Cette méthode peut générer rapidement des images à haute résolution qui permettent une analyse de la distribution spatiale et une quantification des signaux fluorescents dans les cellules tout en permettant une analyse rapide de plusieurs échantillons. Les cellules sont mesurées à l’aide du système avancé de cytométrie en flux d’imagerie, combinant vitesse, sensibilité et images détaillées d’une cellule unique avec des informations spatiales produisant des données uniques qui ne peuvent pas être fournies par l’optométrie ou la microscopie des flux. Un conseil important est de fournir suffisamment de cellules pour établir les réglages de l’instrument et nous suspendons les cellules à haute densité pour les mesures.
En dehors de cela, l’acquisition de données est simple et similaire à la cytométrie en flux conventionnelle. Générez d’abord les lignées cellulaires du LDGCB comme décrit dans le manuscrit. Ajoutez ensuite une solution d’EdU millimolaire de 10 millimolaires dans un rapport de 1 à 1000 dans la culture cellulaire DLBCL et incuber la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5% à 37 degrés Celsius pendant trois heures après avoir mélangé la plaque par bascule douce.
Retirer la plaque après l’incubation et ajouter une solution de chloroquine de 100 millimolaires jusqu’à une concentration finale de 75 micromolaires. Mélanger en berçant doucement et incuber pendant 30 minutes. Ajouter ensuite 20 millimolaires de solutions de FDG C12 jusqu’à une concentration finale de 20 micromolaires.
Après un mélange doux, incuber la plaque pendant une heure comme démontré précédemment. Ensuite, ajoutez 100 millimolaires de solution de 2-phényléthyl-bêta-d-thiogalactoside à un à 50 pour arrêter la coloration bêta-gal FSA. Et tournez doucement la plaque pour mélanger.
Transférer les cellules dans des tubes centrifugés stériles de 15 millilitres et tourner à 100 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Une fois le surnageant jeté, lavez les cellules avec quatre millilitres de PBS et centrifugez à 100 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, re-suspendez les granulés cellulaires dans 500 microlitres à 4% de solution de fixation de paraformaldéhyde.
Après 10 minutes d’incubation à température ambiante, centrifuger à 250 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Jeter le surnageant et laver les cellules avec quatre millilitres de PBS deux fois et centrifuger à 100 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Après le lavage, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 200 microlitres de tampon de perméabilisation à la saponine.
Maintenant, transférez la suspension dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Enduire les cellules à 250 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, re-suspendre les cellules dans 200 microlitres de solution d’anticorps primaires et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit, dans l’obscurité.
Centrifuger les tubes à 250 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant et laver avec 100 microlitres de solution de lavage de saponine. Après avoir lavé les cellules deux fois, jetez le surnageant et remettez en suspension les granulés de cellule dans 500 microlitres de cocktail de détection EdU.
Incuber à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité et centrifuger à 250 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Jeter le surnageant et laver avec un millilitre de solution de lavage de saponine. Répétez le lavage deux fois, jetez le surnageant et remettez en suspension les granulés de cellule dans 20 à 50 microlitres de PBS.
Avant d’allumer l’instrument, videz la bouteille de liquide usagé et vérifiez les niveaux de SpeedBeads, de stérilisateur, de nettoyant, de débarboteur et de gaine de liquides suffisants. Après avoir allumé l’instrument et le logiciel d’imagerie, cliquez sur le bouton de démarrage pour initialiser la fluidique et l’étalonnage du système. Réglez le grossissement sur 40 fois et réglez la vitesse fluidique sur faible.
Après avoir allumé les lasers, allumez un laser de 405 nanomètres pour mesurer EdU Pacific Blue, 488 nanomètres pour mesurer C12-FDG et 642 nanomètres pour mesurer Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Définissez le canal six pour le canal de dispersion, le canal un et le canal neuf pour le champ clair. Ensuite, commencez avec l’échantillon censé avoir la fluorescence la plus élevée pour mettre en place l’intensité des lasers et retournez doucement le tube d’échantillon pour mélanger.
Après avoir ouvert le couvercle du tube, insérez le tube à échantillon sur la station d’accueil. Cliquez sur Charger pour démarrer et ouvrir un nuage de points. Ensuite, sélectionnez la zone Entités, le soulignement MO1 et le trait de soulignement MO1 pour les axes X et Y respectivement.
Définissez une porte au-dessus du rapport hauteur / largeur de 0,5 pour exclure les doublets et les agrégats de cellules en dessous et sur le côté droit et la population SpeedBead sur le côté gauche. Maintenant, ouvrez Histogram Plot et sélectionnez le carré moyen de la racine du gradient d’entités du masque un et du canal un pour l’axe X. Choisissez la population singulet et définissez la porte à sélectionner pour les cellules ciblées.
Ouvrez un tracé d’histogramme et sélectionnez les intensités maximales brutes de pixels pour les canaux deux, sept et 11 de l’axe X. Ajustez ensuite les puissances laser de 488 nanomètres, 405 nanomètres et 642 nanomètres pour les canaux deux, sept et 11 respectivement afin que chaque fluorochrome ait une valeur de pixel maximale brute comprise entre 100 et 4 000 pour éviter la sursaturation. Choisissez la population ciblée à enregistrer et cliquez sur Acquérir pour mesurer les échantillons de LDGCB avec des paramètres cohérents.
Lorsque vous changez d’échantillon pour la mesure, cliquez sur retour pour récupérer le tube à échantillon. Appuyez sur Charger pour ignorer l’échantillon. Une fois tous les échantillons mesurés, éteignez le champ clair et diffusez le laser.
Mesurez des échantillons de contrôle monochromes pour générer une matrice de compensation. Cliquez sur Arrêter pour fermer le système d’imagerie. Analysez les données dans le logiciel d’analyse d’images.
Utilisez l’outil Spot Wizard du logiciel d’analyse d’images pour compter et quantifier automatiquement les foyers gamma nucléaires H2AX et les images de cellules vivantes. Sélectionnez deux populations de cellules, l’une avec un nombre élevé et l’autre avec un nombre de taches faible pour entraîner l’Assistant Spot à poursuivre l’analyse automatique du comptage des points. La méthode de cytométrie en flux dans les images unicellulaires a montré une augmentation de la population C12-FDG positive, EdU négative, gamma H2AX positive, sénescée et KARPAS422.
Cellules WSU-DLCL2 et OCI-LY1, mais pas dans les cellules SU-DHL6. L’analyse basée sur l’imagerie a présenté un nombre significativement plus élevé de foyers gamma H2AX et KARPAS422, WSU-DLCL2 et OCI-LY1, mais pas dans les cellules SU-DHL6. Des résultats similaires ont été représentés par des données de fréquence et de quantification.
L’ajout de saponine à la suspension cellulaire est crucial, sinon les anticorps ne peuvent pas atteindre les antigènes internes de la cellule et les détergents agressifs entraînent une perte du signal C12-FTG La cytométrie d’imagerie est optimale pour analyser les changements dans la localisation des marqueurs comme la translocation d’un facteur de transcription dans le noyau en réponse à certains stimuli. Une telle analyse peut également être réalisée avec notre protocole. Cette méthode permet de visualiser plusieurs marqueurs fluorescents au niveau d’une seule cellule, ce qui permet de détecter la présence, l’intensité et la localisation des signaux individuels.
