La maladie de Huntington, MH, est une pathologie neurodégénérative incurable causée par une mutation d’un gène codant pour la protéine huntingtine. La huntingtine est principalement associée aux vésicules et aux microtubules, et probablement impliquée dans les processus de transport dépendants des microtubules. Pour étudier l’influence de la huntingtine mutante sur le dynamisme des microtubules, nous avons utilisé la visualisation in vivo de la protéine EB3, qui régule les propriétés dynamiques des microtubules en pliant et en stabilisant les extrémités positives en croissance.
Pour charger de l’EB3 marqué par fluorescence dans des fibroblastes de peau humaine, nous avons appliqué une transfection de plasmides. Nous avons utilisé la culture primaire de fibroblastes pour obtenir à partir de la biopsie cutanée du patient EB3 pour cette étude. Administrer la biopsie au laboratoire en quelques heures en milieu DMEM, complétée par 15 microgrammes par millilitre de pénicilline et 50 unités par millilitre de streptomycine.
Placez le tissu de biopsie dans une boîte de Petri de six centimètres, avec une petite quantité de milieu. À l’aide d’un scalpel stérile, coupez l’échantillon de biopsie en morceaux d’environ 0,5 à un millimètre. Placez un, deux, fragments obtenus dans une boîte de Petri de 3,5 centimètres et placez un couvercle stérile sur les morceaux de biopsie.
Ajouter lentement 1,5 millilitre d’un milieu de croissance. Cultiver des faisceaux de fibres dans le milieu de croissance dans un incubateur à CO2, dans 5% de CO2 soit sept centigrades, 80% d’humidité. Après quatre, sept jours, les premiers kératinocytes, puis les fibroblastes commencent à migrer du tissu vers le fond du plat.
Culture cellulaire. Pour la visualisation de la transfection, des plats confocaux en verre, des plats confocaux doivent être utilisés. Couvrir le fond du plat avec une solution de gélatine autoclavée à 0,1% préparée dans de l’eau distillée.
Incuber pendant 15 minutes. Préparez le support de culture. Bien mélanger, conserver haut à plus 4 centigrades.
Réchauffer le milieu à plus 37 centigrades, avant de l’ajouter aux cellules. Évaluez la culture au microscope. Retirez le milieu et lavez les cellules avec un DPBS stérile.
Ajouter un millilitre de solution de trypsine préchauffée à 0,25% aux cellules. Vérifiez les cellules au microscope si elles se détachent complètement du substrat. Désactiver la trypsine avec un millilitre du milieu de culture.
Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 200 G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant, remettez en suspension la palette cellulaire dans un millilitre du milieu de culture.
Comptez le numéro de cellule. Calculez le nombre requis de cellules. Désensemencez-les avec une densité de huit à 15, multipliée par 10 à la puissance de trois, passée d’un centimètre.
Ceci est divisé en millilitres du milieu de culture. Retirer la solution de gélatine du plat de culture préparé pour l’inoculation et ajouter immédiatement deux millilitres de la suspension cellulaire. Cultivez des fibroblastes à plus 37 centigrades dans un incubateur à CO2.
Rafraîchissez le médium tous les deux, quatre jours. Pour les expériences, utilisez les cellules de quatre, 11 passages. Au moment de la transfection, la confluence ne doit pas dépasser 70, 80% Remplacer le milieu de culture par un milieu frais 24 heures avant la transfection.
Préparez un complexe ADN-lipide, en fonction de la surface et de la densité de l’ensemencement cellulaire. L’agent de transfection liposomale et la densité de l’ensemencement cellulaire d’un, multiplié par 10 à la puissance de quatre cellules, passée d’un centimètre ont été utilisées. Ajouter trois microlitres de réactif commercial à 125 microlitres d’Opti-MEM, ne contenant aucun antibiotique.
Sans toucher les parois du tube, remettez doucement en suspension. Diluer l’ADN plasmidique, GFP-EB3, en ajoutant un microgramme de l’ADN plasmidique à 125 microlitres d’OptiMEM. Remettez en suspension doucement.
Ajouter de l’ADN plasmidique dilué à chaque tube de réactif de transfection dilué, rapport un pour un. Incuber pendant 30 minutes. Ajoutez le complexe lipidique DE l’ADN à la boîte de Petri de six centimètres avec des cellules.
Mélanger avec une balançoire cruciforme pendant 30 secondes. Incuber les cellules avec un agent de transfection pendant 24 heures, puis changer le milieu en un fluide frais. Analysez l’efficacité après inspection en 24 et 48 heures.
Préparation à l’imagerie. Avant l’imagerie en direct des cellules, changez le milieu de culture en un milieu sans colorant indicateur de pH pour réduire l’autofluorescence. Appliquez soigneusement l’huile minérale sur la phase cellulaire moyenne pour couvrir complètement le milieu, en l’isolant de l’environnement externe pour réduire la pénétration de l’O2 et l’évaporation du milieu.
Utilisez une lampe macro et toutes les images dans un objectif 60 fois, 100 fois avec une ouverture numérique élevée pour prendre l’image. Car dans les observations viva, le microscope doit être équipé d’un incubateur pour maintenir les conditions nécessaires aux cellules, y compris frapper la table optique, et la lentille pour passer 37 Centigrades, une chambre fermée était l’alimentation en CO2, et le soutien du niveau d’humidité. Placez la boîte confocale avec les cellules dans le support du microscope avant l’imagerie.
Assurez-vous que la parabole et l’appareil photo sont solidement fixés au support pour éviter de dériver lors de la prise d’images. Définition des paramètres d’imagerie. Choisissez les faibles valeurs d’exposition, car la lame induit des dommages aux cellules, réagit avec les espaces d’oxygène.
Pour étudier la dynamique des microtubules dans les fibroblastes de la peau humaine, nous avons sélectionné une exposition de 300 millisecondes. Concentrez-vous sur l’objet d’intérêt. Pour l’imagerie time-lapse à long terme, le système de stabilisation automatique de la mise au point, un système de mise au point parfait est nécessaire, car il peut y avoir un décalage le long de l’axe défini et l’objet d’intérêt sera donc flou.
Choisissez les conditions d’imagerie optimales, en fonction de la photosensibilité de la cellule et de la vitesse de décoloration du chrome évasé. Étant donné que les microtubules sont des structures très dynamiques, le temps est raisonnablement court et la fréquence d’images doit être suffisamment élevée. Pour étudier la dynamique des microtubules dans les fibroblastes cutanés, nous avons utilisé une fréquence d’une image par seconde, pendant trois, cinq minutes.
Lorsque vous sélectionnez l’objet suivant pour obtenir l’image, éloignez-vous de la zone déjà imagée, car sous l’influence de la lumière, il y a un saignement photo-saignable. Comme nous avons utilisé une fréquence d’imagerie relativement élevée, l’obturateur ne s’est pas fermé entre les images et la lampe était en retard pendant toute la période d’imagerie, qui s’estompe de plus en plus. Choisissez les vidéos optimales pour étudier visuellement la dynamique des microtubules, en tenant compte de la qualité de la transfection, de la qualité des images des microtubules, du rapport signal/bruit optimal et de l’absence de dérive de la cellule analysée.
Utilisez les vidéos sélectionnées pour étudier la dynamique des microtubules plus-ends, en les plaçant dans le programme Fidji. L’étape la plus critique du protocole est la transfection, assurant une expression protéique suffisante. Un bon rapport signal/bruit, aucun photoblanchiment des microtubules et l’absence de dérive cellulaire sont essentiels pour l’imagerie.
La visualisation in vivo de la dynamique des microtubules fournit des informations vitales sur les propriétés de la huntingtine mutante. Notre protocole peut être appliqué à des études d’autres maladies, dont la pathologie implique des propriétés dynamiques du cytosquelette.
