L’acide hyaluronique est l’une des matrices extracellulaires les plus abondantes dans le modèle animal. L’importance de l’acide hyaluronique dans le développement embryonnaire a été démontrée. Ce modèle in vitro est utile pour explorer comment les cellules de la crête neurale adhèrent et migrent dans la matrice extracellulaire riche en acide hyaluronique.
Grâce à notre technique, nous pouvons évaluer la migration et la capacité de dégradation de l’AH de la population en gros, puis des cellules individuelles au fil du temps. En outre, cette technique peut être utilisée pour le dépistage de médicaments afin de trouver des composés qui accélèrent ou empêchent la dégradation de l’HA. Pour commencer, diluez la matrice membranaire basale avec du PBS réfrigéré dans un rapport de 1:50 et conservez-la sur la glace.
Enduisez une plaque de culture de 10 centimètres avec 10 millilitres de la solution matricielle diluée et incuber la plaque à température ambiante pendant une heure. Lavez la plaque trois fois avec deux millilitres de PBS. Pour mettre en culture, les cellules O9-1 sur la plaque recouverte de matrice réchauffent la souche embryonnaire complète ou le milieu cellulaire ES dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.
Mélangez délicatement la suspension de cellules O9-1 et comptez le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Ajustez ensuite la concentration cellulaire à 1,1 million de cellules par millilitre avec le milieu cellulaire ES complet. Ajouter huit millilitres de milieu cellulaire ES complet préchauffé à la plaque de culture de 10 centimètres recouverte de matrice et ensemencer les cellules O9-1 à 1,1 million de cellules par plaque.
Incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez le milieu par un milieu de cellule ES complet frais préchauffé à 37 degrés Celsius. Remplacer par du milieu frais tous les deux ou trois jours par la suite.
Lavez la plaque de culture avec deux millilitres de PBS, puis ajoutez deux millilitres de trypsine-EDTA 0,25% préchauffé. Incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ajouter deux millilitres de milieu cellulaire ES complet préchauffé à la plaque de culture et transférer les cellules dissociées dans un tube conique de 15 millilitres.
Centrifuger le tube à 300g pendant cinq minutes et jeter le surnageant sans perturber la pastille de cellule. Ajouter deux millilitres de milieu cellulaire ES complet préchauffé dans le tube et remettre soigneusement les cellules en suspension par pipetage. Ensuite, ensemencez les cellules sur une nouvelle plaque de culture à la densité cellulaire souhaitée.
Ajouter soigneusement 50 microlitres de triéthoxysilane non dilué à un plat en verre de 3,5 centimètres et incuber pendant cinq minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Lavez le plat trois fois avec deux millilitres d’eau distillée et ajoutez 50 microlitres de glutaraldéhyde à 0,25% dilué 100 fois dans du PBS par boîte. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes puis laver quatre fois avec deux millilitres de PBS et enduire la vaisselle de 300 microlitres de collagène de type un dans 0,2 acide acétique normal à température ambiante pendant une heure.
Encore une fois, lavez trois fois avec deux millilitres de PBS. Ajouter 300 microlitres de 200 microgrammes par millilitre de fluorescéinamine, marqué hyaluronate de sodium H2 à chaque plat et incuber pendant une nuit à température ambiante. Lavez à nouveau avec deux millilitres de PBS trois fois.
Après avoir séché le plat de fond en verre enduit, fixez les deux inserts de culture de puits à la vaisselle et remplissez les inserts à l’extérieur avec un millilitre de PBS. Ensemencer les cellules O9-1 dans les puits à 10 000 cellules dans 100 microlitres de DMEM contenant 2% de sérum bovin fœtal ou FBS par insert. Culture des cellules pendant deux jours à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone, capturez des images à contraste de phase comme point de départ, à l’aide d’un microscope à fluorescence tout-en-un.
Retirez soigneusement les inserts de la vaisselle à fond en verre enduit avec une pince à épiler et lavez doucement les boîtes de fond en verre enduites avec deux millilitres de PBS pour éliminer les cellules et les débris cellulaires. Ajouter deux millilitres de DMEM frais contenant 2% de FBS dans les plats cultivés. Cultivez les cellules pendant 48 heures supplémentaires à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone et capturez des images à contraste de phase après 24 heures et 48 heures en culture.
Lavez la vaisselle avec du PBS et fixez les cellules après 48 heures avec un millilitre de paraformaldéhyde à 4% pendant 15 minutes à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez la vaisselle trois fois pendant cinq minutes chacune avec un millilitre de PBS frais. Enfin, placez un couvercle avec le support de montage pour une observation morphologique plus approfondie.
Les coupes transversales du tube neural des embryons du drapeau Tmem2 à E9.0 sont montrées dans cette figure. Les sections au niveau crânien et tronc du tube neural ont été marquées deux fois pour la protéine drapeau Tmem2 et l’hyaluronane. L’expression de Tmem2 a été observée dans la plaque neurale et la région frontalière du tube neural alors que ces sites étaient dépourvus de coloration hyaluronane.
Le double marquage des cellules de la crête neurale pour le drapeau Tmem2 et Sox9 est montré ici. Les sections transversales du tube neural E9.0 ont été colorées pour le drapeau Tmem2 et Sox9. Les images représentatives de cellules O9-1 appauvries en Tmem2 et témoins cultivées sur une boîte de culture régulière sont présentées dans cette figure.
L’expression de Tmem2 dans ces cellules a été évaluée par qPCR avec GAPDH comme contrôle interne pour la normalisation. Les cellules O9-1 appauvries en Tmem2 et témoins ont été cultivées pendant 48 heures sur des lamelles de verre recouvertes d’hyaluronan fluorescéniné. L’activité dégradante de l’hyaluronane se révèle sous forme de zones sombres dans le fond fluorescent.
Le niveau de dégradation de l’hyaluronane a également été comparé quantitativement entre les cellules appauvries en Tmem2 et les cellules témoins O9-1. La dégradation de l’hyaluronane lié au substrat aux adhérences focales dans les cellules O9-1 est illustrée dans cette figure. Les cellules O9-1 cultivées sur des substrats mixtes constitués de Col1/HA ont été immunomarquées avec un anticorps anti-vinculine.
Les taches ou stries sombres représentent l’activité de dégradation de l’hyaluronane dans le substrat FAHA H2. Les sites de dégradation de l’hyaluronane et les adhérences focales ont été co-localisés sur les substrats mixtes. Le revêtement Coval des plats à fond de verre avec de l’AH est une étape critique du protocole, car un revêtement inadéquat peut entraîner l’élimination facile de l’AH par force mécanique pendant l’adhérence et la migration.
Pour assurer un revêtement approprié, nous utilisons du glutaraldéhyde, du collagène de type un immobilisé chimiquement au verre via un couplage d’armement à l’aldéhyde. Il est possible d’utiliser un substrat de matrice extracellulaire à côté du collagène de type un, mais ils doivent avoir des groupes d’armement et il peut y avoir des limitations dans leur revêtement de coval sur des plats à fond de verre en raison de leurs propriétés chimiques. Des essais et des erreurs peuvent donc être nécessaires pour déterminer la meilleure approche.
Cette expérience de laboratoire peut être utile pour étudier le fonctionnement de certaines molécules pendant le mouvement des cellules de la crête neurale dans l’environnement HA ou HA autour du tube neural. Cela pourrait également être un moyen utile de tester un médicament qui pourrait accélérer ou empêcher ce processus de migration. Il est intéressant de savoir pourquoi Tmem2 a à la fois les fonctions d’adhérence sur HA et de dégradation de HA et pourquoi HA doit être dégradé sur le site de cohésion complète.
Puisque l’AH est la substance la plus courante dans la matrice extracellulaire, trouver la réponse à cette question est vraiment important en biologie et en médecine. Ce protocole expérimental est précieux car il peut être appliqué à divers types de cellules, y compris les fibroblastes cutanés, les cellules épithéliales et les cellules cancéreuses.
