Nous avons abordé les humeurs d’activation et de recalcul des médicaments de S1PRS par l’équipage, les manipulations EM et l’état gastro-intestinal A M P A et une base moins importante pour le développement d’un médicament qui cible solidement S1PRS Les progrès permettent de viruliser les sous-peintures magnistiques de la stimulation ou de l’habitation GP ZR et d’autres avantages dans la découverte des sites de liaison normaux pour la création de médicaments ciblant T BCR. La qualité de l’échantillon est la base de tout dans l’expérience EM correcte. Les facteurs essentiels pour une préparation simple comprennent divers états de produit de la vente de ligne SF et une concentration de N g Démonstration de la procédure sera Heli Wang un étudiant diplômé de mon niveau.
Pour la purification des protéines, cette scène de doigt un récepteur phosphate ou une solution complexe protéique S P r s g à une chromatographie d’exclusion de taille ou colonne de filtration sur gel S E C prééquilibrée avec un tampon S E C à un débit de 0,5 millilitres par minute à quatre degrés Celsius. Pour utiliser les fractions collectées pour la cryomicroscopie électronique, concentrez-les à l’aide d’un concentrateur de coupure de 100 kilodaltons à 1 300 XG à quatre degrés Celsius. Pendant le traitement des données pour la classification 2D dans la classification préliminaire des particules, choisissez la fonction de classification 2D dans le logiciel Rely On et cliquez sur Parcourir à droite du fichier étoile des images d’entrée dans l’option IO.
Choisissez ensuite le particles.star. Ensuite, dans l’option d’optimisation, définissez le nombre de classes sur 100 et le diamètre du masque A sur 140. Dans l’option de calcul, définissez le nombre de particules regroupées sur 10 et entrez le répertoire à partir d’un lecteur local rapide et rapide dans le champ copier la particule vers le répertoire de travail.
Pour un traitement plus rapide, sélectionnez oui pour l’accélération GPU utilisée. Pour la sélection de sous-ensembles de bons résultats 2D en tant que modèles, accédez à l’option IO de la fonction de sélection de sous-ensembles et cliquez sur Parcourir à droite de sélectionner des classes de model.star. Ensuite, choisissez run_it025_model.
Étoilez comme entrée et cliquez sur Exécuter dans la fenêtre contextuelle Cochez Trier les images et inverser le tri. Cliquez ensuite sur l’affichage. Après avoir choisi de bons résultats 2D représentatifs comme référence pour la référence de la fonction de sélection automatique, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Enregistrer les classes sélectionnées.
Pour utiliser le modèle pour la deuxième série de prélèvement automatique, accédez à l’option E/S de la fonction de prélèvement automatique. Cliquez sur Parcourir à droite de Micrographies d’entrée pour la sélection automatique, puis choisissez micrographs.star. Cliquez ensuite sur Parcourir à droite des références 2D et choisissez class_averages.star.
Aussi, sélectionnez non pour ou utilisez leplossian dans de gaussien. Ensuite, effectuez l’extraction de particules à l’aide du suffixe de soulignement du cordon automatiquement pick.star. Effectuez une classification 2D à l’aide de particules.
, suivie de la sélection du sous-ensemble à l’aide de Run Underscore It Zero 20 five_optimizer. étoile Pour l’extraction des particules, après avoir cliqué sur Parcourir à droite du fichier étoile micrographique dans l’option IO, choisissez micrographies. et sélectionnez Oui pour ou Réextraire les particules raffinées.
Après avoir cliqué sur Parcourir à droite du fichier étoile des particules raffinées, sélectionnez particules. pour générer un modèle 3D initial et une carte de référence, cliquez sur Parcourir le modèle initial 3D à droite du fichier étoile d’images d’entrée dans l’option IO et choisissez le fichier particles.star précédent. Ensuite, dans l’option d’optimisation, définissez le nombre de classes sur une et le diamètre du masque A sur 140.
Pour la classification 3D et la génération d’une carte 3D préliminaire, après sélection des particules. Comme illustré précédemment, cliquez sur Parcourir à droite de la carte de référence et choisissez Initial Underscore Model Dot MRC. Ensuite, dans l’option d’optimisation, définissez le nombre de classes sur quatre à six et le diamètre du masque A sur 140.
Pour la génération de masques, après avoir sélectionné une bonne carte 3D en entrée dans l’option E/S, définissez le seuil de binarisation initial sur 0,05 et étendez la carte binaire à ce nombre de pixels à trois. Ensuite, accédez à l’option de masque et définissez. Ajoutez un bord souple à ce nombre de pixels à huit.
Pour le traitement suivant, ouvrez le logiciel Trino Spark, créez un nouvel espace de travail et cliquez sur Job Builder pour la première tâche. Pour importer la pile de particules, entrez le chemin de la particule dans le champ du méta-chemin des particules et le chemin des films dans le champ du chemin des données des particules. Ensuite, importez des volumes 3D en entrant le chemin du meilleur volume 3D généré auparavant dans le chemin de données du volume et en sélectionnant le masque pour le type de volume importé.
Pour un raffinement non uniforme, faites glisser les particules de soulignement importées précédemment générées en tant qu’entrée de particules de raffinements non uniformes. Le volume de soulignement importé, le trait de soulignement un en tant qu’entrée du volume des raffinements non uniformes et le masque de soulignement importé le trait de soulignement un en tant qu’entrée du masque d’affinement non uniforme. Masque. Ensuite, cliquez sur Q pour démarrer le traitement et répétez la procédure pour obtenir une bonne résolution.
Carte 3D S1PRGI. Après la construction du plasmide et la préparation pour la transfection transitoire, ajoutez deux microgrammes d’ADN préparé dans 200 microlitres de tampon de réactif de transfection. Mélanger en tourbillonnant pendant 10 secondes et en faisant tourner le mélange brièvement avant utilisation.
Ajoutez quatre microlitres de réactif de transfection et mélangez-le en tourbillonnant et en tournant comme démontré précédemment. Après avoir incubé le tube à température ambiante pendant 15 minutes, déposez lentement 200 microlitres du mélange de transfection dans chaque puits d’une plaque de six puits contenant des cellules CHOK one et agitez doucement la plaque ou mélangez soigneusement. Après quatre à six heures d’incubation, remplacez le milieu de transfection par le milieu de croissance cellulaire constitué de milieu F 12 et 10%fbs avant de remettre la plaque dans l’incubateur.
24 à 48 heures après la récolte des cellules par transsection, suspendre les cellules dans trois millilitres d’un tampon SA avec du sel de potassium luciférien D. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 90 microlitres de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de 96 puits mélangée délicatement et incuber à température ambiante pendant 40 minutes. Pour la détermination du signal de fluorescence, préparer d’abord 10 solutions mères millimolaires de siponimod dans D M S O.Puis faire une dilution en série dans un tampon H B S S contenant 25 micromolaires forscaline et stimuler les cellules avec 10 microlitres de différentes concentrations de cette solution agoniste pendant 30 minutes.
Ensuite, comptez le signal de luminescence dans un lecteur de microplaques en sélectionnant la méthode de luminescence pour la détection. Point de terminaison pour le type de lecture et fibre de luminescence pour le type d’optique dans le logiciel associé. Réglez également le gain optique sur 255.
Ensuite, importez les valeurs de signal de fluorescence obtenues dans un tableur et traitez les données à l’aide de la fonction dose-réponse non linéaire de la courbe de régression. Le complexe gastro-intestinal S1PRS a pu être purifié avec succès par chromatographie d’exclusion de taille, ce qui a été vérifié par la page SDS. De plus, le protocole de microscopie électronique suivi dans cette étude a été efficace pour différencier les particules S1PRSGI avec des classes 2D claires et bien définies et les particules de mauvaise qualité.
De plus, une carte de microscopie électronique de S1PR3 GI avec une bonne résolution pourrait être générée par corrélation de la coquille de fourreur grâce à un raffinement non uniforme. Après analyse structurale, des dosages fonctionnels pour S one P R trois ont été effectués par transfection de cellules C H O K one avec plasmides récepteurs et capteurs, ce qui a révélé que le rapport plasmide récepteur/plasmide capteur de un à trois produit des résultats optimaux. Cependant, les résultats étaient moins réalistes dans 2 93 cellules Dans ce traitement, le choix des algorithmes en section de particules et la section de classification 2D et 3D est important pour résoudre les complexes protéiques MPS G en particulier pour modéliser les fuites et les ecfs.
