Ce modèle offre des possibilités expérimentales d’étudier divers aspects de la myélinisation du système nerveux périphérique in vitro. Il permet la quantification de la myéline et l’examen des interactions entre les cellules axonales et de Schwann. La co-culture développe une myélinisation robuste à partir du jour 14.
Les cultures d’explants DRG offrent l’avantage d’une architecture structurelle intacte par rapport aux cultures neuronales dissociées. Cette méthode est disponible pour dépister les composés tropotiques pour les maladies inflammatoires et neurodégénératives du système nerveux périphérique. Pour commencer, stérilisez la zone de travail dans le torse du rat euthanasié avec de l’éthanol à 70%.
Ouvrez le membre inférieur gauche dorsal du rat avec des ciseaux et retirez délicatement le muscle fémoral du biceps. Desserrez le nerf sciatique par élévation lisse avec des pinces incurvées, en veillant à ne pas meurtrir le nerf. À l’aide de forceps, transférer les nerfs coupés dans une boîte de culture tissulaire avec du milieu L-15 glacé de Leibovitz avec 50 microgrammes par millilitre de gentamycine.
Ensuite, à l’aide d’un stéréomicroscope, retirez la graisse, les muscles et les vaisseaux sanguins des nerfs avec deux paires de pinces fines. Identifier les extrémités proximale et distale du nerf sciatique et retirer l’épineurium avec une paire de pinces fines dans le sens proximal à distal tout en tenant l’extrémité nerveuse proximale avec la deuxième paire de pinces fines. Après avoir transféré les nerfs purifiés dans une autre boîte de culture tissulaire avec le milieu L-15 glacé de Leibovitz avec de la gentamycine, taquiner les fascicules nerveux isolés pour séparer et isoler les fibres nerveuses simples à l’aide de deux paires de pinces fines.
Transférer les fibres nerveuses dans un tube de 50 millilitres à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres et prendre le moins de milieu possible. Ensuite, ajoutez 50 millilitres de milieu L 15 de Leibovitz avec de la gentamycine aux fibres nerveuses en slew plusieurs fois. Centrifuger le tube contenant les fibres nerveuses à 188 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Après avoir retiré le surnageant, transférer la pastille avec le milieu L-15 de Leibovitz restant dans une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres. Rincez le tube de 50 millilitres avec 10 millilitres de la solution de digestion enzymatique et ajoutez-le au plat de fibres nerveuses. Répartir soigneusement les fibres nerveuses dans le plat avec la pointe d’une pipette.
Incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 18 heures. Et arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant 10 millilitres à 40% FCS dans HBSS. Transférer les nerfs digérés dans un tube de 50 millilitres pour centrifuger à 188 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille dans 10 millilitres de DMEM contenant 10% FCS et 50 microgrammes par millilitre de gentamycine. Ensuite, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine à cellules de 100 micromètres. après centrifugation à 188 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, remettre en suspension la pastille avec quatre millilitres de DMEM contenant du FCS et de la gentamycine.
Ajouter deux millilitres de suspension cellulaire à chacun des deux plats de culture tissulaire de 60 millimètres revêtus de polylysine et de laminine. Incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, en laissant les plaques intactes pendant deux jours dans l’incubateur. Centrifuger la suspension cellulaire de Schwann à 188 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, et remettre en suspension la pastille de cellule dans 90 microlitres de tampon de séparation cellulaire magnétique par une fois 10 à la septième cellule.
Ajoutez ensuite 10 microlitres de microbilles ti1 par une fois 10 aux septièmes cellules. Incuber la solution en suspension pendant 15 minutes dans l’obscurité à huit degrés Celsius. Ensuite, ajoutez deux millilitres dans le tampon de séparation cellulaire magnétique à la suspension cellulaire.
Après centrifugation à 300 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon de séparation cellulaire magnétique. Placez la colonne de séparation des cellules magnétiques dans le séparateur de cellules et humidifiez la colonne avec un millilitre de tampon de séparation des cellules magnétiques. Ensuite, appliquez les cellules pour recueillir le flux à travers pour la centrifugation.
Retirez soigneusement l’utérus d’une rat gravide euthanasiée et placez-le dans une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres avec HBSS glacé. En tenant l’utérus à l’aide d’une pince incurvée, ouvrez la paroi de l’utérus avec une pince fine. Retirez un sac amniotique et ouvrez-le soigneusement en pinçant un trou avec une pince fine.
Retirez rapidement tous les embryons de l’utérus et transférez-les dans un plat rempli d’HBSS. Délicatement, placez un torse embryon dans un plat de 35 millimètres rempli de HBSS. au microscope stéréoscopique, ouvrez la partie dorsale du torse pour diviser l’embryon en deux moitiés.
Tournez une moitié sur le côté et identifiez le brin de ganglions de la racine dorsale, ou DRG, situé dans la ligne à la partie dorsale de l’embryon. Découpez le DRG comme un brin entier à l’aide de pinces fines et de micro-ciseaux. Après avoir placé le DRG dans un plat frais rempli de deux millilitres de HBSS, séparez un seul DRG du tissu restant à l’aide de pinces fines et de micro-ciseaux.
Prenez une plaque de 4 puits contenant 190 microlitres de milieu de croissance DRG dans chaque puits, et transférez soigneusement un seul DRG au centre de chaque puits à l’aide de pinces fines et d’une spatule. Placez ensuite les cultures d’explantation DRG dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, ajoutez soigneusement 50 microlitres du milieu de croissance DRG à chaque puits et observez quotidiennement l’adhérence de l’explant DRG et la croissance axonale à l’aide d’un microscope.
Pour la co-culture le troisième jour de la culture d’explantation DRG, remplacez soigneusement le milieu de croissance DRG par 250 microlitres du milieu de co-culture contenant 30 000 cellules schwann par puits. Pour effectuer une coloration immunocytochimique, fixez les cellules sur les lamelles de couvercle en incubant les cellules lavées DPBS dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 10 minutes. Prenez des photos des échantillons colorés immunocytochimiquement dans huit régions définies entourant l’explant DRG au centre à l’aide d’un microscope inversé.
L’apparition de cellules de Schwann avec une morphologie allongée et fusiforme et les minces axones DRG dans une co-culture est représentée ici. La myélinisation dans la co-culture a été évaluée à différents jours en colorant les explants DRG et les cellules de Schwann pour la protéine de base de la myéline ou MBP, la tubuline bêta-trois et le DAPI. Le réseau axonal dans la co-culture était dense et n’a pas changé visiblement au cours de l’observation.
Les premiers signes de myélinisation étaient visibles aux jours 10 et 12 de la co-culture. À partir du jour 14, le signal MVP était plus prononcé et des axones enveloppés de myéline ont été détectés. La myélinisation a augmenté avec le temps de co-culture jusqu’au jour 20.
La myélinisation a été quantifiée comme un ratio des zones positives de tubuline MVP et bêta trois. Une augmentation significative de la myélinisation a été observée aux jours 18 et 20 par rapport au jour 10. Les cultures d’explantation DRG sont fragiles et doivent être manipulées avec précaution.
Par exemple, lorsqu’il est sorti de l’incubateur ou lors d’un changement de milieu et d’une fixation. L’analyse de l’expression génique d’échantillons de co-culture peut être formée pour étudier la myéline plus en détail. Ici, nous avons détecté les marqueurs de myéline PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 le jour 22.
