Notre protocole présente deux tests, quantifiant le mouvement de C.elegans. Ces méthodes évaluent les phénotypes de motilité tels que ceux présentés par les modèles de sclérose latérale amyotrophique, ou SLA. Le test de locomotion radiale est une méthode rentable et facile pour détecter le rampement sur une surface solide.
Le test de natation utilise le suivi informatisé pour la détection impartiale des mouvements de battement dans le liquide. Ces méthodes sont utiles pour quantifier les différences de mouvement chez C.elegans. Bien que nous étudions la SLA, ils peuvent être utilisés pour n’importe quelle souche avec une motilité altérée.
Retournez les plaques de dosage NGM à l’envers. Et étiquetez le fond avec un identifiant pour les souches de C.elegans à analyser. Faites un petit point avec le marqueur au centre de la plaque à l’envers.
Lorsque vous travaillez avec un microscope à dissection, transférez les vers au centre de la plaque d’essai. Et réglez une minuterie pendant 30 minutes. Remettez le couvercle sur la plaque et mettez-le de côté.
Continuez à transférer les vers jusqu’à ce que toutes les souches se trouvent sur les plaques d’essai désignées. Après 30 minutes, commencez à marquer la première plaque en retirant le couvercle et en plaçant la plaque face cachée sous le microscope à dissection. Ajustez la mise au point du microscope jusqu’à ce que tous les vers soient visibles à travers la tarière.
À l’aide d’un stylo à pointe en feutre de couleur différente à partir du point central, placez un petit point à l’emplacement de chaque ver. Vérifiez le bord de la plaque car certains vers peuvent s’y retrouver. En outre, comptez et notez combien de vers ne se sont pas déplacés du point central.
Mesurez la distance entre le point central et les marques d’emplacement finales pour chaque ver et enregistrez la distance à l’aide d’une règle. Le premier point de ver est marqué d’un tiret. Enregistrez les données de longueur pour chaque point consécutivement en faisant pivoter la plaque dans le sens des aiguilles d’une montre.
Ouvrez le logiciel associé pour configurer et enregistrer les vidéos. Cliquez sur l’icône de capture vidéo. Appuyez sur le bouton du gradateur et tournez-le dans le sens des aiguilles d’une montre pour régler la lumière.
Dans la fenêtre de capture vidéo, cliquez sur l’onglet Paramètres et ajustez le mode vidéo à 2456x2052_Mono8, fréquence d’images à 14, sortie monochrome. Exposition de 0,00300 seconde. Gain à 1 dB.
Gamma à un. Et tournez à 180. Revenez à l’onglet Capture, sélectionnez le dossier d’enregistrement et attribuez un nom de fichier en le saisissant dans la zone de texte Préfixe de fichier.
Définissez d’autres paramètres de capture tels que la mémoire tampon sur 128 images et la durée sur une minute. Placez la plaque de dosage allumée sur la scène de l’appareil et centrez-la sur l’écran de capture vidéo, puis retirez le couvercle. Utilisez une micropipette pour laver environ 50 vers dans 1 ml de M9 sur la plaque d’essai.
Faites tourbillonner doucement la plaque pour amener les animaux au centre, ou utilisez une micropipette pour ajouter quelques gouttes de M9 pour séparer les animaux. Réglez une minuterie pendant 60 secondes pour permettre aux vers de s’acclimater à la natation. Réglez le bouton lumineux de manière à ce que l’écran soit aussi lumineux que possible sans surexposition.
Réglez manuellement la mise au point de l’appareil photo en tournant la bague de mise au point sur le corps de l’objectif de l’appareil photo, tout en regardant l’écran. Après 60 secondes, appuyez sur le bouton d’enregistrement, sélectionnez le premier bouton du menu de workflow Importer une séquence d’images et recherchez et double-cliquez sur une vidéo. Dans le menu du flux de travail, sélectionnez Définir les informations de séquence"Dans la nouvelle fenêtre de menu, vérifiez le schéma de nommage, ajoutez des notes et validez les métadonnées.
Sélectionnez Ajuster l’image et un nouveau menu contextuel appelé Réglages de l’image s’ouvrira. Ajustez les paramètres de traitement d’image en réglant le lissage de l’arrière-plan sur 10, le lissage gaussien sur cinq, le remplissage des trous sur deux, le filtre petit objet sur zéro et en ignorant la segmentation dérivée intégrale. Ajustez le niveau de seuil de sorte que les animaux soient complètement remplis de vert, mais toujours distincts de l’arrière-plan.
Cliquez ensuite sur Appliquer"Dans le menu du flux de travail, sélectionnez Détecter et suivre"sélectionnez trois à sept vers et cliquez sur le bouton Détecter les vers » dans l’onglet détection. Accédez à l’onglet de suivi. Dans les paramètres de suivi, cochez Utiliser le retour en arrière et décochez la case Suivre les vers sur le bord de l’image.
Définissez l’hypothèse maximale suivie sur cinq. Réglez le mode de suivi sur natation. Accédez à la section paramètres avancés et définissez les cadres que les vers peuvent toucher à la limite sur 50.
Les vers Frames peuvent se chevaucher jusqu’à 500. Tolérance de position à 0,50. Et la tolérance de forme à 0,50.
Enregistrez ces paramètres et déployez-les pour toutes les vidéos d’une expérience en les enregistrant en tant que configuration. Accédez au gestionnaire de configuration dans le menu d’icônes en haut à gauche, puis cliquez sur l’icône Enregistrer. Donnez un nom et une description à cette configuration.
Et cliquez sur OK"Dans le menu du flux de travail, cliquez sur Enregistrer le projet"Suivre les vidéos en accédant au menu du flux de travail et en cliquant sur l’icône Batch ». Cliquez sur le bouton Ajouter sous la section de sélection de fichiers de ce menu de traitement par lots. naviguez jusqu’à tous les fichiers de projet à traiter et sélectionnez-les.
Cliquez ensuite sur Ouvrir"Cliquez sur le bouton Démarrer » et notez l’indicateur de progression vert sur le premier fichier. Autorisez le traitement de tous les fichiers. Lorsque tous les fichiers lus sont terminés, fermez le logiciel.
Sélectionnez Analyser les données"Accédez au résumé de la piste. Et utilisez le bouton Exporter en bas à droite pour exporter des données dans un format lisible par feuille de calcul. Utilisez le nombre de tours et la durée de la piste pour calculer les tours par minute pour chaque piste à l’aide des fonctions de feuille d’étalement.
La dispersion non stimulée de la larve L4 au stade du développement de cinq souches différentes a été mesurée à l’aide du test de locomotion radiale. Et représenté graphiquement en micro mètre par minute parcourue. Les données affichées sous forme de graphiques à barres clarifient les différences relatives entre les souches.
Alors que le déplacement final de chaque ver tracé dans le graphique, permet de mieux visualiser la variation au sein de la population. Les taux de nage en termes de fréquence de battement ou d’ondulation dans le liquide ont été mesurés à l’aide d’une notation et d’une analyse assistées par ordinateur non biaisées. Et représenté graphiquement sous forme de thrashes par minute.
Les données du graphique à barres rendent les différences relatives entre les souches plus faciles à voir. Alors que les données de chaque ver individuel marqué sont tracées dans le graphique, ce qui permet de mieux visualiser la variation au sein de la population. Dans le test de locomotion radiale, la souche légère TDP-43 n’était pas significativement différente de la souche N2 de type sauvage.
Cependant, dans le test de natation, les souches TDP-43 douces et fortes étaient non seulement significativement différentes du type sauvage N2, mais aussi les unes des autres. La souche TDP-43 mutante de la SLA a une altération grave du crawl par locomotion radiale, et elle ne se jette pas dans le liquide. La souche exprimant le tau a de graves déficiences dans la locomotion radiale, mais peut battre dans le test de natation.
L’aspect le plus important à considérer avec ces méthodes est le maintien de contrôles cohérents entre les réplications. Cela garantit que les variations de motilité sont causées par des différences phénotypiques et non par des conditions environnementales. Ces méthodes fournissent une évaluation complète de deux paradigmes majeurs de motilité de C.elegans.
Les méthodes de suivi pourraient inclure une caractérisation comportementale supplémentaire, une analyse biochimique ou une étude de la fonction musculaire ou neuronale.
