית סטריליות, לוחצים חזק לנתק ולהרוס ג trachomatis מחסה הלה-229 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant ולהוסיף עוד 5 מ&quot;ל של חרוזי זכוכית סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוק שלוש פעמים דקות 1 להשמיד את כל-229 הלה תאים ושחרור ג trachomatis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 rpmi ו 4 ° C כדי לסלק פסולת תאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant לזיהום של 8 עד 10 175 התרבות 2 ס&quot;מ תא צלוחיות גרם confluentrown עם הלה 229 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל בקבוק עם חיץ 4 מ&quot;ל SPG ו 4 supernatant מ&quot;ל מזיהום הקודם למשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס עם הרעידות קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה מוסיפים 15 מ&quot;ל DMEM עם FCS 10% ו 230 cycloheximide μl ואחריו הדגירה 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל חרוזי זכוכית מעוקרים, ללחוץ לנתק ולהרוס ג trachomatis מחסה הלה-229 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant ולהוסיף עוד 5 מ&quot;ל של חרוזי זכוכית סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוק שלוש פעמים דקות 1 להשמיד את כל-229 הלה תאים ושחרור ג trachomatis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 rpmi ב 4 ° C כדי לסלק פסולת תאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי 40 מ&quot;ל של supernatant ב -50 צינורות מ&quot;ל פלקון, צנטריפוגות דקות 99 עם 11000 rpmi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה לבטל supernatant ולשטוף גלולה עם 1 מ&quot;ל SPG המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenizeגלולה ב SPG 1 מ&quot;ל ו - 20 μl aliquot ב 1, 5 מ&quot;ל חנות Eppendorf צינור, ב -70 ° C עד השימוש. הפעילות הביולוגית של מלאי מוכן אושר מודל הוקמה הלה-229 זיהום התא. </li></ol> 2. הכנת החצוצרות האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החנות אדם צינורות השחלה (HFT) של נשים שעברו כריתת רחם מיד לאחר הניתוח RPMI FCS המכיל 5% ללא אנטיביוטיקה ב 4 ° C עד הכנה. פרוטוקול שאושר על ידי ועדת אתיקה של אוניברסיטת ליבק (09-153). הנשים שנכללו במחקר (גיל 34 עד 53) ללא היסטוריה של ג לפני trachomatis זיהום. רקמות של החצוצרות נאסף על עיקור peripartum על פי בקשה של האם במהלך חלקים קיסרי או במהלך כריתת רחם עקב שרירנים ברחם סימפטומטיים בשלב הלוטאלי. HFT הכל נבדקו שלילי ג trachomatis ידי PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח HFT בצלחת פטרי שמכילה RPMI עם5% FCS ללא אנטיביוטיקה. במהלך עיבוד כל רקמה יש שקוע התקשורת כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנותקים וזורקים רקמות רקמת חיבור והרסו במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דיסקציה לפתוח את HFT בזהירות עם אזמל קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשך הניסויים להכין חתיכות של רקמות בגודל של 0.5 ס&quot;מ X 0.5 ס&quot;מ עד 1 ס&quot;מ x 1 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדגימה חנות זיהום HFT ב 1 מ&quot;ל RPMI המכיל FCS 5% ללא אנטיביוטיקה. דגימות HFT נדבקו 5.5x10 5 IFU (הכללה יוצרי יחידות) של C. trachomatis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימה HFT ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו - 21% מ 2, כמו גם 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו - 2% O 2 במשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן דגירה לאסוף הדגימה חנות מקבע של מונטי לפחות שלושה ימים ב 4 ° C עד הכנה SEM / TEM. </li></ol> 3. אופן ההכנה של הדגימה HFT עבור TEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבורTEM להסיר דגימה מן מקבע של מונטי וחותכים 2 X 2 מ&quot;מ עד 4 x 5 מ&quot;מ חתיכות. רקמת הנותרים יכולים לשמש עבור SEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את חתיכות עם חיץ נתרן cacodylate, pH 7.35 עבור H 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של% 1 (W / V) tetroxide אוסמיום ב אקווה dest. בן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר tetroxide אוסמיום עודף ידי שטיפה דקות 6x5 במאגר נתרן cacodylate, pH 7.35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של מים על ידי דוגרים בריכוזים הולכים וגדלים של אתנול במים (V / V) (30% עבור 2 שעות, 40% עבור 2 שעות, 50% עבור 2 שעות, 60% עבור 2 שעות, 70% בין לילה, 80% עבור 2 ח, 90% עבור H 1, 95% עבור H 1, 100% עבור H 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את אתנול דקות 2 15 x ב פרופילן אוקסיד ולאחר מכן להעביר תערובת של 50% (V / V) araldite מוכן טרי (כולל כל הרכיבים) על פרופילן דגירה בן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה araldite מוכן טרי (כולל כל הרכיבים) עבור שעות לפחות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר תבניות הטבעת שטוחים וממלאים araldite. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו araldite להקשות עללפחות 48 שעות ב 60 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חיתוך של מדגם מוטבע לחתוך חלקים דקים חצי (700 ננומטר) על ultramicrotome באמצעות סכינים זכוכית או סכין יהלום histo ואת כתם עם כתם של ריצ&#39;רדסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור דקים חלקים (כ -70 ננומטר) באמצעות סכין יהלום והעברה רשתות נחושת (למשל 150 רשת הריבוע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם דקים חלקים עם אצטט uranyl 0.5% (W / V) של אקווה dest. עקבו ב -3% (w / v) ציטראט להוביל אקווה dest. ב שטיינר בסעיף אוטומטי. לחלופין, ניתן לזהות קטעים מוכתמת באופן ידני על ידי השארת רשתות 15 דק &#39;על פתרון centrifuged רווי של אצטט uranyl ב אקווה dest. ואחריו ציטראט עופרת 0.3% (W / V) של אקווה dest. </li></ol> 4. הכנת הדגימה HFT עבור SEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור SEM להסיר דגימה מן מקבע של מונטי, המזרח עם אפיתל כלפי מעלה על 1.5 x גיליון 1 הפקק ס&quot;מ ולתקן המיקום באמצעות מחטים חרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הדגימה על הפקק כדי סלי מתכת מתאימיםלשטוף למשך 30 דקות במאגר נתרן cacodylate, pH 7.35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של מים על ידי דוגרים הדגימה ריכוז גדל והולך של אצטון / מים תערובות (V / V) 30% עבור 6 שעות, 40% עבור 6 שעות, 60% עבור 8 שעות, 70% בין לילה, 80% עבור 2 שעות, 90% עבור 2 שעות ו - 100% על הלילה (להיות זהירים מאוד כדי לשמור על הדגימה שקוע ברציפות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה אצטון 100% טרי הדגימה יבש על ידי ייבוש נקודה קריטית (טמפרטורה 40 ° C, לחץ 80 בר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מחטים, הפקק הדגימה דבק עם האפיתל כלפי מעלה בהר הדגימה SEM מצוידים הכרטיסייה פחמן מוליך באמצעות מלט פחמן מוליך. השתמש כסף מוליך נוזלי כדי לשפר את המוליכות בין הר ואת הכרטיסייה פחמן מוליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין ציפוי מוליך, זהב או פלטינה ופלדיום של הדגימה באמצעות גמגום coater. </li></ol> 5. מכתים סעיפים דקים דו עם הכתם של ריצ&#39;רדסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו חלקים דקים חצי יבש בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם חלקים עם מכתים פתרון על 60 מעלות צלזיוס במשך 1-2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרחץ אקווה dest. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטעים יבשים coverslip. </li></ol> 6. נציג תוצאות בתוך המודל הדבקת בני אדם השחלה צינור הצלחנו לדמיין הבדלים מורפולוגיה אפיתל בין שאינם נגועים שולטת (איור 1) ו ג trachomatis - שפופרות נגועות (איור 2) בתנאי normoxic. ההבדלים המורפולוגיים האופייניים משתמעת הפתוגן הנגרמת הנפיחות תמוגה של תאים החצוצרה אפיתל כי לא ניתן היה לזהות שאינם נגועים שולטת. באמצעות סעיפים דקים חצי אלקטרונים מיקרוסקופית הילוכים הצלחנו להוכיח ג תאיים הכללת trachomatis היווצרות in vivo לשעבר נגוע צינור האדם רקמות השחלה (איור 3, 5), אך לא בלתי נגועים שולטת (איור 4). כמו ריכוז החמצןtions בדרכי המין הנשי כבר נמוכה בתנאים פיסיולוגיים 11, ולהפחית עוד יותר בתהליך דלקתי כמו כן, אנו לחקור המודל שלנו בתנאי חוסר חמצן. תוצאות ראשוניות מצביעות מודל שימושי לנתח גידול הצאצאים כלמידיה ותחת חמצן בריכוזים שונים. כלמידיה הנגרמת נזק לתאים אפיתל יש להיפרד חפצים מתווכים דרך הכנת טיפול זהיר של החצוצרות לפני הזיהום (איור 6). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של השחלה הלא נגוע האדם לאחר הדגירה יום אחד בינוני הביקורת (החץ הירוק מראה תא ריסי, החץ הכחול מראה שאינו ריסי התא). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. סריקת אלקטרונים MICROS<html> עותק (SEM) של trachomatis vivo ג לשעבר נגוע החצוצרה האדם 1 הודעה ביום זיהום (הכללה לבן החץ סימן מקרע). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="איור 3" /> באיור 3. סעיפים דקים דו להראות תכלילים תאיים אופיינית (חיצים לבנים) 1D לאחר ההדבקה של חצוצרת הרחם האנושי עם ג לשעבר trachomatis vivo. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. הילוכים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) של צינור שאינו נגוע השחלה אדם לאחר הדגירה יום אחד במדיום שליטה. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. הילוכים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) של vivo לשעבר ג trachomatis נגוע החצוצרה האדם 1 הודעה ביום זיהום (חיצים לבנים מסמנים תכלילים כלמידיה). ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6. סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של האפיתל החצוצרה נזק תוך הכנת טיפול זהיר של הדגימה (לבן חיצים סימן יחסל את רקמת אפיתל).

<ol>
	<li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping.">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li><li>Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Chlamydia+trachomatis+deoxyribonucleic+acid+in+women+with+tubal+infertility.">Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility.</a> Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).</li><li>Peipert, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Genital+chlamydial+infections.">Clinical practice. Genital chlamydial infections.</a> N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).</li><li>Mardh, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubal+factor+infertility,+with+special+regard+to+chlamydial+salpingitis.">Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).</li><li>Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-specific+differences+between+tumor+cell+lines+and+normal+and+tumor+tissue+cells.">Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells.</a> Mol. Cancer. 5, 55 (2006).</li><li>Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gamma+interferon-mediated+antichlamydial+defense+mechanisms+in+human+and+mouse+cells.">Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells.</a> Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li><li>Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+is+the+initiator+of+Fallopian+tube+destruction+during+Chlamydia+trachomatis+infection.">Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection.</a> Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).</li><li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo.">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li><li>Wyrick, P. B., Knight, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-exposure+of+infected+human+endometrial+epithelial+cells+to+penicillin+in+vitro+renders+Chlamydia+trachomatis+refractory+to+azithromycin.">Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).</li><li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring.">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

ויזואליזציה של פגיעה הפתוגן הנגרמת לרקמה הנגועה הוא קשה ומוגבל קרובות להליכים ניסויים בעכברים. הקמנו מודל לשעבר זיהום vivo של החצוצרות האדם לנתח ג trachomatis זיהומים של דרכי המין הנשי העליון. על ידי שימוש בשיטה זו, הצלחנו לדמיין ג trachomatis - הנזק הנגרם על אפיתל האדם החצוצרה תוך זיהום פוסט אחד ביום. נפיחות תמוגה הסלולר היו שינויים מורפולוגיים אופייניים שנצפו ב C. trachomatis - החצוצרות נגועים אך לא בלתי נגועים שולטת. ניתוחים TEM גילה כי chlamydiae ליישם מחזור טיפוסי התפתחותי תאיים בתוך רקמות נגועות, מראה גדולה עם תכלילים מחדש הבדיל הגופים היסודיים, אלא גם תכלילים קטנים עם גופים reticulate מוגדלים שעשוי להצביע על ההתמדה. עם זאת, את התמונה המורפולוגית לבדו אינו מספיק כדי להבחין בין replזיהומים icating ומתמשך, המאופיינים חילוף החומרים מופחת גדל התנגדות antimicrobials 10. הרס של רקמת האפיתל של החצוצרות הוא נגוע או בשל שיבוש ג trachomatis - לתאי האפיתל נגוע לאחר השלמת מחזור ההתפתחות תאיים ושחרור של הגוף יסודיים זיהומיות או שחרור של ציטוקינים דלקתיים Pro-8. מחולל המחלה הנגרמת לרקמה נזק המארח המושרה תגובות חיסוניות נגד ג trachomatis אמורים להיות הגורמים העיקריים שהובילו אובדן תפקוד תא אפיתל, שיפוץ פיברובלסטים ועקרות תובל בסופו של דבר in vivo 8,11. אחת המגבלות העיקריות של מודל זה הוא העדר תאים דלקתיים אשר מעכבת את ניתוח של השפעות משניות על ג הראשונית trachomatis זיהום של האפיתל החצוצרה. עם זאת, המודל הוא APpropriate לחקור תנאים סביבתיים שונים (לדוגמא: תכולת החמצן) ואת התגובה הראשונית מארח חיסונית חריפה ג trachomatis זיהומים 8,9. תוכניות נוספות הן לבסס מודל לבדיקה של antimicrobials נגד ג trachomatis על שלמות החצוצרות אדם לאפיין את חילוף החומרים של מדינות בשלבי התפתחות שונים שנצפו האפיתל תובל על ידי מיקרוסקופ 2-פוטון סריקת לייזר.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-802 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> ת 15-101 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> סיגמא - אולדריץ&#39; </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SPG מאגר </td><td> שונים </td><td></td><td> ראו מתכון בהמשך </td></tr><tr><td> מונטי של מקבע </td><td> שונים </td><td></td><td> ראו מתכון בהמשך </td></tr><tr><td> cacodylate נתרן חיץ </td><td> שונים </td><td></td><td> ראו מתכון בהמשך </td></tr><tr><td> Rשל כתם ichardson </td><td> שונים </td><td></td><td> ראו מתכון בהמשך </td></tr></tbody></table> מתכונים: 1. SPG מאגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 75 גרם סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.47 גר &#39;הרכב: פוספט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.36 גר &#39;מונוסודיום פוספט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.72 גרם חומצה גלוטמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי 1 ליטר עם אקווה dest. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH 7.3. </li></ol> 2. 0.1 cacodylate M חיץ נתרן, pH 7.35. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 42.80 גרם נתרן dimethylarsenic מלח חומצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 68.46 גרם סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי 1 ליטר עם אקווה dest. כדי לקבל 0.2 נתרן M חיץ cacodylate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש פתרון לדלל עם אקווה dest. כדי הרצויה ריכוז ולהתאים את ה-pH 7.35 במידת הצורך. </li></ol> 3. מונטי של מקבע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 156 מ&quot;ל 0.12 cacodylate M חיץ נתרן. 3.2 הוסף 25 מ&quot;ל glutardialdehyde 25% אקווה dest. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 19 מ&quot;לParaformaldehyde 10% אקווה dest. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל 3 CaCl 2% בשנת אקווה dest. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH 7.35 וממלאים אקווה dest. לפתרון 312 מ&quot;ל הסופי. </li></ol> 4. כתם של ריצ&#39;רדסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים חלקים שווים של כחול מתילן 1% 1% בתמיסה מימית בורקס ו 1% Azur השנייה אקווה dest. </li></ol>

a human fallopian tube model for investigation of c. trachomatis infections

זיהומים בדרכי המין עם trachomatis כלמידיה (trachomatis ג) הם השכיח ביותר למחלות המועברות במגע מיני בקרב נשים ברחבי העולם. אישור התמדה בלתי יעיל או של פתוגנים עלולים להוביל עולה דלקות בדרכי המין העליון אמורים לגרום לנזק דלקתית כרונית 1,2 רקמות נגועים. כתוצאה מכך, sequelae קליני קשה כמו מחלה דלקתית של אגן הירכיים (PID), חסימת חצוצרות ו פוריות עלולה להתרחש 3,4. רוב המחקר עם ג trachomatis נערך על שורות תאים אפיתל (למשל הממולחים, 2 תאים והלה-229) או בעכברים. עם זאת, כמו התרבות תאים מבוססי מודלים, הם עושים לא משקפים את הפיזיולוגיה של רקמת יליד ולא פתופיזיולוגיה של C. המין trachomatis זיהומים בדרכי in vivo 5. מגבלות נוספות ניתנות על ידי העובדה כי איתות מפלי מרכזיים (למשל IFN-γ mediatאד Jak / מסלול איתות STAT) כי הצמיחה לשלוט כלמידיה תאיים שונים באופן בסיסי בין עכברים ובני אדם 6,7. אנחנו ואחרים הקימו ולכן האיבר כולו השחלה מודל צינור לחקור אינטראקציות ישירות בין ג trachomatis האדם תאים צינור השחלה לשעבר vivo 8,9. לשם כך, החצוצרות אדם מן הנשים שעברו כריתת רחם נאספו נגוע ג trachomatis serovar ד זיהום בתוך 24 שעות הודעה, הדגימה שבו ניתח באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ו במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) כדי לזהות trachomatis כלמידיה בתיווך נזק אפיתל, כמו גם ג הכללת trachomatis היווצרות של רקמת השחלה.

Watch this Scientific Journal Video about A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections at JoVE.com

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

אנו מתארים<em&gt; לשעבר vivo זיהום</em&gt; מודל הדמיה של אינטראקציות ישירות עם חיידקים פתוגנים אנושיים לתאי החצוצרה. דגם כל רקמות איבר הוקמה כדי לחקור<em&gt; ג trachomatis</em&gt; המושרה הפתולוגיה כדי חצוצרת הרחם הנשי תחת &quot;כמו החיים&quot; התנאים.

דגם האדם החצוצרה לחקירות<em&gt; ג trachomatis</em&gt; זיהומים

Genital tract infections with Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) are the most frequent transmitted sexually disease in women worldwide. Inefficient ...

a-human-fallopian-tube-model-for-investigation-c-trachomatis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

12.9K Views.  University of Lübeck. אנו מתארים לשעבר vivo זיהום מודל הדמיה של אינטראקציות ישירות עם חיידקים פתוגנים אנושיים לתאי החצוצרה. דגם כל רקמות איבר הוקמה כדי לחקור ג trachomatis המושרה הפתולוגיה כדי חצוצרת הרחם הנשי תחת "כמו החיים" התנאים.

Video: A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. Infective eggs are given by oral gavage, hatch in the distal small intestine, invade the intestinal epithelial cells (IECs) 
that line the crypts of the cecum and proximal colon and upon maturation the worms release eggs into the environment1. This model is a powerful tool to 
examine factors that control CD4+ T helper (Th) cell activation as well as changes in the intestinal epithelium. The immune response that occurs in 
resistant inbred strains, such as C57BL/6 and BALB/c, is characterized by Th2 polarized cytokines (IL-4, IL-5 and IL-13) and expulsion of worms while Th1-associated 
cytokines (IL-12, IL-18, IFN-&gamma;) promote chronic infections in genetically susceptible AKR/J mice2-6. Th2 cytokines promote physiological changes in 
the intestinal microenvironment including rapid turnover of IECs, goblet cell differentiation, recruitment and changes in epithelial permeability and smooth muscle 
contraction, all of which have been implicated in worm expulsion7-15. Here we detail a protocol for propagating Trichuris muris eggs which can 
be used in subsequent experiments. We also provide a sample experimental harvest with suggestions for post-infection analysis. Overall, this protocol will provide 
researchers with the basic tools to perform a Trichuris muris mouse infection model which can be used to address questions pertaining to Th proclivity in 
the gastrointestinal tract as well as immune effector functions of IECs.

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris infection is an intestinal model of Th2 immunity where resistant mice generate a protective Th2 response and susceptible mice generate a pathological Th1 response.

Trichuris muris זיהום: מודל של חסינות סוג 2, דלקת במעיים

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Immunology and Infection

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

זיהום בדרכי השתן במודל בעלי חיים קטנים: צנתור-Transurethral של זכר ונקבה עכברים

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

An Efficient Method for Extracting Human Fallopian Tube Epithelia for Single-cell Analyses

Human fallopian tubes are intrinsic to reproduction. The purpose of the fallopian tubes is to allow for the transit of sperm, the ovum, and if fertilization is successful, the embryo. The epithelial cells that line the inner surface of fallopian tubes are integral to both normal and abnormal fallopian tube processes, including disease initiation. After menopause, fallopian tubes cease to have a significant role in the body and the intraepithelial cell makeup changes. We describe a method in which these epithelial cells can be isolated from fresh fallopian tubes with minimal stromal cell contamination into a single-cell suspension. These cells can be grown in culture or used for further analysis such as flow cytometry and single-cell RNA sequencing. This isolation protocol can be achieved in 4-6 h and yields viable cells that can be used for immediate downstream analysis. This efficient protocol facilitates the isolation of fallopian tube epithelial cells with an enriched epithelial population.

This protocol describes a one-day method for the isolation of human fallopian tube epithelial cells. Isolated epithelial cells can be plated in 2-dimensional (2D) culture or dissociated into single-cell suspensions and utilized in downstream experiments, including flow cytometry and single-cell RNA sequencing.

שיטה יעילה לחילוץ אפיתל חצוצרות אנושיות לאנליזות של תאים בודדים

Human fallopian tubes are intrinsic to reproduction. The purpose of the fallopian tubes is to allow for the transit of sperm, the ovum, and if ...

Cancer Research

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Biology

Tubal Cytology of the Fallopian Tube as a Promising Tool for Ovarian Cancer Early Detection

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to the lack of markers or tools for the ovarian cancer identification, the early detection of HGSC remains challenging. Direct sampling of the fallopian tube can enhance sensitivity for detection of neoplastic cells when the tumor is not grossly visible. We developed a procedure to collect fallopian tube cells directly from freshly received surgical specimens, which has shown excellent correlation with histological findings. This approach lays a foundation for the future utility of minimally invasive laparoscopic screening in high-risk patient populations.

We explored a tubal cytologic method by sampling the fallopian tube directly post-surgical excision as a tool of ovarian cancer early detection. Here, we present a protocol to collect fallopian tube cells from freshly received surgical specimens.

Tubal ציטולוגיה של שפופרת Tube ככלי מבטיח עבור סרטן השחלות איתור מוקדם

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to ...

A Ligated Intestinal Loop Model in Anesthetized Specific Pathogen Free Chickens to Study Clostridium Perfringens Virulence

Necrotic enteritis was studied in chickens using various in vivo infection models. Most of these use a combination of predisposing factors, such as coccidiosis and diet, with gavage or administration via the feed using Clostridium perfringens. In these models, the comparison of multiple C. perfringens strains for virulence studies requires a large number of hosts to obtain significant results. Mortality during the course of the study can be high depending on the experimental model, hence raising ethical concerns regarding animal welfare in research. The development of new infection models requiring fewer animals to study pathogenesis, yet providing statistically significant and valid results, is important in reducing animal use in research. Intestinal ligated loop models have been used to study clostridial infections in various species such as mice, rabbits and calves. Following surgical procedures to create ligated loop segments, C. perfringens strains are injected directly into the loops to establish a close contact between the bacteria and the intestinal mucosa. Samples of the small intestine and luminal contents are taken at the termination of the procedures after a few hours. Multiple bacterial strains can be inoculated in each animal, hence reducing the number of required subjects in the experiments. Also, procedures are performed under general anesthesia to reduce animal pain. In chickens, this model would be more appropriate than oral administration to compare C. perfringens strain pathogenicity because fewer animals are needed, no predisposing factors are required to induce the disease, and pain is controlled by analgesics. The intestinal ligated loop model is poorly described in chickens and standardization is essential for its optimal use. This manuscript provides all the necessary steps to create numerous intestinal ligated loops in chickens and brings information on the critical points to obtain valid results.

A Ligated Intestinal Loop Model in Anesthetized Specific Pathogen Free Chickens to Study Clostridium Perfringens Virulence

Here we present a protocol to surgically create &#39;intestinal ligated loops&#39; in chicken small intestines. This procedure allows for the comparison of multiple Clostridium perfringens strains&#39; virulence in situ in a single host. This method markedly decreases the number of chickens usually necessary for similar in vivo experiments.

מודל לולאת המעי מחוברים בעופות חינם ומורדמת פתוגן מסוים ללמוד החיידק Clostridium התקפה אלימה

Necrotic enteritis was studied in chickens using various in vivo infection models. Most of these use a combination of predisposing factors, such as ...

Comprehensive Approach for Microbial Isolation from Hidradenitis Suppurativa Tunnels

Hidradenitis Suppurativa (HS) is a debilitating condition marked by painful nodules and abscesses, progressing to sinus tracts (tunnels) within the skin's dermal layers, causing significant discomfort, foul-smelling discharge, disfigurement, contractures, and scarring, which severely diminish the quality of life. HS is associated with alterations in the skin microbiome, impacting immune regulation and the skin's defense against harmful bacteria. Despite its prevalence, the contribution of the HS microbiome to disease pathology and the limited response to treatment remains largely unknown. To date, multiple 16S rRNA sequencing studies on HS tissue have only achieved genus-level granularity, identifying an increase in Gram-negative anaerobes and a decrease in skin commensals. A deeper understanding of microbial dysbiosis in individuals with HS is essential for optimizing treatment strategies. This requires a two-pronged approach to assessing the HS microbiome, including the isolation of bacterial species, which are often underutilized in translational studies focused on skin disorders. Isolating individual microorganisms from HS tissue is crucial for elucidating the role of bacteria in HS pathogenesis. Here, we highlight reproducible methods to successfully isolate anaerobic pathogens from HS tunnel tissue, providing the initial and most critical step in understanding bacterial role in HS. This method paves the way for targeted research into microbial contributions to HS and for developing more effective, personalized treatment strategies that address the complex microbial burden of this chronic condition.

We showcase a method to successfully isolate fastidious and anaerobic organisms from cutaneous sinus tracts (tunnels) in tissues excised from patients with Hidradenitis Suppurativa.

גישה מקיפה לבידוד מיקרוביאלי ממנהרות Hidradenitis Suppurativa

Hidradenitis Suppurativa (HS) is a debilitating condition marked by painful nodules and abscesses, progressing to sinus tracts (tunnels) within the skin's ...

Papanicolaou Staining: A Technique to Visualize the Cytological Features of Tubal Cells

Source: Chen, H. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55887">Tubal Cytology of the Fallopian Tube as a Promising Tool for Ovarian Cancer Early Detection.</a> J. Vis. Exp. (2017).
In this video, we demonstrate a modified protocol of Papanicolaou staining to study tubal cytology. This technique can be used to visualize the cytological features of malignant and non-malignant fallopian tube epithelial cells.

מכתים Papanicolaou: טכניקה כדי לדמיין את התכונות הציטולוגיות של תאי צינורית

Source: Chen, H. et al. Tubal Cytology of the Fallopian Tube as a Promising Tool for Ovarian Cancer Early Detection. J. Vis. Exp. (2017).
In this video, ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Staining Techniques

Cell staining

Transurethral Catheterization and Bacterial Inoculation to Generate a Urinary Tract Infection Model in Male Mice

Source: Zychlinsky Scharff, A., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54432">Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the establishment of uropathogenic Escherichia coli infection in a female mouse bladder through transurethral catheter instillation. The injected bacteria successfully establish a urinary tract infection within the bladder, providing a valuable platform for studying healthcare-associated diseases related to the urinary tract.

צנתור דרך השופכה וחיסון חיידקי ליצירת מודל דלקת בדרכי השתן בעכברים זכרים

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Immunology

Immunopathology

Host-Pathogen Interaction Models

Establishment of a Urinary Tract Infection Model in Female Mice

Source: Zychlinsky Scharff, A. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54432">Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the establishment of uropathogenic Escherichia coli infection in a female mouse bladder through transurethral catheter instillation. The injected bacteria successfully establish a urinary tract infection within the bladder, providing a valuable platform for studying healthcare-associated diseases related to the urinary tract.

דגם האדם החצוצרה לחקירות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video