Ce protocole permet d’analyser quantitativement la structure 3D des jonctions neuromusculaires à une résolution proche de la microscopie électronique à l’aide d’une procédure simple. Le principal avantage de ce protocole est que les échantillons musculaires sont traités de manière similaire et immunomarqués pour la microscopie confocale et STED, ce qui réduit le temps nécessaire à l’évaluation précise de la structure de la jonction neuromusculaire dans des modèles animaux. La quantification morphologique que nous avons développée peut être facilement adaptée pour analyser d’autres structures subcellulaires.
J’ai le plaisir de vous présenter la Dre Martina Marinello, une scientifique de mon équipe qui montrera comment les taquineries musculaires et les immunocolorations sont effectuées et de donner quelques recommandations pour l’application réussie de ce protocole. J’ai le plaisir de vous présenter le Dr Jérémie Cosette de la plateforme d’imagerie de Généthon qui présentera l’acquisition et l’analyse d’images à l’aide de microscopes confocaux et STED. Après l’euthanasie, commencez à taquiner les muscles antérieurs du tibial en petits faisceaux de fibres d’environ un millimètre de large à l’aide de deux pinces fines dentelées.
Ensuite, transférez ces faisceaux musculaires dans une plaque de 24 puits contenant 1% de Triton X-100 préparé dans du PBS et laissez-le agiter doucement pendant une heure à température ambiante ou cinq heures à quatre degrés Celsius. Après avoir lavé les échantillons trois fois pendant cinq minutes avec du PBS à température ambiante, incuber les échantillons avec une solution de blocage composée de 4% BSA préparée dans du PBS avec 1% Triton X-100 pendant quatre heures à quatre degrés Celsius sous agitation douce. Ensuite, incuber les échantillons pendant la nuit avec la même solution de blocage contenant des anticorps monoclonaux primaires contre le neurofilament M ou la glycoprotéine 2 des vésicules synaptiques pour marquer les terminaisons axonales présynaptiques ou les zones actives, respectivement.
Le lendemain, lavez les faisceaux musculaires étiquetés trois fois pendant cinq minutes avec du PBS sous agitation douce. Ensuite, incuber avec des anticorps secondaires appropriés en les plaçant sur un agitateur pendant deux heures à température ambiante. Après avoir lavé à nouveau les faisceaux musculaires, placez-les sur une lame avec un support de montage.
Ensuite, placez un couvercle en verre de qualité 1,5 sur le dessus, suivi d’aimants cylindriques des deux côtés de la glissière pour appliquer une pression et aplatir les muscles. Pour acquérir des images à l’aide du microscope confocal, lancez le logiciel de microscope et choisissez la machine comme mode de configuration et collectez des piles d’images des jonctions neuromusculaires dans chaque groupe expérimental selon les paramètres mentionnés dans le manuscrit du texte. À la fin de la séance, cliquez sur Ouvrir dans la visionneuse 3D et choisissez une jonction neuromusculaire représentative d’un groupe expérimental pour visualiser l’étiquetage 3D.
Pour calculer la jonction neuromusculaire post-synaptique et le volume de la plaque, la surface de projection d’intensité maximale et la tortuosité relative, faites glisser et déposez la macro pour la quantification du volume de la jonction neuromusculaire dans la fenêtre Image J, et lorsque la macro s’ouvre dans une deuxième fenêtre, cliquez sur Macros et exécuter la macro. Sélectionnez le dossier natif contenant les sous-dossiers de jonction à analyser et cliquez sur Sélectionner. Ensuite, dans le menu contextuel d’enregistrement du dossier, sélectionnez le dossier de stockage et cliquez sur Sélectionner.
Dans le nouveau menu contextuel appelé Type d’image, sélectionnez le format des acquisitions de la pile Z. Sélectionnez le canal RVB correspondant à la coloration d’intérêt et indiquez X, Y taille de pixel et étape Z. Si des formats de fichier propriétaires sont sélectionnés, la macro lit directement la taille en pixels et l’étape Z.
Pour quantifier l’accumulation de neurofilaments présynaptiques, faites glisser et déposez la macro pour la quantification de l’accumulation des jonctions neuromusculaires dans la fenêtre Image J, puis cliquez sur Macros et exécuter la macro. Sélectionnez les sous-dossiers de jonction, le dossier de stockage et le format des acquisitions de pile Z, comme illustré précédemment. Ensuite, dans la fenêtre contextuelle Informations sur la coloration, indiquez l’étiquette et la couleur pré-synaptiques et post-synaptiques et cliquez sur OK.In la fenêtre contextuelle Taille des pixels, indiquez la taille de pixel X, Y comme 0,072 micromètre, l’étape Z comme 0,5 micromètre, puis cliquez sur OK. Si des formats de fichier propriétaires sont sélectionnés, la macro lit directement la taille en pixels et l’étape Z.
Pour calculer la distance entre les bandes du récepteur de l’acétylcholine, sélectionnez le menu Quantifier en haut de la fenêtre centrale. Cliquez sur l’onglet Outils, sélectionnez l’intensité, puis cliquez sur l’icône de profil de ligne. Définissez le suréchantillonnage sur un et cochez Trier les canaux.
Cliquez sur l’onglet Ouvrir des projets et sélectionnez l’image filtrée à analyser. Ensuite, cliquez sur l’icône de ligne de dessin et tracez une ligne traversant perpendiculairement plusieurs bandes ou plis jonctionnels. Cliquez sur le haut du premier pic et déplacez le pointeur de la souris tout en appuyant sur le bouton gauche de la souris jusqu’à ce que le prochain pic maximum soit atteint.
Notez la valeur DX, qui correspond à la distance entre les deux pics. Faites un clic droit sur la souris dans l’image de la fenêtre de droite et sélectionnez Enregistrer les ROI. Après avoir cliqué sur l’icône en forme de flèche, cliquez sur le ROI et supprimez-le en cliquant sur l’icône de la corbeille.
Pour calculer la largeur de la bande du récepteur de l’acétylcholine, sélectionnez l’intensité dans le panneau supérieur gauche sous l’onglet Outils, cliquez sur l’icône Déterminer FWHM et cochez les canaux de tri. Cliquez ensuite sur l’onglet Ouvrir des projets et sélectionnez l’image filtrée à analyser. Ensuite, cliquez sur l’icône de dessin rectangulaire dans le menu supérieur de la fenêtre de droite.
Sélectionnez une bande horizontale ou verticale et dessinez un rectangle perpendiculairement à la bande. Un profil apparaît dans la fenêtre centrale. Cliquez sur vertical ou horizontal dans le menu Projection moyenne situé dans le panneau de gauche, selon que l’orientation de la bande est verticale ou horizontale.
Cliquez sur les statistiques dans la fenêtre centrale pour lire la valeur FWHM, puis enregistrez et supprimez les ROI comme indiqué précédemment. La plaque d’extrémité motrice post-synaptique, marquée avec de l’alpha-bungarotoxine fluorescente, semblait plus petite et fragmentée chez les mutants de deux lignées de souris. La quantification des piles Z de la jonction neuromusculaire à l’aide des macros personnalisées de l’image J a révélé une diminution marquée du volume de la plaque terminale, de la projection de l’intensité maximale et de la tortuosité relative dans les deux modèles de souris malades par rapport aux témoins, indiquant des défauts de maturation de la jonction neuromusculaire.
La quantification de la distribution de la branche terminale de l’axone présynaptique à l’aide de la macro personnalisée Image J a révélé un modèle modifié dans la distribution des neurofilaments M dans les deux modèles animaux avec un immunomarquage accru. Grâce à la coloration de la glycoprotéine 2 des vésicules synaptiques, une réduction de 43% du taux d’occupation des régions contenant le récepteur de l’acétylcholine avec des zones actives terminales nerveuses adjacentes a été observée chez les souris Smn 2B/souris. L’aspect des plaques terminales postsynaptiques de la jonction neuromusculaire a été clairement visualisé par marquage de l’alpha-bungarotoxine fluorescente et analyse du profil d’intensité.
L’évaluation des paramètres de jonction neuromusculaire a révélé une augmentation de la distance de pli jonctionnel et de la largeur des bandes du récepteur de l’acétylcholine dans le muscle gastrocnémien des mutants. Pour obtenir des résultats fiables, il est crucial de taquiner correctement les muscles, en accordant une attention particulière à la force appliquée pour séparer les faisceaux musculaires. Ce protocole peut aider à obtenir une caractérisation morphologique plus approfondie de la jonction neuromusculaire, qui n’était auparavant prise en compte que par des procédures complexes et longues, telles que la microscopie électronique à transmission.
La procédure d’imagerie STED a ouvert la voie à l’étude de nouvelles connaissances concernant les marqueurs pré et post-synaptiques, qui contribuent à la physiopathologie des maladies affectant la jonction neuromusculaire.
