La purification des protéines recombinantes des bactéries est une méthode bien établie. Cependant, plusieurs problèmes peuvent survenir lors de l’utilisation de ces techniques. Avoir des méthodes pour extraire les protéines des tissus est certainement attrayant.
Le principal avantage de cette méthode est que l’on peut extraire la protéine sous sa forme physiologique, y compris tous les effets mutuels qui peuvent avoir un impact sur son repliement et son activité catalytique. Cette approche peut être adaptée à d’autres protéines d’intérêt et modifiée pour d’autres tissus. Les protéines purifiées des tissus peuvent soutenir le développement d’anticorps et d’inhibiteurs pharmacologiques de haute qualité.
Pour commencer, préparez un tampon de lyse des protéines en mélangeant 250 millilitres de PBS avec du fluorure de sodium de 50 millimolaires, un millimolaire de fluorure de phénylméthylsulfonyle, deux microgrammes par millilitre d’aprotinine et un orthovanadate activé millimolaire. Filtrer la solution à l’aide d’une unité de filtration de seringue de 0,22 micromètre. Préparez des tubes avec deux millilitres de tampon de lyse par gramme de tissu et placez-les sur de la glace.
Pour préparer l’échantillon de tissu, disséquez le tissu d’environ 100 milligrammes chacun sur une plaque de verre pré-nettoyée placée sur de la glace dans une boîte en mousse de polystyrène. Transférer les morceaux de tissu dans les tubes préparés pour une lyse ultérieure. Pour préparer une solution saturée de sulfate d’ammonium, chauffer 500 millilitres d’eau double distillée à 70 degrés Celsius.
En remuant, ajouter progressivement la poudre de sulfate d’ammonium jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de sulfate d’ammonium dissous. Refroidir cette solution saturée à température ambiante et la conserver à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour homogénéiser les tissus rénaux porcins, soniquer la suspension de préférence par une sonde à ultrasons tout en gardant l’échantillon sur de la glace.
Dans le cas des tissus hépatiques de souris, utilisez un homogénéisateur électrique et lavez-le régulièrement dans du PBS pour éviter le colmatage tout en gardant les échantillons sur la glace. Prélevez 20 microlitres des échantillons et vérifiez au microscope si les cellules du tissu homogénéisé sont correctement détruites. Sinon, répétez l’homogénéisation.
Centrifugez les tubes à 10 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Recueillez le surnageant dans un tube frais et placez-le sur de la glace. Ensuite, filtrez le surnageant à l’aide d’unités de filtre de seringue de 0,45 micromètre et 0,22 micromètre.
Aliquotez le surnageant en lots de 10 millilitres et congelez-les à moins 20 degrés Celsius pour un stockage à court terme ou à moins 80 degrés Celsius pour un stockage plus long. Préparez un échantillon de 50 microlitres pour l’analyse SDS-PAGE ou Western blot en ajoutant 10 microlitres de cinq fois le tampon d’échantillon SDS à 40 microlitres du surnageant, puis en faisant bouillir à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Préparez un gel SDS-PAGE de polyacrylamide discontinu à 12,5% conformément aux instructions du fabricant.
Pour effectuer l’analyse SDS-PAGE, chargez ensuite les puits du gel avec une échelle de marqueurs protéiques, cinq nanogrammes de protéine recombinante FAHD1 humaine comme témoin positif, 20 microlitres de l’échantillon à analyser et les puits restants avec 20 microlitres de tampon d’échantillon SDS-PAGE préparé. Exécutez les gels SDS-PAGE à 125 volts à l’aide de la mémoire tampon de fonctionnement SDS. Une fois SDS-PAGE terminé, effectuez une analyse par transfert Western, sondez les membranes à l’aide de l’anticorps disponible soulevé contre FAHD1.
Après avoir préparé des aliquotes surnageantes comme décrit précédemment, soit traiter après décongélation, soit traiter directement après l’extraction des protéines sans congeler l’échantillon. Filtrer l’échantillon à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 micromètre pour exclure les précipités possibles après décongélation. Préparez six tubes de 1,5 millilitre sur de la glace, puis transférez 250 microlitres d’échantillon dans chaque tube.
Préparer une série de dilution de sulfate d’ammonium dans les tubes préparés et porter le volume final à 1 000 microlitres avec un tampon de lyse des protéines. Incuber les échantillons à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur un rotateur tubulaire. À l’aide d’une centrifugeuse de table, centrifugez à 10 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et transférez soigneusement tous les surnageants dans des tubes séparés.
Sécher à l’air libre les granulés obtenus et remettre en suspension chacun d’eux dans 1 000 microlitres d’eau double distillée. Pour chaque paire de granulés et de surnageants remis en suspension de l’étape précédente, mélanger 40 microlitres avec 10 microlitres de cinq fois le tampon de l’échantillon SDS et faire bouillir à 95 degrés Celsius avec des couvercles ouverts jusqu’à ce que la majeure partie du liquide se soit vaporisée. Ensuite, remettez en suspension la pastille dans un mélange de sulfoxyde de diméthyle à 50% dans de l’eau distillée double.
Effectuer SDS-PAGE en chargeant les échantillons dérivés des granulés remis en suspension et du surnageant par paires, suivi d’une analyse par transfert Western. Cependant, faites fonctionner les gels à 80 volts pendant trois heures. Configurez le système FPLC avec la colonne d’échange anionique ou cationique.
Lavez la colonne avec cinq volumes de colonne d’éthanol à 20 % dans de l’eau distillée double, suivis de cinq volumes de colonne d’eau distillée double. Appliquez l’échantillon sur la colonne soit par injection, soit à l’aide d’une pompe à échantillon et prélevez le débit. Lavez la colonne avec un volume de colonne du tampon à faible teneur en sel.
Configurez une élution de gradient linéaire allant d’un tampon à faible teneur en sel à 100 % d’un tampon à sel élevé dans trois volumes de colonnes. Collectez en continu une fraction millilitre. Une fois le gradient terminé, continuez à fonctionner avec un tampon de sel élevé jusqu’à ce qu’aucun autre pic associé aux protéines ne soit détecté dans le chromatogramme sur la plage d’un volume de colonne.
Appliquer un millilitre de FDS à 25 % dissous dans de l’hydroxyde de sodium à 0,5 molaire et de l’eau distillée double pour nettoyer la colonne. Laver consécutivement la colonne avec trois volumes de colonne d’eau distillée double et trois volumes de colonne d’éthanol à 20% dans de l’eau double distillée. Collectez les échantillons SDS-PAGE de toutes les fractions de crête et du débit.
Congelez les fractions collectées dans de l’azote liquide et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Après les avoir sondés par transfert Western, décongelez et mettez en commun les fractions contenant les protéines d’intérêt et jetez les autres. Pour effectuer l’étape de purification, réduisez le volume de la solution protéique à deux millilitres à l’aide d’unités de filtration ultra centrifugation.
Filtrer séquentiellement la solution avec des unités de filtre de seringue de 0,45 micromètre et 0,22 micromètre pour éliminer toute microprécipitation. Équilibrer la colonne de chromatographie d’exclusion de taille avec un volume de colonne de tampon courant contenant un millimolaire de dithiothréitol. Chargez l’échantillon sur la colonne et exécutez l’unité de chromatographie jusqu’à ce que toutes les protéines soient éluées comme décrit précédemment.
Préparez 50 échantillons de microlitres pour l’analyse SDS-PAGE et Western blot décrite précédemment. Laver consécutivement la colonne avec un volume de colonne d’eau double distillée et un volume de colonne d’éthanol à 20% dans de l’eau double distillée. Après avoir effectué l’analyse Western blot, regroupez toutes les fractions contenant FAHD1.
Réduisez le volume de la solution protéique à deux millilitres à l’aide d’unités de filtration ultra centrifugation. Le dépistage par transfert western montre la présence de FAHD1 porcin dans le surnageant avec une bande de 25 kilodaltons tandis que le témoin positif marqué court à 34 kilodaltons. Le porc FAHD1 du lysat a été purifié par chromatographie par échange anionique et les protéines de liaison ont été éliminées par élution.
Les fractions contenant du FAHD1 porcin ont été identifiées par analyse par transfert western, regroupées et concentrées. Les échantillons de protéines ont été purifiés par sec et identifiés par l’analyse par transfert Western. Le rendement de la protéine FAHD1 du porc était d’environ un milligramme avec un niveau de pureté de 80%.
L’analyse par transfert Western a détecté la protéine FAHD1 de la souris dans le flux avec d’autres protéines. Le flow-through a été appliqué pour la chromatographie d’exclusion de taille. Les fractions contenant FAHD1 ont été regroupées, concentrées et appliquées à l’analyse SDS-PAGE.
Cependant, le rendement en protéines n’était pas très élevé. L’activité enzymatique spécifique du porc FAHD1 augmente avec le niveau de pureté en augmentant la quantité relative de FAHD1 par protéine totale. Des concentrations plus élevées de sulfate d’ammonium provoquent l’effet sourire, qui peut être résolu à une tension plus faible.
D’autres protéines ont été trouvées dans le lysat et le surnageant à une concentration de 15%. Cependant, à des concentrations plus élevées, les échantillons peuvent précipiter et ne peuvent pas être détectés. Le protocole présenté ici exige que la protéine soit soluble.
Les conditions optimales de précipitation et d’ajustement du pH ou de la taille pour la chromatographie doivent être testées et définies. L’étude de la fonction enzymatique, l’étude de la structure des protéines et le développement d’anticorps sont grandement soutenus lorsque des protéines sont extraites de tissus plutôt que de bactéries.
