Évaluation de la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps dans les cellules cancéreuses à l’aide d’un essai biologique de prototoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps

Il est bien connu que la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps est un mécanisme important par lequel les anticorps exercent certains effets à médiation immunitaire. Nous voulons donc trouver une meilleure méthode pour tester l’efficacité d’un médicament à base d’anticorps dans le traitement du cancer, en utilisant l’ADCCSA. Le protocole est rapide et simple.

En utilisant un protocole simple de mélange et de lecture, nous pouvons obtenir le résultat en une journée, accélérant ainsi la recherche. En utilisant le dosage biologique ADCC, nous pouvons effectuer un dépistage de masse des anticorps thérapeutiques avec plus de précision. Le rapport signal/bruit du test est élevé, ce qui peut aider à une évaluation précise de l’anticorps thérapeutique.

Pour commencer, la culture cible les cellules T BHT 101 et SW 1736 jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence dans des flacons T75. Après avoir retiré le milieu, lavez les cellules une fois avec du PBS et incubez-les avec un millilitre de tampon de dissociation cellulaire non enzymatique pendant cinq minutes. Ajoutez PBS pour arrêter la réaction.

Faites tourner les cellules à 135G pendant cinq minutes, puis ajoutez cinq millilitres de PBS. Déterminez le nombre de cellules et ensemencez les cellules à raison de 15 000 cellules par puits dans des microplaques de polystyrène blanc à 96 puits à fond plat et transparent. Pour commencer, préparez les cellules T cibles BHT 101 et SW 1736 pour le test.

Préparez ensuite le Cetuximab pour qu’il se lie au récepteur du facteur de croissance épidermique, et le Bevacizumab comme contrôle négatif. Pour fabriquer le tampon de biodosage ADCC, ajoutez 1,4 millilitre de sérum à faible immunoglobuline G dans 33,6 millilitres de RPMI 1640, comme fourni dans le kit. À l’aide du tampon, diluez les anticorps pour préparer 400 microlitres de chaque anticorps en trois concentrations différentes.

Préchauffez le tampon d’essai biologique ADCC dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Retirez les cellules effectrices de l’essai biologique ADCC de l’entrepôt frigorifique à moins 80 degrés Celsius et placez-les dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant environ deux à trois minutes. Balancez doucement et inspectez visuellement le flacon sans le retourner pendant le processus de décongélation.

Transférez ensuite 630 microlitres de cellules effectrices dans un tube de 15 millilitres, contenant 3,6 millilitres de tampon ADCCSA. Retournez doucement le tube deux fois pour mélanger les cellules avec le tampon. Pour commencer, préparez les cellules cibles, les cellules effectrices et les anticorps souhaités pour le test ADCC.

Après une nuit d’incubation, retirez le milieu des cellules cibles et ajoutez 25 microlitres de tampon bioacide ADCC suivi de 25 microlitres d’antagonistes dans les puits appropriés. Ajoutez ensuite 75 000 cellules transfuges dans 25 microlitres de tampon d’essai biologique ADCC par puits dans la microplaque de 96 puits contenant les cellules cibles, et incubez la plaque pendant six heures à 37 degrés Celsius. Pour préparer le réactif de dosage de la luciférase, ajoutez le tampon de dosage de la luciférase au substrat de dosage de la luciférase lyophilisée.

Ajoutez ensuite 75 microlitres du réactif de dosage de la luciférase dans chaque puits de la plaque contenant les cellules cibles, les anticorps et les cellules effectrices et incubez la plaque pendant 30 minutes à température ambiante. À l’aide d’un luminomètre, mesurez le signal de luminescence dans chaque puits pour fournir une lecture quantitative de l’activité de l’ADCC. Pour l’analyse des données, calculez l’induction du pli à l’aide de la formule.

Le cetuximab a induit une activité ADCC plus élevée à toutes les concentrations testées, mais aucune activité ADCC n’a été détectée avec le bevacizumab dans les lignées cellulaires BHT 101 et SW 11736, démontrant l’effet ADCC du ciblage des antigènes de la membrane extracellulaire EGFR pour les deux lignées cellulaires.