Les mitochondries fournissent de l’énergie cellulaire par phosphorylation oxydative contribuant à presque tous les processus au sein de la cellule. Par conséquent, les dysfonctionnements mitochondriaux sont associés à un large éventail de maladies. Le principal avantage de cette technique est la mesure en temps réel de la bioénergétique mitochondriale par la consommation d’oxygène, et donc, une évaluation précise du métabolisme énergétique cellulaire total.
La respirométrie à haute résolution permet une évaluation directe de ce qui échoue dans le système de phosphorylation oxydative, fournissant potentiellement des indices diagnostiques dans les maladies mitochondriales primaires et les dysfonctionnements mitochondriaux secondaires associés à de nombreux troubles. Ryan Awadhpersad, doctorant dans mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, effectuez l’étalonnage de l’oxygène en faisant fonctionner les respiromètres dans 2,1 millilitres de milieu respiratoire mitochondrial à 37 degrés Celsius pendant plus de 45 minutes et procédez si la variation de base est de moins de quatre picomoles par seconde.
Culture de cellules HEK293 dans du DMEM à haute teneur en glucose complété par 10% de FBS activé par la chaleur, GlutaMAX, acides aminés non essentiels, pyruvate de sodium et uridine dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5% de dioxyde de carbone. Le jour de l’expérience, collectez et comptez les cellules et remettez en suspension 2,5 millions de cellules dans un milieu respiratoire de 2,5 millilitres. Pour évaluer la respiration de routine, ajoutez 2,3 millilitres de suspension de cellules moyennes respiratoires chaudes à la chambre.
Faites fonctionner les chambres à 37 degrés Celsius et à une vitesse d’agitation de 700 tr / min. Attendez au moins trois minutes pour permettre au fluide de se dégazer, puis fermez les chambres en tordant le bouchon dans un mouvement de rotation. Ensuite, aspirez l’excès de liquide sur le dessus du bouchon.
Après 10 minutes, obtenez un signal de flux d’oxygène stable pour enregistrer la respiration de routine ou d’état I. Pour effectuer l’analyse OXPHOS dans des cellules intactes, ajouter deux microlitres d’oligomycine de 0,01 millimolaire pour une concentration finale de 10 nanomolaires. Titrer le FCCP à partir d’un stock de deux millimolaires en ajoutant 0,6 microlitre à des pas de 0,2 microlitre jusqu’à ce qu’aucune augmentation de la respiration ne soit observée et que la respiration soit découplée au maximum.
Ensuite, ajoutez un microlitre de roténone millimolaire pour une concentration finale de 0,5 micromolaire. Ensuite, ajoutez deux microlitres d’un milligramme par millilitre de stock d’antimycine pour une concentration finale d’un microgramme par millilitre. Réoxygénez la chambre au même niveau d’oxygène, environ 150 micromolaires, en soulevant le piston.
Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’ascorbate 0,8 molaire pour une concentration finale de deux millimolaires. Ensuite, ajoutez immédiatement cinq microlitres de TMPD 0,2 molaire pour une concentration finale de 0,5 millimolaire et évaluez l’activité IV complexe. Lorsque le flux d’oxygène maximal est atteint avec le TMPD, ajoutez cinq microlitres ou de l’azoture à quatre molaires pour une concentration finale de 10 millimolaires.
Ensuite, continuez l’exécution pendant au moins cinq minutes pour tester l’auto-oxydation du TMPD pour le calcul complexe du niveau de base IV. Après l’exécution, prélever un millilitre de suspension d’échantillon dans chaque chambre et centrifuger à 1 000 G pour les cellules perméabilisées ou à 20 000 G pour le lysat tissulaire. Ensuite, jetez le surnageant et congelez la pastille à moins 80 degrés Celsius pour une analyse plus approfondie en aval.
Tout d’abord, ensemencez les cellules en fonction des taux de croissance des lignées cellulaires individuelles. Diluer l’oligomycine, le FCCP, la roténone et l’antimycine dans trois microlitres de milieu d’essai jusqu’à une concentration finale de 1,5 micromolaire, 1,125 micromolaire et un micromolaire, respectivement. Par la suite, remplissez-les dans des ports séparés.
Observez les orifices d’injection pour assurer un chargement uniforme des échantillons. Allumez le système à base de microplaques et l’ordinateur et équilibrez-les à 37 degrés Celsius pendant au moins trois heures. Le jour du test sur microplaque, vérifiez la confluence de la plaque de culture cellulaire, la morphologie des cellules et assurez-vous que les puits de fond sont vides.
Ensuite, retirez tout sauf 20 microlitres du milieu de culture de chaque puits. Ensuite, lavez chaque puits avec 90 microlitres de milieu d’essai et ajoutez 100 microlitres de milieu d’essai pour obtenir un volume final allant jusqu’à 120 microlitres. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur sans dioxyde de carbone pendant 60 minutes.
Après avoir récupéré la plaque de l’incubateur, retirez le couvercle et placez la microplaque dans la fente. Cliquez sur Continuer pour démarrer la course. Une fois l’exécution terminée, retirez la plaque et retirez le milieu d’essai restant sans perturber les cellules.
Ensuite, congelez toute la plaque à moins 80 degrés Celsius. Après avoir effectué les expériences de perméabilisation et de respiration de la digitonine, des traces de consommation d’oxygène brut de cellules HEK293 de type sauvage et de cellules HEK293 avec un knockout génétique médié par CRISPR entraînant de multiples carences en OXPHOS ont été enregistrées. Des traces de consommation d’oxygène normalisées par superposition de cellules ont été obtenues.
CRISPR knockout 1 montre une respiration altérée et CRISPR knockout 2 ne montre aucune respiration par rapport au type sauvage lorsqu’il est normalisé au nombre de cellules. Les quantités de protéines ont été quantifiées et les valeurs de respiration ont été normalisées en proportion de la quantité de protéines afin de déterminer les valeurs absolues des états respiratoires et les rapports de contrôle du flux respectifs. Les taux d’acidification extracellulaire ont augmenté pour le déficit en OXPHOS dans CRISPR knockout 2, suggérant une compensation du déficit en phosphorylation oxydative mitochondriale dans les cellules HEK293 par une glycolyse accrue.
De plus, les valeurs respiratoires ont été déterminées en présence d’oligomycine, de FCCP et de roténone, et les valeurs obtenues ont été normalisées à la quantité de protéines. Des traces de consommation d’oxygène normalisées par des protéines de cellules HEK293 de type sauvage et de cellules HEK293 présentant un déficit en traduction mitochondriale médié par CRISPR provoquant un déficit multiple en OXPHOS ont été étudiées. Des traces de consommation d’oxygène normalisées par les tissus humides du cervelet de la souris et du muscle soléaire de la souris ont été obtenues.
Les muscles soléaires présentent une capacité d’OXPHOS et de respiration trois fois supérieure à celle du cervelet. Avec la respirométrie en chambre, il est important de travailler rapidement, car la fonction mitochondriale diminuera au moment où vous prélèverez vos échantillons, et avec la respirométrie sur plaque, il est crucial d’acquérir une densité d’ensemencement optimale pour minimiser la variabilité. Pour une analyse plus approfondie, la quantification des protéines ou l’immuno-blotting est possible.
Cela pourrait déterminer si une altération de la fonction respiratoire mitochondriale était due à l’abondance de complexes OXPHOS ou à la quantité mitochondriale. Il y a déjà un siècle, on a découvert que les cellules cancéreuses effectuaient une glycolyse anaérobie en plus de l’OXPHOS mitochondrial. Cela souligne la nécessité de tester la bioénergétique mitochondriale.
Ici, nous avons présenté deux respiromètres considérés comme l’étalon-or d’aujourd’hui.
