Ce protocole permet de mieux comprendre le microbiote naturel de C.elegans. Simultanément, les microbes isolés peuvent être utilisés dans des expériences de laboratoire contrôlées pour caractériser les interactions microbiote-hôte et la biologie de C. elegans. Ce protocole se concentre sur l’isolement des microbes associés à C. elegans dans la nature, qui sont donc essentiels pour comprendre la biologie de cet hôte modèle important dans un contexte plus naturel.
Il sera utile de se familiariser avec l’apparence de Caenorhabditis par rapport à d’autres nématodes. Pipetter sous le cadre de la dissection peut être difficile au début, mais la pratique sera utile. Commencez par recueillir les échantillons environnementaux comme le compost ou les fruits pourris dans des sacs en plastique séparés, des tubes ou des contenants propres.
Répartir uniformément les morceaux des échantillons environnementaux prélevés dans une boîte de Petri vide stérile de neuf centimètres et ajouter environ 20 millilitres de milieu visqueux stérile pour couvrir l’échantillon avec le milieu. Au microscope à dissection, rechercher des nématodes Caenorhabditis en suivant les lignes directrices sur l’isolement de Caenorhabditis elegans et des nématodes apparentés. À l’aide d’une pipette de 20 à 100 microlitres, prélever la plus petite quantité possible de liquide contenant les nématodes Caenorhabditis de la plaque et la transférer dans la boîte de Petri de trois centimètres contenant un à trois millilitres de M9T stérile.
Pour établir une population de vers, les vers individuels peuvent être transférés sur une plaque avec un milieu de croissance de nématodes ou NGM. Pour laver les nématodes et éliminer les microbes présents à l’extérieur des nématodes, incuber dans M9T pendant 10 à 15 minutes. Extraire à la pipette la plus petite quantité possible de liquide contenant les nématodes et la transférer dans une nouvelle boîte de Petri stérile de trois centimètres contenant un à trois millilitres de M9T frais.
Pour une identification impartiale des microbes associés aux nématodes, préparer une plaque de 96 puits avec environ trois billes stériles d’un millimètre de diamètre et ajouter un mélange de 19,5 microlitres de tampon PCR et 0,5 microlitre de protéinase K par puits. Transférer un seul nématode lavé dans chaque puits avec le moins de liquide possible. Briser les nématodes transférés à l’aide d’un homogénéisateur de billes pendant trois minutes à 30 hertz et centrifuger les plaques ou les tubes à 8 000 g pendant 10 secondes à température ambiante pour amener le liquide au fond.
Pour identifier C. elegans, chauffer les échantillons dans un cycleur PCR pendant une heure à 50 degrés Celsius et 15 minutes à 95 degrés Celsius pour isoler l’ADN de nématodes individuels, ou utiliser des trousses commerciales pour isoler l’ADN des populations de vers. Congeler l’ADN isolé à moins 20 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Utilisez l’ADN et la paire d’amorces NLP 30 avant et NLP 30 inversé et produisez un produit PCR à 154 paires de bases.
Pour isoler les bactéries, préparez une plaque de 96 puits avec environ trois billes stériles d’un millimètre, 20 microlitres de tampon M9 par puits, et pipeter un seul nématode lavé dans chaque puits avec le moins de liquide possible. Briser les nématodes comme démontré avant d’utiliser un homogénéisateur de billes, suivi d’une brève centrifugation de la plaque pour amener le liquide au fond. Une fois cela fait, récupérez la suspension et diluez-la en série à une proportion de un à 10.
Plaquer jusqu’à 100 microlitres de suspension diluée sur des plaques de gélose de neuf centimètres. Incuber ensuite les plaques à 15 à 20 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures. Pour obtenir la culture bactérienne pure, prélevez une seule colonie dans la plaque incubée à l’aide d’une boucle stérile ou d’un cure-dent et faites-la glisser sur une nouvelle plaque de gélose contenant le même milieu gélosé utilisé lors de la purification.
Assurez-vous de n’utiliser que 1/3 de la plaque. Ensuite, stérilisez une boucle réutilisable ou utilisez une nouvelle boucle stérile et faites-la glisser à travers la première traînée pour créer une deuxième traînée sur une autre partie 1/3 de la plaque d’échantillonnage. Répétez-le en faisant glisser une boucle à travers la deuxième traînée et en créant la troisième traînée pour obtenir la croissance de la colonie unique.
Incuber la plaque dans les mêmes conditions de croissance que celles utilisées pour l’isolation et, si nécessaire, répéter l’étape de purification. Cultiver les colonies pures dans un milieu liquide en utilisant les mêmes conditions de température et de croissance. Ensuite, caractérisez les bactéries en extrayant l’ADN bactérien de cultures liquides pures amplifiant l’ARN ribosomique 16S à l’aide de 27 amorces directes et 1495 amorces inverses et en effectuant la PCR comme décrit dans le texte.
Lorsque les échantillons de fruits et de compost prélevés ont été distribués dans des boîtes de Petri et immergés dans un milieu liquide ou visqueux, les vers ont quitté le substrat et nagé à la surface du milieu. Les microbes ont été isolés sous forme de colonies uniques pures et la purification a joué un rôle essentiel car certaines bactéries associées à C. elegans peuvent former des biofilms ou s’agréger facilement, ce qui donne lieu à des cultures multi-espèces. La PCR utilisant les amorces spécifiques de C.elegans, à savoir NLP 30 avant et NLP 30 arrière, a abouti à l’amplification d’un produit de 154 paires de bases pour C.elegans.
L’ADN isolé à partir de vers uniques a entraîné de faibles bandes de PCR, tandis que l’extraction de l’ADN des populations de vers composées d’au moins 50 vers a donné une plus grande quantité et des bandes plus claires. Le succès de la PCR spécifique de C. elegans a été confirmé en exécutant l’ADN d’une souche de laboratoire à savoir N2 comme témoin positif simultanément avec l’ADN des nématodes isolés Les microbes sont partout. Par conséquent, il est essentiel de travailler dans des conditions stériles pour s’assurer que les microbes isolés sont vraiment associés au ver dans la nature.
Les microbes isolés peuvent être utilisés pour étudier les interactions hôte-microbiote ou le rôle des microbes sur la biologie de l’hôte, par exemple, le vieillissement, le développement ou l’immunité dans des expériences de laboratoire contrôlées. Les microbes isolés avec cette technique sont actuellement utilisés par la communauté C.elegans pour améliorer la compréhension de la diversité du microbiote sur la condition physique de l’hôte ou le rôle des microbes sur l’immunité.
