La barrière hémato-épinière est étroitement liée et a une perméabilité limitée. Ce protocole permet aux chercheurs d’ouvrir en toute sécurité et de manière transitoire la barrière hémato-épinière, à l’aide de microbulles et d’ultrasons focalisés. Cette technique permet de localiser l’ouverture de la barrière médullaire hémato-épinière sur le segment de moelle épinière ciblé.
De plus, la perturbation peut être facilement confirmée par observation visuelle ou microscopie à fluorescence. Ce protocole peut être exploré pour son potentiel dans l’amélioration de l’administration de thérapies géniques ou de médicaments à la moelle épinière pour le traitement des tumeurs, de l’atrophie ou des blessures. Meghana Bhimreddy fera la démonstration de la procédure.
Un excellent étudiant en médecine de mon laboratoire, qui comble quotidiennement le fossé entre l’ingénierie et la médecine. Pour commencer, faites l’acquisition d’un système de transducteur à ultrasons focalisés avec des spécifications suffisantes pour atteindre la barrière hémato-moelle épinière ou les ouvertures BSCB chez le rat. Fixez le porte-sonde imprimé en 3D et le cône d’eau sur le transducteur.
Assurez-vous qu’il y a un joint étanche entre le cône et le transducteur. Fixez la membrane en polyester stérilisée de 50 microns d’épaisseur et acoustiquement transparente au fond du cône d’eau à l’aide d’un élastique. Remplissez le cône d’eau avec de l’eau dégazée et déminéralisée à l’aide des tubes d’entrée et de sortie.
Évitez les bulles d’air à l’intérieur du cône, car elles peuvent perturber le couplage acoustique entre le transducteur et la cible. À ce stade, la membrane Mylar doit être légèrement gonflée. Connectez l’équipement d’entraînement contenant le générateur d’ondes et l’amplificateur d’entraînement de radiofréquence au transducteur.
Fixez le bras stéréotaxique à la plaque de fixation et fixez le porte-sonde au bras. Enregistrez le poids d’un rat femelle Sprague-Dawley anesthésié et effectuez un test de pincement des orteils et de la queue pour confirmer l’anesthésie. Placez un coussin chauffant et un tampon absorbant stérile sur la plaque de fixation.
Positionnez le rat sur le tampon absorbant. Appliquez une pommade pour les yeux et placez un thermomètre rectal pour surveiller la température corporelle. Palpez la dernière côte du rat, qui est attachée à la colonne vertébrale au niveau de la 13e vertèbre thoracique.
Utilisez un rasoir électrique pour raser la fourrure de la surface dorsale entre la dernière côte et le cou. Essuyez la peau exposée avec de la gaze imbibée de 10% d’iodopovidone. Créez une incision médiane à l’aide de ciseaux à iris et disséquez à travers le fascia jusqu’à ce que les apophyses épineuses et le limbe soient exposés.
Retirez l’os à l’aide d’une pince à os décalée et d’un ciseau à iris à lame coudée, jusqu’à ce que la moelle épinière soit exposée. Fixez le rat à la plaque de fixation en serrant les apophyses épineuses adjacentes à la laminectomie. Tirez ensuite légèrement sur les pinces pour tendre la colonne vertébrale.
Ajustez la position du transducteur avec le bras stéréotaxique jusqu’à ce qu’il soit situé exactement au-dessus de la laminectomie. Fixez l’appareil laser au fond du cône d’eau et abaissez-le jusqu’à ce que le point laser soit visible. Ajustez ensuite la position latérale du transducteur jusqu’à ce que le point laser soit au-dessus de l’emplacement cible pour la perturbation BSCB.
Retirez l’appareil laser et remplissez l’espace entre le cône et la moelle épinière avec du gel à ultrasons dégazé, sans introduire de bulles d’air. Réglez les paramètres de sonication sur la puissance de sortie du transducteur. Préparez une solution de microbulles selon les instructions du fabricant.
Pour augmenter les chances de réussite du cathétérisme de la veine caudale, trempez la queue dans de l’eau tiède et placez un garrot à la base de la queue pour agrandir le diamètre des veines. Insérez ensuite un cathéter de la veine caudale de calibre 22 et rincez avec 0,2 millilitre de solution saline héparinisée. Injectez un millilitre par kilogramme de colorant bleu Evans à 3 %, ou EBD, dans le cathéter.
Rincez ensuite le cathéter avec 0,2 millilitre de solution saline héparinisée. Confirmez le succès du cathétérisme de la veine caudale en vérifiant le changement de couleur bleue de la peau, des yeux ou de la veine vertébrale dorsale du rat. Injecter 0,2 millilitre de bolus de microbulles dans le cathéter et rincer avec une solution saline héparinée avant de commencer la sonication.
Après avoir euthanasié le rat, retirez la moelle épinière et placez-la dans du paraformaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, remplacez le paraformaldéhyde par du PBS. Pour visualiser la perturbation de la BSCB, isolez une section de deux centimètres entourant l’emplacement de la sonication, à l’aide d’une lame de rasoir.
Divisez la section en sections de 10 microns d’épaisseur à l’aide d’un microtome et colorez-la avec une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Pour la microscopie à fluorescence, déparaffinez la lame contenant la section de la moelle épinière et contre-colorez avec 25 microlitres de DAPI dissous dans le milieu de montage. Incubez les sections à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes dans l’obscurité pour éviter le blanchiment.
Après l’incubation, utilisez un microscope fluorescent pour imager toutes les lames. Imagez la lame colorée à l’hématoxyline et à l’éosine à l’aide d’un microscope optique. La vascularisation de la moelle épinière est visible après une laminectomie et montre la veine spinale postérieure, avec plusieurs vaisseaux plus petits rayonnant latéralement.
Après l’injection intraveineuse d’EBD, les tissus environnants et le système vasculaire de la moelle épinière sont apparus bleus. Après la sonication, une tache bleue devient visible au-dessus de l’emplacement ciblé, indiquant l’extravasation de l’EBD dans le parenchyme blanc, en raison de la perturbation de la BSCB. L’excision de la moelle épinière des rats à l’aide d’ultrasons focalisés de faible intensité, ou sonication LIFU, a confirmé l’extravasation apparente de l’EBD dans la moelle épinière.
Alors que les rats contrôlés négatifs sans traitement LIFU n’ont pas montré d’extravasation EBD. Les moelles épinières avec sonication LIFU ont montré une intensité significativement plus élevée d’autofluorescence EBD que les moelles qui n’ont pas reçu de sonication. Avec des intensités similaires de DAPI présentes dans les deux.
L’analyse de l’hématoxyline et de l’éosine n’a révélé aucune lésion neuronale, hémorragie ou cavité dans les emplacements sonisés. Des exemples de cordes blessées dues à une mauvaise manipulation chirurgicale et à une sonication de haute puissance sont présentés à titre de comparaison. Chez les rats qui ont reçu des microbulles et un traitement LIFU, aucun changement dans les scores moteurs, pré-sonication, post-sonication et pendant une période de survie de cinq jours n’a été observé.
Des changements minimes de la température de la moelle épinière ont été observés avant, pendant et après l’analyse de sonication. Il est important de limiter les dommages chirurgicaux à la moelle lors de la laminectomie. La visualisation des sections colorées H et E au microscope indiquera si des dommages se sont produits.
À la suite d’une rupture de la barrière hémato-épinière, à l’aide d’ultrasons de focalisation, des agents antinéoplasiques ou des thérapies géniques peuvent être injectés aux animaux. Le résultat déterminera si cette technique peut améliorer l’administration de la thérapeutique et prolonger la survie dans le cadre d’une pathologie de la moelle épinière.
