Name: the use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (cfse) to monitor lymphocyte proliferation
Uploaded: 2010-10-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation at JoVE.com

העבודה דיווחו במאמר זה נתמך על ידי בריאות לאומי המועצה למחקר רפואי (NHMRC) של אוסטרליה תוכנית גרנט (CRP) ואת פרויקט NHMRC גרנט (CRP לבין BJCQ). כמו כן BJCQ הוא פיטר דוהרטי NHMRC עמית דוקטורים.

1) מגיב ההתקנה 1.1) מניות CFSE פתרון לצבוע CFSE נרכש כמו carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFDA, SE) (MW 557.47 g / חפרפרת), בדרך כלל 25 מ&quot;ג צלוחיות. ממיסים את 25 מ&quot;ג ב 8.96 מ&quot;ל DMSO לפתרון הסופי המניות של 5 מ&quot;מ (50-100 לאחסן aliquots μL ב -20 ° C במשך כמה חודשים). CFDA, SE יגיב עם בתמיסה מימית כך קריטי, כי חשיפה כזו להימנע במהלך האחסון. 1.2) לימפוציטים בידוד לימפוציטים מן הטחול או בלוטות הלימפה מעכברים resuspend ב 1 מ&quot;ל של מדיום תרבות (למשל RPMI) עם 5% חום מומת (HI) עוברית עגל בסרום (FCS), עם ריכוז תאים של בין 0.5 x אוקטובר 06-10 10 x 7 / mL. 2) CFSE תיוג 2.1) שגרתיות השיטה: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות resuspend תאים בנפח 1 מ&quot;ל של מדיום ומקום בקפידה התחתון של צינור (לא הרטובות) טריים חרוטי 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הצינור אופקית (באמצעות צינור אי - הרטובות תמנע 1 מ&quot;ל תאים ההשעיה מן מרגש בטרם עת ערבוב עם פתרונות CFDA SE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 110 μL של PBS לחלק בלתי הרטובות של הפלסטיק בחלקו העליון של הצינור כדי להבטיח שזה לא ליצור קשר עם פתרון התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 1.1 μL של המניה 5 מ&quot;מ של CFDA, SE ב 110 PBS μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כובע במהירות את הצינור ואת המערבולת להפוך גם לקבל אחיד ומהיר ערבוב של פתרונות. שים לב כי צבע CFSE הוא בריכוז הסופי של 5 מיקרומטר, לעומת זאת, הריכוז האופטימלי ייתכן שייקבע עבור כל אצווה מוכנים, ובדקה אז כל 6 חודשים על מנת להבטיח שהוא יעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים 5 דקות בטמפרטורת החדר. שים לב כי בעת המרה של CFDA, SE כדי CFSE (ראה דיון) צבען הופך הניאון נוטה ובכך הלבנה על ידי חשיפה לאור מוגזם. לפיכך, מומלץ להגן על הצינור מן האור מנקודה זו ואילך, למשל על ידי כיסוי אותו עם רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים על ידי דילול של 10 כרכים של 20 ° C PBS המכיל 5% HI FCS, sedimenting ידי צנטריפוגה XG ב 300 דקות ב 5 20 ° C ולהשאיר את supernatant. חזור על לשטוף פעמיים נוספות. </li></ol> 2.2) שיטה אלטרנטיבית, אשר מתאים גם מספרים התא גבוה יותר (10-30 x 10 7): <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 x (10 מיקרומטר) CFDA, פתרון SE על ידי הוספת 2 μL של המניה 5 מ&quot;מ עד 1 מ&quot;ל של PBS ובמהירות להוסיף זה 1 מ&quot;ל של תאים resuspended ביסודיות, אז מהר מכסה את הצינור ואת המערבולת להפוך גם לקבל אחיד מהיר ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים 5 דקות בטמפרטורת החדר לשטוף כמו בשלבים 2.1 (ו) ו 2.1 (ז). </li></ol> 2.3) תאים אז יכול להיות מיושם על פרוטוקול הריבית לזירוז של חלוקת התא. תאים תווית ניתן להשתמש גם במבחנה מבחני vivo. 2.4) בסיום של assay שגשוג התאים נקצרים ונותחו על ידי cytometry הזרימה (ראו להלן דוגמאות מייצגות). 3) נציג תוצאות כדי להעריך את התפשטות לימפוציטים על ידי דילול CFSE, כדאי לדעת את הקרינה של תאים המאוחדת (כלומר מרבית הקרינה) ולא שכותרתו תאים (כלומר הקרינה מינימום). לכן, תכנון הניסוי שלך צריך לקחת פקדים אלה בחשבון. להלן דוגמאות של במבחנה מבחני vivo באמצעות CFSE למדוד CD8 + T חלוקת התא על ידי cytometry הזרימה. 3.1) בשנת גירוי חוץ גופית איור 1 מציג את הפרופילים של CFSE CFSE שכותרתו ovalbumin (OVA) ספציפיים לקולטן תא T CD8 + מהונדס OT-T אני תאים לאחר 3 ימים עם התרבות תאים דנדריטים פעמו עם כמויות שונות של OVA. CD8 + T תאים מטוהרים מן בלוטות הלימפה והטחול של OT-אני עכברים תויגו עם CFSE ו 1 x 10 5 תאים בתרבית עם 3.3 DC x 4 10. DC פעמו בו עם OVA עבור שעה 1 ב 37 ° C ורחץ לפני פעמיים לתרבות. לאחר 3 ימים, התאים בהם קוצרים ומסומן עם אנטי CD8-APC נוגדנים Hoechst 33258 ולאחר מכן נותחו על ידי cytometry זרימה (50,000 אירועים שנאספו). חיים (Hoechst 33,258 -) CD8 + תאים מוצגים. כמו שולטת, CD8 + T תאים בתרבית לבד, מראה את עוצמת CFSE של אי מחולק לתאים, בעוד התאים הלא שכותרתו מציגה את פלואורסצנציה אוטומטי של התאים ואת גבולות של חלוקות תא לזיהוי. שים לב 4 פסגות CFSE ניתן לראות בכל אחד הפאנלים בדוגמה זו, המציין כי התאים שעברו עד 3 אוגדות. 3.2) בשנת גירוי vivo איור 2 מראה את הפרופילים של CFSE CFSE שכותרתו קולטן T-OVA ספציפי תא מהונדס CD8 + OT-T לתאים אני אחרי 3 ימים in vivo in נוכחות של OVA 20 מיקרוגרם. CD8 + T תאים מטוהרים מן בלוטות הלימפה והטחול של CD45.1 congenic OT-אני עכברים תויגו עם CFSE ו 5 x 10 6 תאים iv מוזרק לווריד הזנב לרוחב של C56BL/6J (CD45.2 +) בעכברים. לאחר 2 שעות הוזרקו לעכברים iv עם 20 מיקרוגרם של OVA. לאחר 3 ימים, spleens מעכברים נאספו, הפך ההשעיה תא בודד, שכותרתו עם אנטי B220-PerCP, אנטי CD8-APC-Cy7 ואנטי CD45.1-PE-Cy7 נוגדנים Hoechst 33258 ונותחו לאחר מכן על ידי cytometry זרימה (1,000,000 אירועים שנאספו). חיים (Hoechst 33,258 -) B220-תאים מוצגים בלוח השמאלי מגודרת CD8 + + CD45.1 התאים הראו בלוח הנכון. כמו שולטת, unstimulated CFSE שכותרתו CD8 + T תאים, מראה את עוצמת CFSE של אי מחולק לתאים, בעוד שאינו מסומן תאים מציגה את פלואורסצנציה אוטומטי של התאים ואת גבולות של חלוקות תא לזיהוי. שים לב כי השימוש הבדל CD45 allotypic חיוני בפתרון CD8 + T תאים שהועברו מהמחשב המארח, כפי שהם תת קטין מכלל התאים CD8 + T (הפאנל השמאלי). שים לב, רוב התאים ליפול בתוך 7 הפסגות CFSE בדוגמה זו (פאנל מימין), המציין כי התאים שעברו עד 6 חטיבות. <img src="/files/ftp_upload/2259/2259fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. היכולת של CFSE שכותרתו ovalbumin (OVA) ספציפיים קולטן T תא מהונדס CD8 + OT-I לתאי T להיענות במבחנה כדי DC פעמו עם ריכוזים שונים של OVA, הנתונים המוצגים להיות אחרי תרבות ימים 3. הערה האוכלוסייה הלא מחולק של CD8 + T תאים בהעדר אנטיגן (אור היסטוגרמה אפור) ו פלואורסצנציה אוטומטי של האוכלוסייה הלא מסומן (היסטוגרמה אפור כהה). איור מתאר CD8 + תאי T יש לחלק 1-3 פעמים על בסיס דילול CFSE פסגות, עם יותר תאים T חלוקת על ריכוזי אנטיגן גבוה יותר. <img src="/files/ftp_upload/2259/2259fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. היכולת של CFSE שכותרתו ovalbumin (OVA) ספציפיים קולטן T תא מהונדס CD8 + OT-I לתאי T, כאשר הועבר adoptively לעכברים C57BL / 6 כדי להגיב OVA, הנתונים המוצגים 3 ימים לאחר העברת המאמצת פאנל שמאל:. CD8 +, CD45. 1 + 1 תאים OT-T בעכברים הנמען. פאנל ימין: התפשטות פרופיל CFSE. הערה האוכלוסייה הלא מחולק של CD8 + T תאים בעכברים הנמען לא מקבל אנטיגן (אור היסטוגרמה אפור) ו פלואורסצנציה אוטומטי של אי שכותרתו לימפוציטים (היסטוגרמה אפור כהה). איור מתאר CD8 + תאי T יש לחלק 1-6 פעמים על בסיס דילול CFSE פסגות. <img src="/files/ftp_upload/2259/2259fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. ייצוג של אירועים מולקולריים שונים המתרחשים במהלך תיוג של תאים עם carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFDA, SE). לפרטים של התהליך לראות טקסט דיון. הערה: &quot;CFSE&quot; ראשי תיבות הגנרית, לא CFDA, SE, המשמש לתיאור מגיב תיוג תיוג את ההליך באופן כללי. איור המבוסס על פאריש 4.

<ol>
	<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry.">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).</li><li>Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+intracellular+fluorescent+dye+CFSE+to+monitor+lymphocyte+migration+and+proliferation.">Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation.</a> Current protocols in immunology. , (2009).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies.">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

על מנת להעריך את האופן CFSE עובד ולמה תיוג אחיד מהיר נדרש השימוש בניתוח תפוצת, כדאי להבין את הבסיס המולקולרי של תיוג תא CFSE. זה יכול להיות מחולק לשני שלבים, 1) ערך תא 2) תיוג חלבון (איור 3). 1) כניסה Cell: כניסה של צבע בתוך התא מתווך על ידי הטופס diacetylated של צבע, carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFDA, SE). Acetates להפוך את permeant צבע קרום מאוד המאפשר זרימה מהירה על פני קרום התא. Esterases, להציג בתוך התא, לדבוק acetates מ CFDA, SE ובכך להצמיח את הטופס CFSE של צבע אשר permeant קרום הרבה פחות, ובכך לרכז את צבען בתוך התא. 2) תיוג חלבון: בעוד הן CFDA, SE ו CFSE יש אמינו-reactive שרשראות צד succinimidyl, רק CFSE הוא פלורסנט. ריכוז גבוה של תאיים CFSE מאפשרת תיוג רמת מהיר גבוה של חלבונים תאיים. תיוג CFSE של תאים חייב להתבצע במהירות על מנת לקבל אוכלוסייה שכותרתו homogenously של תאים, שהוא קריטי לפתרון תאים שעברו מספר חטיבות כפי שמוצג בתוצאות נציג (איור 1 ו - 2).

<table><tbody><tr><td>CFDA,SE</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lymphocytes</td><td>eg mouse or human</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>SAFC Global</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-15ml conical tubes</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminium foil</td><td>Capral Aluminium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (cfse) to monitor lymphocyte proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) הוא אמצעי יעיל ופופולרי לפקח על חלוקת 1-3 לימפוציטים. CFSE קוולנטית תוויות חיים ארוכים מולקולות תאיים עם צבע פלואורסצנטי, carboxyfluorescein. לכן, כאשר תא CFSE שכותרתו מתחלק, הצאצאים שלו ניחן במספר מחצית carboxyfluorescein-tagged מולקולות ולכן כל חלוקת התא ניתן להעריך על ידי מדידת הירידה המקבילה הקרינה התא באמצעות cytometry הזרימה. הקיבולת של CFSE לתייג אוכלוסיות לימפוציטים בעוצמה גבוהה פלורסנט השונות נמוכה במיוחד, בשילוב עם רעילות לתא הנמוכה, להפוך אותו צבע אידיאלי למדוד חלוקת התא. מאז היא לצבוע והעמסת מבוססי זה גם תואם עם מגוון רחב של fluorochromes אחרים מה שהופך אותו החלים cytometry רב צבע זרימה. מאמר זה מתאר את ההליכים משמש בדרך כלל עבור תיוג לימפוציטים בעכבר לצורך ניטור עד 8 חלוקות תא. תאים אלה שכותרתו יכול לשמש הן במבחנה במחקרים vivo.

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation at JoVE.com

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE קוולנטית תוויות חיים ארוכים מולקולות תאיים עם צבע פלואורסצנטי, carboxyfluorescein. ככזה, כאשר תא CFSE שכותרתו מתחלק, הצאצאים שלה יש מחצית מכמות הקרינה, אשר יכול לשמש ובכך להעריך את חלוקת התא. מאמר זה מתאר את ההליכים משמש בדרך כלל עבור תיוג לימפוציטים עכבר עם CFSE.

השימוש Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl אסתר (CFSE) לפקח הפצת הלימפוציטים

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

the-use-carboxyfluorescein-diacetate-succinimidyl-ester-cfse-to

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

91.8K Views.  John Curtin School of Medical Research, Australian National University. CFSE קוולנטית תוויות חיים ארוכים מולקולות תאיים עם צבע פלואורסצנטי, carboxyfluorescein. ככזה, כאשר תא CFSE שכותרתו מתחלק, הצאצאים שלה יש מחצית מכמות הקרינה, אשר יכול לשמש ובכך להעריך את חלוקת התא. מאמר זה מתאר את ההליכים משמש בדרך כלל עבור תיוג לימפוציטים עכבר עם CFSE.

Video: The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

אנטיגן ספציפי In vivo להרוג Assay באמצעות תווית CFSE תאים היעד

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic strategies1. To overcome the issue of tumor heterogeneity, it is essential to develop assays and tools enabling phenotypic, (epi)genetic and functional identification and characterization of tumor subpopulations that drive specific disease pathologies and represent clinically relevant targets. It is now well established that tumors exhibit distinct sub-fractions of cells with different frequencies of cell division, and that the functional criteria of being slow cycling is positively associated with tumor formation ability in several cancers including those of the brain, breast, skin and pancreas as well as leukemia2-8. The fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) has been used for tracking the division frequency of cells in vitro and in vivo in blood-borne tumors and solid tumors such as glioblastoma2,7,8. The cell-permeant non-fluorescent pro-drug of CFSE is converted by intracellular esterases into a fluorescent compound, which is retained within cells by covalently binding to proteins through reaction of its succinimidyl moiety with intracellular amine groups to form stable amide bonds9. The fluorescent dye is equally distributed between daughter cells upon divisions, leading to the halving of the fluorescence intensity with every cell division. This enables tracking of cell cycle frequency up to eight to ten rounds of division10. CFSE retention capacity was used with brain tumor cells to identify and isolate a slow cycling subpopulation (top 5% dye-retaining cells) demonstrated to be enriched in cancer stem cell activity2. 
This protocol describes the technique of staining cells with CFSE and the isolation of individual populations within a culture of human glioblastoma (GBM)-derived cells possessing differing division rates using flow cytometry2. The technique has served to identify and isolate a brain tumor slow-cycling population of cells by virtue of their ability to retain the CFSE labeling.

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

This video protocol demonstrates the application of the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) for the identification and separation of different sub-populations of cells in human glioblastoma based on frequency of cell division.

זיהוי ובידוד של תאים מתחלקים לאט בGlioblastoma האנושי באמצעות Carboxy fluorescein Succinimidyl אסתר (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Medicine

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T<em&gt; בvivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the allograft early after transplantation, mount a graft reactive response against the transplanted organ, and initiate organ rejection2. Recent data suggest that suppressive macrophages facilitate successful long-term transplantation3 and are required for the induction of transplantation tolerance4. This suggests a multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation, and function, which demands a new roadmap for the isolation and analysis of macrophage function5. Due to the plasticity of macrophages, it is necessary to provide a methodology to isolate and characterize macrophages, depending on the tissue environment, and to define their functions according to different scenarios. Here, we describe a protocol for immune characterization of graft-infiltrating macrophages and the methods we used to functionally evaluate their capacity to inhibit CD8+ T proliferation and to promote CD4+Foxp3+ Treg expansion in vitro.

Macrophages are plastic cells of the hematopoietic system that have a crucial role in protective immunity and homeostasis. In this report, we describe optimized in vitro techniques to phenotypically and functionally characterize graft-infiltrating regulatory macrophages that accumulate in the transplanted organ under tolerogenic conditions.

אפיון פונקציונלי של מקרופאגים רגולטוריים המעכבים חסינות-תגובתי חסינות

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

פלואורסצנטי Dye תיוג של Erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

קוונפיקציה של מתרבים אנטיגן אנושי-ספציפי CD4+ T תאים באמצעות Carboxyפלואורומיתאת הדיקן אסתר

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation After Stimulation Using CFSE Staining and Flow Cytometry

Source: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3 
1 Unit for Lymphpoiesis, Department of Immunology, Pasteur Institute, Paris, France 
2 INSERM U1223, Paris, France 
3 Universit&#233; Paris Diderot, Sorbonne Paris Cit&#233;, Cellule Pasteur, Paris, France 
4 Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, France
The cell cycle is a universal process of life. During the cell cycle, a cell undergoes several modifications to divide into two daughter cells. This mechanism occurs throughout an organism&#39;s life in response to its needs. Cell divisions and embryonic development produce a full organism from a single-celled zygote. During adulthood, the cell cycle is central to many critical biological processes, such as tissue repairs.
Mechanisms of cell division are tightly controlled events where the cell undergoes stepwise modifications before final division. Cells that are not yet in the cycle are described as being in the Gap 0 (G0) phase. During this stage the cell is considered quiescent. When the cell starts to cycle, four distinct phases are recognized: Gap 1 (G1), Synthesis (S), Gap 2 (G2) and Mitosis (M). G1 phase is a checkpoint for resources needed by the cell for DNA synthesis. Then, S phase occurs, and DNA replication starts, followed by the G2 interphase, another checkpoint that controls all elements necessary to for the cell to divide. Finally, the cell enters mitosis and divides into two daughter cells.
Cell division is a highly informative parameter in many different biological systems. In the field of immunology, analysis of leukocyte proliferation can indicate the mechanism of the immune response. Other domains of investigation also rely on cell cycle analysis. For instance, analysis of the cell cycle during tumor development has improved our understanding of cancer.
Many fluorescent dyes are now available for tracking cell proliferation. These dyes differ in their chemical and spectral properties. Two different classes of dyes exist: protein dyes permanently combine with protein by forming a covalent bond, and membrane dyes stably intercalate within cell membranes via strong hydrophobic associations. In vitro and in vivo studies of immune cell proliferation by flow cytometry are among the most common applications of both classes of cell tracking dyes (1, 2).
CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) is a fluorescent dye that marks dividing cells. Initially, all the cells receive the same amount of dye; dividing cells evenly split the dye they received between their two daughter cells. Consequently, the cell cycle can be followed by the progressive decrease of dye intensity in the cells. CFSE staining is followed by conventional multi-parametric flow cytometry, a high-throughput, fluorescence-based technology that allows phenotypic and functional characterization of cells based on their degree of CFSE staining (3).
In the following experiment, we assess the proliferation of CD4+ and CD8+ T cells in-vitro, following CD3 stimulation, using CFSE staining and flow cytometry.

Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation

ניתוח מחזור התא: הערכת התפשטות תאי CD4 ו- CD8 T לאחר גירוי באמצעות כתמי CFSE וציטומטריית זרימה

Source: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Unit for Lymphpoiesis, Department of Immunology, Pasteur ...

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Immunology

An In Vitro Assay for Evaluating the Immunomodulatory Impact of Monocytes on Leukocyte Proliferation

Source: Hsu, P., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53265">Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs).</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates an in vitro assay to explore the immunomodulatory influence of mesenchymal stem cells (MSCs) on effector T cell proliferation. The assay includes co-culturing MSCs with PBMCs to induce the monocyte population to acquire an immunomodulatory phenotype, leading to the secretion of interleukin-10 (IL-10). Following incubation with activated CD4+ T cells, the induced monocytes effectively suppress T cell proliferation.

בדיקת מבחנה להערכת ההשפעה האימונומודולטורית של מונוציטים על התפשטות לויקוציטים

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Density Gradient Isolation of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunodiagnostics

In Vitro and In Vivo Models

An Assay to Evaluate Immunodominance in Cytotoxic T Lymphocyte Responses

Source: Choi, J. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/59531">Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video showcases a flow cytometry-based assay for assaying immunodominance in cytotoxic T lymphocytes or CTL responses. Injected fluorescent target cells exhibit varying fluorescence corresponding to immunogenic epitopes. Post-spleen collection and sorting reveal a reduction in high-intensity fluorescent cells, confirming immunodominance in CTL responses.

בדיקה להערכת דומיננטיות חיסונית בתגובות לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

השימוש Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl אסתר (CFSE) לפקח הפצת הלימפוציטים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video