Ce protocole est établi pour isoler et identifier les cellules lymphoïdes innées du groupe deux de la muqueuse nasale murine et explorer certains effets et mécanismes sous-jacents de l’ILC deux dans les maladies nasales. Cette technique permet aux chercheurs d’isoler l’ILC deux du mésothélial local et d’exposer l’expression de l’antigène de surface par cytométrie en flux. Notre technique n’inclut pas les opérations compliquées.
Cependant, une chose importante est d’essayer d’enlever complètement la chair adhérant aux petits os pour éviter l’impact d’autres tissus voisins Avant de commencer l’expérience, abriter six souris mâles et femelles noires sauvages de type C57 âgées de 8 à 12 semaines dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes fournies avec de l’eau et du chow de laboratoire standard. Pour établir le modèle de rhinite allergique, émulsionner 50 microgrammes d’ovalbumine dans 0,2 millilitre de PBS stérile contenant deux milligrammes d’hydroxyde d’aluminium et injecter par voie intrapéritonéale 50 microgrammes d’ovalbumine émulsionnée dans chaque souris sur zéro, sept et 14 jours. Les jours 21, 22, 23, 24 et 25, instiller par voie intranasale des souris avec 50 microgrammes d’ovalbumine dissoute dans 30 microlitres de PBS stérile, puis euthanasier les souris 24 heures après le dernier défi.
Trempez la tête de la souris euthanasiée dans de l’éthanol à 75% pendant cinq minutes et évitez que l’éthanol ne pénètre dans la narine externe. Placez l’abdomen vers le bas sur la table d’opération. Coupez les quatre dents et à la ligne médiane de la tête, faites une incision et coupez la peau à l’aide de ciseaux.
Ensuite, retirez la mâchoire inférieure, coupez tout le nez le long de l’extrémité du palais et placez le tissu dans une boîte de Petri de 60 millimètres contenant cinq litres de PBS glacé. À l’aide de ciseaux et de forceps, retirez la chair et les muscles adhérant aux os. Ensuite, transférez le nez de la souris dans une nouvelle boîte de Petri de 60 millimètres contenant cinq millilitres de PBS glacé et lavez les os.
Après le deuxième lavage, transférer le nez dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Écrasez suffisamment le tissu et transférez-le dans un tube de 15 millilitres contenant deux millilitres de tampon de digestion préchauffé. Fixez le couvercle et placez le tube verticalement dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius et 120 à 150 tr / min pendant 40 minutes.
Ensuite, ajoutez cinq millilitres de milieu glacé RPMI 1640 contenant 10% de sérum bovin fœtal pour arrêter la digestion. Ensuite, filtrez le contenu à travers une crépine cellulaire de 70 microns pour éliminer les fragments solides. Après centrifugation du filtrat à 500 G pendant cinq minutes, jeter délicatement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un milieu glacé RPMI 1640.
Pour répéter la centrifugation comme démontré précédemment, remettez en suspension la pastille de cellule dans quatre millilitres de milieu de gradient de densité à 40%. Ensuite, insérez délicatement une pipette Pasteur au fond du tube pour ajouter 2,5 millilitres de milieu gradient de densité à 80%. Centrifuger le tube à 400 G pendant 15 minutes à température ambiante avec un taux d’accélération et de décélération inférieur à celui du troisième rapport.
Avant de vider les cellules à l’interface, retirez la couche supérieure d’impuretés pour éviter toute contamination potentielle. Utilisez ensuite une pipette pour drainer la couche de cellules mononucléaires à l’interface média à gradient de densité de 40% par 80% dans un tube de 15 millilitres contenant deux millilitres de froid glacé. Lavez les cellules avec du PBS glacé deux fois.
Récoltez les cellules et centrifugez-les pendant cinq minutes à 500 G à quatre degrés Celsius. Resuspendre la pastille de la cellule dans un tampon de coloration et centrifuger à nouveau pendant cinq minutes à 500 G.Jeter le surnageant. Remettez en suspension et incuber les cellules dans une solution de blocage de 80 microlitres pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.
Ajouter un microlitre de colorant de viabilité fixable 520 juste avant d’ajouter 20 microlitres du cocktail d’anticorps colorants de surface de la dilution appropriée à l’échantillon. En outre, définissez les anticorps d’isotype correspondants et la fluorescence moins un comme témoins négatifs. Ensuite, lavez les cellules dans 500 microlitres de tampon de coloration en centrifugeant à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Remettez ensuite en suspension la pastille de cellule dans 200 microlitres de tampon de coloration. Enfin, ajoutez 50 microlitres de billes de comptage absolu vortex aux cellules colorées. Agitez-les et soumettez-les à une analyse de cytométrie en flux.
Un modèle murin induit par les ovules développé pour explorer le rôle des cellules lymphoïdes innées du groupe deux a montré que la fréquence des frottements nasaux et des éternuements chez les souris rhinites allergiques était significativement plus élevée que dans le groupe témoin. Dans la muqueuse nasale de souris témoins saines, environ 2 à 3% des cellules de lignée négative et CD 45 positives ont été identifiées. Le nombre absolu de cellules lymphoïdes innées du groupe deux variait de 2 000 à 4 000.
L’analyse par cytométrie en flux a indiqué une augmentation remarquable du nombre total de cellules lymphoïdes innées du groupe deux dans la muqueuse nasale de la rhinite allergique par rapport à celle des souris témoins saines. Une expression plus élevée de CD 226 a été détectée sur les cellules lymphoïdes innées du groupe deux chez les souris rhinites allergiques que chez les souris témoins. De plus, l’intensité moyenne de fluorescence du CD 226 a été significativement régulée à la hausse chez les souris AR.
Soyez conscient des étapes d’élimination de la chair adhérant à l’os nasal, de réglage du taux d’accélération et de décélération lors de la centrifugation du milieu et du drainage des cellules mononucléaires. Les deux ILC identifiés peuvent être un support pour la caractérisation de la cytométrie en flux triée pour la culture cellulaire ou stimulée in vitro, ce qui aiderait à explorer le risque spécifique des deux ILC dans les tissus nasaux. Cette procédure d’isolement et de caractérisation des lymphocytes, en particulier dans les cellules lymphatiques innées de la muqueuse nasale, fait de ce protocole une référence préliminaire pour les chercheurs explorant l’environnement immunitaire nasal local.
