L’objectif de ma recherche est d’obtenir l’information de confirmation critique de la bêta-amyloïde 1-40 lorsqu’elle est absorbée à la surface des nanoparticules d’or et qu’elle a lieu dans un processus d’agrégation réversible. Le défi auquel nous sommes confrontés dans ce domaine de recherche est d’obtenir des informations thermiques, chimiques et dynamiques sur le processus d’agrégation inverse. La grande découverte de ce projet est que nous sommes en mesure d’identifier le mouvement particulier ou le mode de vibration qui contribue à la confirmation pliée ou dépliée de la bêta-amyloïde 1-40 lorsqu’elle est absorbée à la surface des nanoparticules d’or.
Le grand avantage de l’utilisation de la spectroscopie de diffusion Raman améliorée en surface, SERS, est de détecter de très petits signaux de diffusion faibles afin d’identifier le mode critique pour provoquer le repliement et le dépliement. En même temps, nous sommes en mesure de déterminer la morphologie des agrégats. Les résultats que nous sommes en mesure de produire à partir de ce projet sont l’interaction clé de l’interaction protéine-protéine, qui sera importante pour provoquer l’oligomère et qui conduira à la fibrogenèse.
Pour commencer, à l’aide d’une micropipette, ajoutez un millilitre d’eau distillée déminéralisée à un milligramme de bêta-amyloïde lyophilisée, ou A bêta 1-40. Mélangez la solution avec un mélangeur vortex pendant environ 30 secondes. Assurez-vous qu’aucune particule solide ne reste dans la solution à température ambiante, environ 20 degrés Celsius.
Ensuite, préparez des solutions mères de peptides en utilisant de l’eau désionisée et distillée. Déterminez la concentration peptidique en mesurant spectroscopiquement l’absorption de la tyrosine à 275 nanomètres. Conservez les solutions mères A bêta 1-40 à moins 80 degrés Celsius.
Décongeler la solution mère de peptides environ cinq minutes avant la collecte des données. Dans un tube à centrifuger de 15 millilitres, mélangez huit microlitres de la solution peptidique avec 800 microlitres de particules colloïdales d’or. Ajoutez 4,2 millilitres d’eau distillée déminéralisée, puis agitez l’échantillon pendant 10 secondes.
Fixez la concentration des peptides bêta A 1-40 à 1,8 nanomolaire et ajustez le rapport entre les peptides et les particules colloïdales d’or dans la plage spécifique. À l’aide de l’unité de contrôle de la température du spectrophotomètre UV-visible, réglez la solution à température ambiante, environ 22 degrés Celsius. Surveillez le pH initial de la solution d’échantillon à l’aide d’un pH-mètre et ajustez-le légèrement en dessous du pH sept.
Collectez le spectre d’absorption dans la gamme de 400 à 800 nanomètres. Ensuite, ajustez le pH de l’échantillon à environ 4 en ajoutant des incréments de 1,0 microlitre d’acide chlorhydrique molaire. Collectez le spectre d’absorption dans la même gamme de 400 à 800 nanomètres.
Ensuite, ajustez le pH de l’échantillon à environ 10 en ajoutant des incréments d’environ 1,5 microlitre d’hydroxyde de sodium de 1,0 molaire. Collectez le spectre d’absorption dans la même gamme de longueurs d’onde de 400 à 800 nanomètres. Après cela, changez le pH entre pH 4 et pH 10 10 fois en ajoutant de l’acide chlorhydrique ou de l’hydroxyde de sodium.
Collectez en continu le spectre d’absorption à 25 degrés Celsius. Obtenez l’ensemble de données ASCII des longueurs d’onde en fonction de l’absorbance. Utilisez le programme PeakFit pour extraire les positions moyennes des pics de bande.
À l’aide de la fonction de tracé, tracez l’ensemble de données pour visualiser la densité optique en fonction de la longueur d’onde. Identifiez et marquez les longueurs d’onde de crête initiales, lambda un et lambda deux, en sélectionnant leurs positions approximatives dans les données tracées. Ajustez les données à l’aide de la fonction d’ajustement de crête du programme d’origine.
Obtenez le graphique affichant les positions des pics centraux pour chaque lambda étiqueté XCI, ainsi que les zones de bande correspondantes, notées AI. Exportez les positions de pic extraites et les zones correspondantes dans un tableur pour analyse. Calculez le facteur de pondération, AI, pour chaque centre de crête en comparant l’aire de la bande à l’aire totale de l’ensemble des bandes à l’aide de la formule affichée. Ensuite, extrayez la position moyenne du pic à l’aide de l’équation affichée à l’écran.
Pour générer un graphique de réversibilité, tabulez les positions de crête moyennes en fonction du numéro d’opération N.Attribuez le numéro d’opération N comme indiqué à l’écran. Analysez la position du pic en N à l’aide de la formule affichée. Transférez l’ensemble de données calculé dans le logiciel d’origine et tracez-le.
Sélectionnez l’ajustement de courbe non linéaire de l’analyse, entrez les valeurs initiales pour A, B, C, D et E, puis cliquez sur Exécuter pour terminer le processus d’ajustement de courbe. Pour réaliser l’imagerie Raman, pour chaque échantillon au numéro d’opération N, placer 100 microlitres de solution sur un disque de mica d’un diamètre d’un centimètre. Laissez les échantillons sécher pendant la nuit avant de prendre la mesure.
Ensuite, collectez des images en lumière blanche pour chaque numéro d’opération N.Préparez l’échantillon séparé sur un nouveau disque de mica car le pH est continuellement modifié entre 4 et 10. Collectez l’image Raman pour chaque numéro d’opération, et en utilisant les spécifications mentionnées d’un laser d’une longueur d’onde de 633 nanomètres. Capturez des images dans une grille de 100 x 100 pixels avec un temps d’intégration spécifique, en vous concentrant sur la région spectrale souhaitée.
Tracez le spectre représentatif de chaque numéro d’opération N aligné en fonction de N.Construisez une spectroscopie Raman tridimensionnelle améliorée en surface, ou spectre SERS, en fonction de N pour un or bêta de 1 à 40 de 20 nanomètres. Utilisez la vue de dessus du spectre comme carte de contour pour extraire les modes spécifiques associés à une condition de pH particulière. Identifiez les caractéristiques spectrales améliorées exclusivement à des numéros d’opération pairs ou impairs.
La bande SPR des nanoparticules d’or enrobées de bêta 1-40 est passée de 530 nanomètres à environ 650 nanomètres lorsque la solution a été rendue plus acide. Cela correspondait à la formation d’agrégats colloïdes d’or avec des monomères A bêta 1-40 dépliés, comme observé par TEM. Le changement de couleur dépendant du pH de l’or A bêta 1-40 était également évident.
Le décalage réversible dépendant du pH de la bande moyenne a culminé entre une longueur d’onde plus courte et une longueur d’onde plus longue, et la morphologie alternée dispersée et agrégée observée dans la MET a confirmé la nature quasi-réversible du processus. L’imagerie en lumière blanche a montré un modèle d’agrégation clair et réversible correspondant aux changements de pH, tandis que les spectres SERS ont montré de subtils changements dépendants du pH dans la région de l’empreinte digitale.
