Préparation de suspension unicellulaire de l’intestin de tilapia du Nil pour séquençage unicellulaire

Ce protocole fournit une référence fiable pour la préparation d’une suspension unicellulaire de haute qualité provenant de l’intestin du tilapia du Nil afin de faciliter les études au niveau unicellulaire chez les espèces de poissons d’aquaculture. La technologie est très efficace et peut être mise en œuvre dans la plupart des conditions de laboratoire. Il réduit le besoin d’essais supplémentaires pour préparer des suspensions unicellulaires pour les espèces de poissons d’aquaculture.

Commencez par rincer le tilapia du Nil âgé de six mois dans de l’eau stérile bien aérée pendant 15 minutes pour éliminer les bactéries lâches de la surface. Pour préparer le réactif de dissociation cellulaire enzymatique, diluer la collagénase dispase dans du PBS jusqu’à une concentration finale d’un milligramme par millilitre. Mélanger 95% du volume de la solution enzymatique préparée et 5% du volume de FBS.

Ensuite, pré-refroidissez la centrifugeuse à quatre degrés Celsius avant utilisation. Pour la dissection tissulaire, placez le poisson euthanasié sur de la glace et prélevez trois à quatre centimètres de la section médiane de l’intestin. Écuser la graisse et le mésentère à l’aide de forceps.

Enlevez la graisse attachée à la surface intestinale et la muqueuse claire élastique et malléable. Rincez doucement le fragment d’intestin avec du PBS glacé stérile à l’aide d’une seringue pour laver le contenu intestinal et le mucus. Après plusieurs lavages, disséquez le fragment en petits morceaux et transférez-les dans un tube de 1,5 millilitre contenant un millilitre de PBS glacé.

Centrifuger le mélange à 300 x g dans quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Et remplacez le surnageant par un millilitre de glaçon 0,08% BSA-DPBS. À l’aide d’une pipette en verre, aspirer doucement pour remettre en suspension les fragments de tissu.

Après avoir lavé les morceaux une fois de plus, retirez le surnageant et ajoutez un millilitre du réactif de dissociation enzymatique préparé. Mélangez également cinq microlitres d’inhibiteur d’ARN avec le réactif de dissociation pour le séquençage de l’ARN unicellulaire. Placez le tube au bain-marie tempéré à 37 degrés Celsius et inversez manuellement le tube toutes les cinq minutes pendant les 30 à 60 minutes d’incubation.

Une fois les tubes filés, retirez le réactif de dissociation cellulaire enzymatique à l’aide d’embouts de grand alésage. Ajouter un millilitre de glaçon à 0,08% BSA-DPBS et pipeter doucement les cellules de haut en bas pour éviter toute perturbation cellulaire. Après centrifusion et remise en suspension des cellules une fois de plus, placez la crépine cellulaire de 40 micromètres pré-mouillée avec 0,08% de BSA-DPBS sur un tube conique de 50 millilitres.

Passez la suspension cellulaire à travers la passoire. Tapotez la passoire, puis rincez-la avec 200 microlitres de DPBS et récupérez la suspension au fond du tube. Après avoir transféré la suspension dans un tube de 1,5 millilitre, ajoutez cinq microlitres d’ADN et incuber la suspension pendant 15 minutes à 15 à 20 degrés Celsius.

Une fois centrifugé, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 400 microlitres de DPBS glacé sans ions calcium et magnésium. Ensuite, pipeter doucement de haut en bas avec des pointes de large alésage pour mélanger les cellules et répétez ce processus une fois de plus. Pour la coloration, mélanger la suspension cellulaire dans une solution de bleu de trypan à 0,4% dans un rapport égal et incuber pendant trois minutes à température ambiante.

Ajoutez ensuite 10 microlitres du mélange sur la lame de verre. Comptez les cellules viables et mortes au microscope dans trois champs et calculez le pourcentage de viabilité cellulaire. Les efficacités de dissociation de plusieurs enzymes couramment utilisées ont été comparées.

Il a été vérifié que le mélange de collagénase dispase avait un meilleur effet de dissociation que la collagénase dispase ou la trypsine seule et plusieurs autres mélanges enzymatiques. L’examen microscopique a montré que les cellules intestinales avaient une viabilité élevée et se dispersaient sous forme de cellules individuelles. La plupart des cellules étaient viables, tandis que quelques-unes étaient colorées mortes à cause de la membrane cellulaire perméabilisée.

Faites attention au type de PBS utilisé. La solution de digestion enzymatique ne peut pas être utilisée avec du PBS sans calcium / magnésium car l’enzyme nécessite des ions calcium / magnésium pour fonctionner efficacement. La procédure facilite les études au niveau unicellulaire chez les espèces de poissons d’aquaculture, fournissant une référence précieuse pour le développement de protocoles de dissociation cellulaire des espèces de poissons d’aquaculture.