Ce protocole décrit notre technologie d’acoustophorèse microfluidique qui peut être utilisée pour la séparation rapide et efficace des bactéries à Gram négatif d’un milieu à l’aide de microbilles modifiées par aptamère. Les systèmes d’acoustophorèse microfluidique permettent la séparation des bactéries à Gram négatif avec un débit raisonnable et une isolation cellulaire sans contact. L’acoustophorèse microfluidique peut être optimisée pour isoler les bactéries à partir d’échantillons médicaux et environnementaux.
Pour commencer, concevez une puce d’acoustophorèse microfluidique qui recueille les billes de PS à la sortie cible et élimine le reste après avoir injecté un mélange d’échantillons de PS dans l’entrée de l’échantillon. Préparez une puce avec les couches au-dessus et au-dessous de la couche de silicium collées au verre borosilicate. Et une troisième couche de verre borosilicate, en utilisant l’anodisation, ajoute 1000 volts et 400 degrés Celsius.
Fixez un PZT à la couche de verre borosilicaté le long du canal microfluidique en utilisant moins de 10 microlitres d’adhésif cyanoacrylate. Inoculer les bactéries GN et GP dans le milieu Luria-Bertani et les incuber à 37 degrés Celsius et 220 tours par minute pendant 16 heures. Centrifuger les bactéries cultivées à 9 056 FCR pendant une minute à température ambiante.
Ensuite, lavez deux fois avec 1X tampon PBS. Préparer les bactéries GN et GP sélectionnées pour l’analyse en les remettant en suspension dans le tampon de liaison. Remettez en suspension le mélange de microbilles enrobées de streptavidine de 10 micromètres avant utilisation.
Vortex le mélange pendant 20 secondes. Préparez l’aptamère en le dénaturant à 95 degrés Celsius pendant trois minutes, puis en le repliant à zéro degré Celsius pendant deux minutes. Transférez 250 microlitres du mélange de microbilles recouvertes de streptavidine en suspension dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez 100 microlitres d’aptamère d’ADN biotinylé dans le tube.
Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes tout en tournant à 25 tours par minute. Centrifuger le mélange réactionnel à 9, 056 RCF pendant 40 secondes à température ambiante. Ensuite, lavez le tube deux fois avec 200 microlitres de tampon Tris-HCl.
Ajouter 10 microlitres de 100 milligrammes par millilitre de BSA au tube d’échantillon lavé et incuber pendant 30 minutes à température ambiante tout en tournant à 25 tours par minute. Enfin, laver deux fois les microbilles modifiées aptamères dans le tampon Tris-HCl par centrifugation à 9, 056 RCF pendant 40 secondes à température ambiante. Connectez les tubes en PEEK aux deux entrées pour injecter deux échantillons et un tampon, ainsi qu’aux deux sorties pour la collecte et le rejet des déchets.
À l’aide d’une seringue de 10 millilitres, remplir le canal d’acoustophorèse microfluidique avec de l’eau déminéralisée sans bulles. Préparez un régulateur de pression de précision avec deux canaux de sortie ou plus pour contrôler le débit du fluide. Après avoir préparé le dispositif, injecter l’échantillon et le tampon en appliquant une pression de deux kilopascals à l’entrée de l’échantillon et de quatre kilopascals à l’entrée du tampon à l’aide du dispositif de contrôle de pression de précision.
À l’aide d’un microscope, faites la mise au point sur une bille et déplacez-la vers le centre du canal microfluidique à l’aide du PZT. Générez une fréquence de résonance de 3,66 mégahertz à l’aide d’un générateur de fonction à canal unique et amplifiez un signal typique de 16 décibels à l’aide d’un amplificateur de puissance. Observez les processus de séparation et d’enrichissement sur la puce acoustofluidique avec un microscope à fluorescence et une caméra haute vitesse fonctionnant à 1 200 images par seconde.
La puce acoustophorétique introduite dans cette étude a confirmé que, à mesure que la tension du PZT augmentait, la concentration centrale des billes de 10 micromètres augmentait. À cinq volts de la tension PZT, la plupart des billes de 10 micromètres étaient concentrées au centre. Le rapport entre le nombre de billes collectées à la sortie et le nombre total de billes injectées de 10 micromètres a été appelé taux de récupération.
Le rapport entre le nombre de perles de taille micrométrique et le nombre total de perles collectées a été appelé pureté. Les résultats ont indiqué que l’appareil avait une efficacité de séparation élevée pour les billes d’une taille de 10 micromètres. Le nombre de bactéries GN et GP liées à chaque microbille modifiée aptamère a été mesuré à l’aide d’un microscope équipé d’une caméra à grande vitesse.
Les cinq bactéries GN étaient liées aux billes tandis que beaucoup moins de bactéries GP étaient liées aux substances testées. L’intensité du signal différait significativement entre les bactéries GN et GP. L’adhésif utilisé pour fixer le PZT doit être utilisé le moins possible pour la précision de l’ondulation et le PZT et le microcanal doivent être parallèles.
Ce dispositif peut être utilisé pour détecter des bactéries vivantes ou des biomarqueurs dérivés de bactéries pendant la période de diagnostic précoce des maladies infectieuses bactériennes.
